ГЕПАТОПРОТЕКТОРНОЕ СРЕДСТВО, ОБЛАДАЮЩЕЕ АНТИОКСИДАНТНЫМ ДЕЙСТВИЕМ, И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ Российский патент 2011 года по МПК A61K36/28 A61P39/06 A61P1/16 

Изобретение относится к фармацевтической промышленности и касается способов получения из растительного сырья гепатопротекторного, обладающего антиоксидантным действием.

Среди многообразия препаратов, применяемых в комплексной терапии заболеваний печени и желчевыводящих путей, выделяют сравнительно небольшую группу лекарств, оказывающих избирательное действие на печень - гепатопротекторов. В качестве гепатопротекторов в нашей стране используются 3-4 препарата, большинство из которых являются импортными, что в некоторой степени ограничивает их доступность для клинического применения. Все это делает необходимым поиск новых отечественных эффективных гепатозащитных средств, в частности, растительного происхождения.

Наиболее близким к предлагаемому является способ получения лекарственных средств (карсил, силибор), обладающих гепатопротекторным действием, заключающийся в экстракции плодов расторопши пятнистой 80% этанолом методом реперколяции с последующим упариванием, обработкой 50% этанолом, обезжириванием тетрахлорметаном и обработкой хлороформ-этанольной смесью с последующим высушиванием [1].

Известный способ имеет ряд существенных недостатков: во-первых, экстракция 80% этанолом проводится при повышенной температуре, во-вторых, применяются токсические растворители (хлороформ и тетрахлорметан), в-третьих, дефицит сырья в Российской Федерации, малая биомасса плодов и использование интродуцируемого сырья. Таким образом, получение экстракта из плодов расторопши пятнистой - сложный и длительный процесс с технологической точки зрения. Кроме того, терапевтическая эффективность прототипа недостаточна высока и несколько уступает заявляемому средству по силе выраженности гепатопротекторных и антиоксидантных свойств.

Новая техническая задача - расширение арсенала гепатопротекторных средств с антиоксидантным действием, получаемых из растительного сырья, обладающих более высокой активностью и меньшей токсичностью, а также способов их получения.

Поставленную задачу решают применением в качестве гепатопротекторного средства, обладающего антиоксидатным действием, экстракта на 70% этаноле из надземной части василька шероховатого (Centaurea scabiosa (L.) сем. Asteraceae). Способ его получения заключается в экстракции надземной части 70% этанолом при степени измельчения сырья 2-4 мм, при температуре 75-80°С в течение 1-1,5 часов, при соотношении сырье-экстрагент 1:15-1:20 и кратности экстракции 3 с последующим удалением экстрагента до получения сухого экстракта.

Отличительные признаки проявили в заявляемой совокупности новые свойства - впервые установлено, что в качестве гепатопротекторного средства, обладающего антиоксидантным действием, используют экстракт на 70% этаноле, причем его получение заключается в экстракции растительного сырья, причем экстракции подвергают надземную часть василька шероховатого, измельченную до размеров частиц 2-4 мм, 70% этанолом при температуре 75-80°С в течение 1-1,5 часов, при соотношении сырье-экстрагент 1:15-1:20 и кратности экстракции 3 с последующим упариванием досуха полученного экстракта, что способствует повышению гепатопротекторной и антиоксидантной активности целевого продукта.

Способ осуществляют следующим образов.

Измельченные воздушно-сухие листья, цветки и стебли василька шероховатого, собранного в фазу цветения, заливают 70% этанолом и экстрагируют при температуре 75-80°С в течение 1-1,5 часов при соотношении сырье-экстрагент 1:15-1:20, затем охлаждают до комнатной температуры, отделяют полученный экстракт от сырья путем процеживания. Отделенный экстракт очищают от механических включений путем фильтрования. Шрот василька шероховатого после первой экстракции заливают 70% этанолом и экстрагируют при температуре 75-80°С в течение 1-1,5 часов при соотношении сырье-экстрагент 1:15-1:20, затем охлаждают до комнатной температуры, отделяют полученный экстракт от сырья путем процеживания. Отделенный экстракт очищают от механических включений путем фильтрования. Далее шрот после второй экстракции заливают 70% этанолом и экстрагируют при температуре 75-80°С в течение 1-1,5 часов при соотношении сырье-экстрагент 1:15-1:20, затем охлаждают до комнатной температуры, отделяют полученный экстракт от сырья путем процеживания. Отделенный экстракт очищают от механических включений путем фильтрования. Полученные экстракты объединяют, растворитель удаляют под вакуумом и остаток высушивают.

