СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ АПОПТОЗА И НЕКРОЗА У УСТОЙЧИВЫХ И ВОСПРИИМЧИВЫХ СОРТОВ ГОРОХА К FUSARIUM OXSYSPORUM Российский патент 2011 года по МПК G01N33/02 

Изобретение относится к биотехнологии и сельскому хозяйству, а именно к диагностике запрограммированной клеточной гибели (апоптозу) и некрозу как способу выявления реакции различных по устойчивости сортов гороха на заражение Fusarium oxsysporum для оценки селекционного материала на устойчивость и изучения механизмов иммунитета.

Реакция растения на воздействие биотических и абиотических стресс-факторов выражается по-разному: в виде апоптоза или некроза. С физиологической точки зрения апоптоз или запрограммированная клеточная смерть у растений связана с морфогенезом или окончательной гибелью. Некроз, или сверхчувствительность, связан с гибелью части клеток растений во имя сохранения целого.

Реакция растений на воздействие стресс-факторов различна у растений внутри вида. Диагностика апоптоза и некроза и ускоренная оценка реакции растений на стресс-факторы осуществляется с помощью измерения супероксддисмутазной активности (патент №2293969, кл. G01 №21/00, 2005 г.) [1].

Прототипом может служить биоинформационная модель апоптоза и некроза у растений, заключающаяся в вычислении активности фермента супероксиддисмутазы по оптической плотности окрашенных растворов, содержащих L-метионин, нитросиний тетразолий, рибофлавин, ЭДТА в фосфатном буфере pH 7,8 на спектрофотометре при длине волны 540 нм (Гринблат А.И. Разработка биоинформационной модели апоптоза и некроза у растений, Орел, 2007) [2].

Недостатком известного способа является то, что он не выявляет апоптоза и некроза устойчивых и восприимчивых сортов гороха, инфицированных возбудителем корневых гнилей.

Задачей изобретения является выявление апоптоза и некроза устойчивых и восприимчивых сортов гороха, инфицированных возбудителем корневых гнилей Fusarium oxsysporum, для оценки селекционного материала на устойчивость и изучения механизмов иммунитета.

Поставленная задача решается благодаря тому, что в известном способе выявления апоптоза и некроза, заключающемся в измерении активности фермента супероксиддисмутазы, согласно изобретению активность фермента измеряют на проростках семян гороха, устойчивых и восприимчивых в течение 10 дней проращивания, начиная со 2-го дня, при этом активность фермента замеряют на здоровых семенах гороха, а также на здоровых семенах, инфицированных Fusarium oxsysporum, и здоровых семенах, обработанных индуктором апоптоза, после чего сравнивают показания активности фермента на 10 день, и если наблюдают увеличение активности фермента до 600-800 у.е., то диагностируют некроз семян гороха у устойчивых сортов, до 300-400 у.е. - восприимчивых, а если наблюдают уменьшение активности фермента до 125-200 у.е., то диагностируют апоптоз у устойчивых сортов, до 50-120 у.е. - восприимчивых сортов семян гороха.

Апоптоз выражается в резком снижении активности фермента супероксиддисмутазы.

Некроз выражается в увеличении активности этого фермента.

Испытания проводили на 4-х сортах гороха: устойчивых - сорт Т-206, сорт Din Dalle, и восприимчивых: - сорт Смарагд, сорт 130-04, к Fusarium oxsysporum. Варианты исследований:

- здоровые семена гороха,

- здоровые семена гороха, инфицированные Fusarium oxsysporum,

- здоровые семена гороха, обработанные индуктором апоптоза, выделенным из калеоптиля пшеницы.

Показания активности фермента супероксиддисмутазы измеряли в течение первых 10 дней проращивания начиная со 2-го дня.

Пример 1

На устойчивом сорте гороха Т-206 показана активность фермента супероксиддисмутазы по всем вариантам исследования на протяжении 10 суток прорастания начиная со 2-го дня. У проростков здоровых семян активность фермента повышается со вторых суток - 16,071 у.е., а к 10 суткам до 304,221 у.е. Такое повышение является плавным, что характерно для здоровых семян (табл.1).