Сухой экстракт представляет собой порошок коричневого цвета со своеобразным запахом. Основными биологически активными веществами, проявляющими гепатопротекторные и антиоксидантные свойства в экстрактах василька шероховатого, являются флавоноиды (ФЛ) и фенолкарбоновые кислоты (ФКК). Определение количественного содержания ФЛ проводили спектрофотометрическим методом с использованием ГСО рутина на основе комплексообразующей реакции с алюминия хлоридом [7]. Количественное содержание ФКК определяли экстракционной спектрофотометрией, основанной на избирательной экстракции ФКК этилацетатом из водного извлечения при определенном значении рН [6].

Количественное содержание ФЛ в сухом экстракте составляет 2,85% и ФКК - 1,60%.

Фармакологические испытания

Гепатопротекторная и антиоксидантная активность сухого экстракта василька шероховатого, полученного экстракцией 70% этанолом, исследована in vivo на модели острого токсического поражения печени [2, 3]. Опыты проводили на белых беспородных крысах-самцах массой 180-220 г. Острый гепатит вызывали введением внутрижелудочно 50% масляного раствора тетрахлорметана в дозе 1 мл/кг массы животного в течение четырех дней. Сухой экстракт василька шероховатого в виде крахмальной взвеси вводили животным внутрижелудочно в дозах 100, 200 и 400 мг/кг массы 1 раз в день в течение шести дней. В качестве препарата сравнения использовали растительный лекарственный препарат карсил, который вводили в дозе 100 мг/кг [2].

Гепатозащитное действие исследуемого экстракта оценивали по его влиянию на биохимические показатели печени и сыворотки крови: активность аланинаминотрансферазы (АЛТ), аспартатаминотрансферазы (ACT), содержание билирубина (общий и конъюгированный), тимоловой пробы и щелочной фосфатазы (ЩФ) [4].

При повреждении биологических структур важная роль отводится липидам, фосфолипидам, а также процессам перекисного окисления липидов (ПОЛ), инициация которых приводит к существенным преобразованиям мембранных структур клетки, что лежит в основе патогенеза многих заболеваний (в частности, повреждение клеток печени) [3, 5].

Исходя из этого, изучение влияния экстракта василька шероховатого на процессы ПОЛ оценивали по содержанию в гомогенате печени и сыворотке крови уровня диеновых конъюгатов (ДК) и малонового диальдегида (МДА), а также активности каталазы в эритроцитах и антирадикальной активности (АРА) липидорастворимых антиоксидантов клеточных мембран гепатоцитов.

О метаболизме липидов судили по общему содержанию в сыворотке крови и печени общих липидов (ОЛ) и фосфолипидов (ОФЛ).

Статистическую обработку полученных результатов проводили, используя пакет программ StatSoft Statistica v6.0 с определением средней арифметической (M) и ее ошибки (m), а также с использованием непараметрического критерия Вилкоксона.

Как показали биохимические исследования, у животных, получавших тетрахлорметан в течение четырех дней, отмечается явление цитолиза, при этом активность ферметов АЛТ и ACT возросла в 2 и 1,7 раза соответственно, в 1,9 раза -концентрация общего билирубина и в 4,5 раза - конъюгированного, ЩФ - 1,43 раза. Отмечалась интенсификация процессов ПОЛ за счет увеличения содержания диеновых конъюгатов в 1.5 и 2.3 раза и уровня малонового диальдегида в 1,2 и 1.3 раза в ткани печени и сыворотке крови соответственно, обусловленная снижением антиоксидантной активности липидорастворимых антиоксидантов клеточных мембран на 66% и активности каталазы на 45% по сравнению с интактной группой животных.

При терапии экстрактом из надземной части василька шероховатого в дозах 100 и 200 мг/кг массы животного, аналогично введению препарата карсил в течение шести дней, наблюдается регрессия основных биохимических показателей в сыворотке крови у крыс с гепатитом, и выявлена нормализация антиоксидантной активности в ткани печени, что, в свою очередь, способствует снижению уровня диеновых конъюгатов и малонового диальдегида (табл.2, 3).

Примеры конкретного выполнения способа получения экстракта из надземной части василька шероховатого

Сырье собрано в фазу цветения в окрестностях г.Кемерово и использовано во всех экспериментах.

Пример 1.

100,0 г сырья, измельченного до размера частиц 2-4 мм, состоящего из листьев, стеблей и цветков василька шероховатого, заливают 2 л 70% этанола и нагревают при температуре 80°С в течение 1 часа, затем охлаждают до комнатной температуры, отделяют полученный экстракт от сырья путем процеживания. Отделенный экстракт очищают от механических включений путем фильтрования. Далее экстракцию обработанного сырья повторяют дважды аналогично экстракции, описанной выше. Полученные экстракты объединяют и растворитель удаляют под вакуумом.

Содержание ФЛ составляет 2,85% и ФКК - 1,60%.

Полученный экстракт на 70% этаноле в виде суспензии на 1% крахмальной слизи вводили в течение шести дней в дозах 100, 200, 400 мг/кг массы крысы с токсическим поражением печени тетрахлорметаном внутрижелудочно, при этом экстракт в дозах 100 и 200 мг/кг показал наибольшую активность (табл.1, 2). По результатам биохимических исследований содержание АЛАТ сыворотки крови исследуемых животных при применении экстракта на 70% этаноле в дозах 100 и 200 мг/кг на фоне токсического поражения печени составило - 10,39 и 11,37 Е/л, АСАТ - 12,68 и 11,38 Е/л, содержание билирубина общего - 40,07 и 35,5 мкмоль/л, ЩФ - 134,17 и 116,76 мкмоль/(мин·л), ДК в гомогенате печени 85,0 и 85,75 у.е./г, малонового диальдегида - 8,91 и 19,52 мкмоль/г, каталазы - 153,76 и 153,76 мкмоль/л·с, АРА - 22,68 и 22,9% соответственно (таблица 1,2). Данные липидного обмена у крыс при терапии экстрактом василька шероховатого в дозах 100 и 200 мг/кг составили следующие величины: содержание ОЛ в сыворотке крови и печени - 43,48 и 32,88 мг/г и 3,38 и 2,93 г/л соответственно, а содержание ОФЛ - 12,61 и 11,15 мг/г и 0,29 и 0,44 г/л соответственно (таблица 3). При сравнении с карсилом экстракт василька шероховатого при CCI₄-гепатите у крыс:

1. более эффективно уменьшает содержание в сыворотке крови АЛТ, ACT и ЩФ, тимоловую пробу, повышает активность каталазы и общую антирадикальную активность, в гомогенате печени и сыворотке крови препятствует продукции МДА;

2. в равной степени уменьшает в сыворотке крови содержание ДК, МДА, ОФЛ, а в гомогенате печени - ДК, ОФЛ, ОЛ.

Пример 2.

10,0 г сырья, измельченного до размеров частиц 1-2 мм, состоящего из листьев, стеблей и цветков василька шероховатого, заливают 200 мл 70% этанола и нагревают при температуре 80°С в течение 1 часа, затем охлаждают до комнатной температуры, отделяют полученный экстракт от сырья путем процеживания. Отделенный экстракт очищают от механических включений путем фильтрования.

Далее экстракцию обработанного сырья повторяют еще дважды аналогично экстракции, описанной выше. Полученные экстракты объединяют и растворитель удаляют под вакуумом.

Содержание ФЛ составляет 2,10% и ФКК- 1,30%.

Пример 3.

10,0 г сырья, измельченного до размеров частиц 4-6 мм, состоящего из листьев, стеблей и цветков василька шероховатого, заливаю 200 мл 70% этанола и нагревают при температуре 80°С в течение 1 часа, затем охлаждают до комнатной температуры, отделяют полученный экстракт от сырья путем процеживания. Отделенный экстракт очищают от механических включений путем фильтрования.

Далее экстракцию обработанного сырья повторяют еще дважды аналогично экстракции, описанной выше. Полученные экстракты объединяют и растворитель удаляют под вакуумом.

Содержание ФЛ составляет 2,50% и ФКК - 1,40%.

Пример 4.