В варианте со здоровыми семенами гороха, инфицированными Fusarium oxsysporum, у проростков происходит вначале незначительное повышение активности фермента от 2 суток - 91,666 у.е. до 7 суток - 134,61 у.е. и резкое повышение активности на 10 сутки до 755,715 у.е. (табл.1).

В случае обработки здоровых семян гороха индуктором апоптоза, выделенным из калеоптиля пшеницы, активность супероксиддисмутазы у проростков гороха на 2 день достигает 480,36 у.е., в последующие дни эксперимента снижается - к 4 дню до 295,011 у.е., к 8 дню до 108,576 у.е., а к 10 дню имеет место повышение до 128,175 у.е. (табл.1).

Таблица 1 Активность супероксиддисмутазы (в у.е.) в проростках устойчивого сорта гороха Т-206 Сутки проращивания 2 4 5 7 8 10 Здоровые семена 116,071 115,131 189,601 203,883 256,952 304,221 Здоровые семена, инфицированные Fusarium oxsysporum 91,666 97,861 108,695 134,061 231,110 755,715 Здоровые семена, обработанные индуктором апоптоза 480,36 295,011 289,473 296,25 108,576 128,175

Таким образом, в проростках устойчивого сорта гороха Т-206 при инфицировании семян Fusarium oxsysporum происходит увеличение активности фермента, на основании чего диагностируют некроз.

При обработке семян индуктором апоптоза и снижении активности фермента диагностируют апоптоз.

Пример 2

Активность фермента на устойчивом сорте гороха Din Dalle по всем вариантам опыта повторяет картину активности супероксидисмутазы на устойчивом сорте гороха Т-206.

Активность фермента проростков здоровых семян также повышается со 2 дня по 10 день со 122,663 у.е. до 297,169 у.е., что также характерно для здоровых семян (табл.2).

Проростки семян, инфицированных Fusarium oxsysporum, проявляют следующую активность: повышение со 2 дня к 10 дню от 90,517 у.е. до 221,559 у.е. к 8 дню и до 685,141 у.е. к 10 дню (табл.2).

В проростках семян, обработанных индуктором апоптоза, активность супероксидисмутазы резко снижается с 524,047 у.е. (2 день) до 113,718 у.е. (7 день), затем повышается до 198,006 у.е. (10 день) (табл.2).

Таблица 2 Активность супероксиддисмутазы (в у.е.) в проростках устойчивого сорта гороха Din Dalle Сутки проращивания 2 4 5 7 8 10 Здоровые семена 122,663 130,597 186,075 200,342 219,496 297,169 Здоровые семена, нфицированные Fusarium oxsysporum 90,517 108,695 137,468 194,045 221,559 685,141 Здоровые семена, обработанные индуктором апоптоза 524,047 292,623 240,917 113,718 138,970 198,006

В проростках устойчивого сорта гороха Din Dalle обнаружено повышение активности супероксиддисмутазы у инфицированных семян гороха и снижение активности при индуцировании апоптоза.

Таким образом, на двух устойчивых сортах гороха диагностируют проявление апоптоза при снижении активности фермента, а при повышении ферментативной активности диагностируют некроз.

Пример 3

Проведенные исследования на восприимчивом сорте гороха Смарагд показали, что ферментативная активность у проростков здоровых семян активно повышается от первых суток (102,083 у.е.) к 10 суткам (512,335 у.е.), что характерно для здоровых семян восприимчивого сорта (табл.3).

Активность супероксиддисмутазы проростков семян гороха, инфицированных Fusarium oxsysporum, колеблется в пределах от 86,674 до 326,479 у.е. в процессе прорастания (табл.3).

В проростках семян, обработанных индуктором апоптоза, в процессе прорастания происходит постоянное снижение активности фермента с 737,553 у.е. до 99,431 y.e. (табл.3).

Таблица 3 Активность супероксиддисмутазы (в у.е.) в проростках восприимчивого сорта гороха Смарагд Сутки проращивания 2 4 5 7 8 10 Здоровые семена 102,083 240,882 251,460 429,956 433,684 512,335 Здоровые семена, инфицированные Fusarium oxsysporum 86,674 215,073 256,688 239,783 261,911 326,479 Здоровые семена, обработанные индуктором апоптоза 737,553 464,754 411,952 246,408 242,930 99,431

Выявлено, что активность супероксиддисмутазы в проростках восприимчивого сорта гороха Смарагд у инфицированных семян при некрозе повышается, а при апаптозе снижается.