10,0 г сырья, измельченного до размеров частиц 6-8 мм, состоящего из листьев, стеблей и цветков василька шероховатого, заливают 200 мл 70% этанола и нагревают при температуре 80°С в течение 1 часа, затем охлаждают до комнатной температуры, отделяют полученный экстракт от сырья путем процеживания. Отделенный экстракт очищают от механических включений путем фильтрования.

Далее экстракцию обработанного сырья повторяют еще дважды аналогично экстракции, описанной выше. Полученные экстракты объединяют и растворитель удаляют под вакуумом.

Содержание ФЛ составляет 2,30% и ФКК - 1,20%.

Пример 5.

10,0 г сырья, измельченного до размеров частиц 2-4 мм, состоящего из листьев, стеблей и цветков василька шероховатого, заливают 200 мл 70% этанолом и нагреваю при температуре 20°С в течение 1 часа, затем охлаждают до комнатной температуры, отделяют полученный экстракт от сырья путем процеживания. Отделенный экстракт очищают от механических включений путем фильтрования.

Далее экстракцию обработанного сырья повторяют еще дважды аналогично экстракции, описанной выше. Полученные экстракты объединяют и растворитель удаляют под вакуумом.

Содержание ФЛ составляет 0,50% и ФКК - 0,50%.

Пример 6.

10,0 г сырья, измельченного до размеров частиц 2-4 мм, состоящего из листьев, стеблей и цветков василька шероховатого, заливают 200 мл 70% этанола и нагревают при температуре 40°С в течение 1 часа, затем охлаждают до комнатной температуры, отделяют полученный экстракт от сырья путем процеживания. Отделенный экстракт очищают от механических включений путем фильтрования.

Далее экстракцию обработанного сырья повторяют еще дважды аналогично экстракции, описанной выше. Полученные экстракты объединяют и растворитель удаляют под вакуумом.

Содержание ФЛ составляет 1,45% и ФКК - 0,91%.

Пример 7.

10,0 г сырья, измельченного до размеров частиц 2-4 мм, состоящего из листьев, стеблей и цветков василька шероховатого, заливают 200 мл 70% этанола и нагревают при температуре 60°С в течение 1 часа, затем охлаждают до комнатной температуры, отделяют полученный экстракт от сырья путем процеживания. Отделенный экстракт очищают от механических включений путем фильтрования.

Далее экстракцию обработанного сырья повторяют еще дважды аналогично экстракции, описанной выше. Полученные экстракты объединяют и растворитель удаляют под вакуумом.

Содержание ФЛ составляет 2,10% и ФКК - 1,20%.

Пример 8.

10,0 г сырья, измельченного до размеров частиц 2-4 мм, состоящего из листьев, стеблей и цветков василька шероховатого, заливают 200 мл 70% этанола и нагревают при температуре 70°С в течение 1 часа, затем охлаждают до комнатной температуры, отделяют полученный экстракт от сырья путем процеживания. Отделенный экстракт очищают от механических включений путем фильтрования.

Далее экстракцию обработанного сырья повторяют еще дважды аналогично экстракции, описанной выше. Полученные экстракты объединяют и растворитель удаляют под вакуумом.

Содержание ФЛ составляет 2,63% и ФКК - 1,51%.

Пример 9.

10,0 г сырья, измельченного до размеров частиц 2-4 мм, состоящего из листьев, стеблей и цветков василька шероховатого, заливают 200 мл 70% этанола и нагревают при температуре 75°С в течение 1 часа, затем охлаждают до комнатной температуры, отделяют полученный экстракт от сырья путем процеживания. Отделенный экстракт очищают от механических включений путем фильтрования.

Далее экстракцию обработанного сырья повторяют еще дважды аналогично экстракции, описанной выше. Полученные экстракты объединяют и растворитель удаляют под вакуумом.

Содержание ФЛ составляет 2,80% и ФКК - 1,62%.

Пример 10.

10,0 г сырья, измельченного до размеров частиц 2-4 мм, состоящего из листьев, стеблей и цветков василька шероховатого, заливают 200 мл 70% этанола и нагревают при температуре 85°С в течение 1 часа, затем охлаждают до комнатной температуры, отделяют полученный экстракт от сырья путем процеживания. Отделенный экстракт очищают от механических включений путем фильтрования.

Далее экстракцию обработанного сырья повторяют еще дважды аналогично экстракции, описанной выше. Полученные экстракты объединяют и растворитель удаляют под вакуумом.