Пример 4

Подтверждение вышеизложенному ярко показано проведенными испытаниями по всем вариантам опыта также на восприимчивом сорте гороха 130-04. Так, активность фермента незначительно повышается у проростков здоровых семян (124,26-329,861 у.е.), у проростков семян, инфицированных Fusarium oxsysporum,ферментативная активность под воздействием индуктора апоптоза снижается с 681,254 до 115,068 у.е. (табл.4).

Таблица 4 Активность супероксиддисмутазы (в у.е.) в проростках восприимчивого сорта гороха 130-04 Сутки проращивания 2 4 5 7 8 10 Здоровые семена 124,26 126,506 136,072 206,783 290,493 329,861 Здоровые семена, инфицированные Fusarium oxsysporum 99,936 217,644 216,583 299,936 300,860 311,860 Здоровые семена, обработанные индуктором апоптоза 681,254 289,190 289,639 138,157 128,992 115,068

Активность супероксиддисмутазы в проростках восприимчивого сорта гороха 130-04 у инфицированных семян при некрозе также повышается, а при апаптозе снижается (табл.4).

Сравнение результатов, полученных при использовании предлагаемого способа, показывает, что у проростков здоровых семян устойчивых сортов гороха активность супероксиддисмутазы растет и достигает максимума к 10 дню. В результате заражения семян гороха устойчивых сортов Fusarium oxsysporum к 10 дню резко возрастает супероксиддисмутазная активность по сравнению со здоровыми семенами.

У восприимчивых сортов супероксиддисмутазная актвность к 10 дню резко снижается по сравнению со здоровыми растениями.

Обработка семян гороха индукторами апоптоза приводит к стремительному снижению активности фермента начиная с 2 дня прорастания до 10 суток. При этом показатели супероксиддисмутазной активности устойчивых сортов после обработки индукторами апоптоза имеют более низкие величины (480,36-524,047 у.е.) на 2 день прорастания и более высокие (128,175-198,006 у.е.) к 10 дню по сравнению с восприимчивыми сортами, у которых супероксиддисмутазная активность на 2 день прорастания составляет 681,254-737,553 у.е. и на 10 день падает до 99,431-115,068 у.е.

Таким образом, при резком снижении активности фермента супероксиддисмутазы диагностируют апоптоз, а при увеличении активности фермента диагностируют некроз.

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложен способ диагностики апоптоза и некроза для выявления реакции различных по устойчивости сортов гороха на заражение Fusarium oxsysporum. Измеряют активность фермента супероксиддисмутазы на проростках семян гороха, устойчивых и восприимчивых в течение 10 дней проращивания, и если на 10-й день наблюдают увеличение активности фермента фермента до 600-800 у.е, то диагностируют некроз семян гороха у устойчивых сортов, до 300-400 у.е. - диагностируют некроз семян гороха у восприимчивых сортов, а если наблюдают уменьшение активности фермента до 125-200 у.е., то диагностируют апоптоз у устойчивых сортов, и до 50-120 у.е. - диагностируют апоптоз у восприимчивых сортов семян гороха. Способ может быть использован для оценки устойчивости селекционного материала и изучения механизмов иммунитета. 4 табл.

Способ выявления апоптоза и некроза у устойчивых и восприимчивых сортов гороха к Fusarium oxsysporum, заключающийся в измерении активности фермента супероксиддисмутазы, отличающийся, тем что активность фермента измеряют на проростках семян гороха устойчивых и восприимчивых в течении 10 дней проращивания начиная, со 2-го дня, при этом активность фермента измеряют на здоровых семенах гороха, а также на здоровых семенах, инфицированных Fusarium oxsysporum и здоровых семенах, обработанных индуктором апоптоза, после чего сравнивают показания активности фермента на 10-й день и если наблюдают увеличение активности фермента до 600-800 у.е., то диагностируют некроз семян гороха у устойчивых сортов, до 300-400 у.е. - у восприимчивых, а если наблюдают уменьшение активности фермента до 125-200 у.е., то диагностируют апоптоз у устойчивых сортов и до 50-120 у.е. -диагностируют апоптоз у восприимчивых сортов семян гороха.