Содержание ФЛ составляет 2,90% и ФКК - 1,58%.

Пример 11.

10,0 г сырья, измельченного до размеров частиц 2-4 мм, состоящего из листьев, стеблей и цветков василька шероховатого, заливают 200 мл 70% этанола и нагревают при температуре 80°С в течение 30 мин, затем охлаждают до комнатной температуры, отделяют полученный экстракт от сырья путем процеживания Отделенный экстракт очищают от механических включений путем фильтрования.

Далее экстракцию обработанного сырья повторяют еще дважды аналогично экстракции, описанной выше. Полученные экстракты объединяют и растворитель удаляют под вакуумом.

Содержание ФЛ составляет 1,20% и ФКК - 0,70%.

Пример 12.

10,0 г сырья, измельченного до размеров частиц 2-4 мм, состоящего из листьев, стеблей и цветков василька шероховатого, заливают 200 мл 70% этанола и нагревают при температуре 80°С в течение 45 мин, затем охлаждаю до комнатной температуры, отделяют полученный экстракт от сырья путем процеживания. Отделенный экстракт очищают от механических включений путем фильтрования.

Далее экстракцию обработанного сырья повторяют еще дважды аналогично экстракции, описанной выше. Полученные экстракты объединяют и растворитель удаляют под вакуумом.

Содержание ФЛ составляет 2.15% и ФКК - 1,30%.

Пример 13.

10,0 г сырья, измельченного до размеров частиц 2-4 мм, состоящего из листьев, стеблей и цветков василька шероховатого, заливают 200 мл 70% этанола и нагревают при температуре 80°С в течение 1,5 часов, затем охлаждают до комнатной температуры, отделяют полученный экстракт от сырья путем процеживания. Отделенный экстракт очищают от механических включений путем фильтрования.

Далее экстракцию обработанного сырья повторяют еще дважды аналогично экстракции, описанной выше. Полученные экстракты объединяют и растворитель удаляют под вакуумом.

Содержание ФЛ составляет 2,90% и ФКК - 1,65%.

Пример 14.

10,0 г сырья, измельченного до размеров частиц 2-4 мм, состоящего из листьев, стеблей и цветков василька шероховатого, заливают 100 мл 70% этанола и нагревают при температуре 80°С в течение 1 часа, затем охлаждают до комнатной температуры, отделяют полученный экстракт от сырья путем процеживания. Отделенный экстракт очищают от механических включений путем фильтрования.

Далее экстракцию обработанного сырья повторяют еще дважды аналогично экстракции, описанной выше. Полученные экстракты объединяют и растворитель удаляют под вакуумом.

Содержание ФЛ составляет 2,55% и ФКК - 1,45%.

Пример 15.

10,0 г сырья, измельченного до размеров частиц 2-4 мм, состоящего из листьев, стеблей и цветков василька шероховатого, заливают 150 мл 70% этанола и нагревают при температуре 80°С в течение 1 часа, затем охлаждают до комнатной температуры, отделяют полученный экстракт от сырья путем процеживания. Отделенный экстракт очищают от механических включений путем фильтрования.

Далее экстракцию обработанного сырья повторяют еще дважды аналогично экстракции, описанной выше. Полученные экстракты объединяют и растворитель удаляют под вакуумом.

Содержание ФЛ составляет 2,70% и ФКК - 1,50%.

Пример 16.

10,0 г измельченного сырья до размеров частиц 2-4 мм, состоящего из листьев, стеблей и цветков василька шероховатого, заливают 250 мл 70% этанола и нагревают при температуре 80°С в течение 1 часа, затем охлаждают до комнатной температуры, отделяют полученный экстракт от сырья путем процеживания Отделенный экстракт очищают от механических включений путем фильтрования.

Далее экстракцию обработанного сырья повторяют еще дважды аналогично экстракции, описанной выше. Полученные экстракты объединяют и растворитель удаляют под вакуумом.

Содержание ФЛ составляет 2,95% и ФКК - 1,65%.

Пример 17.

10,0 г сырья, измельченного до размеров частиц 2-4 мм, состоящего из листьев, стеблей и цветков василька шероховатого, заливают 300 мл 70% этанола и нагревают при температуре 80°С в течение 1 часа, затем охлаждают до комнатной температуры, отделяют полученный экстракт от сырья путем процеживания. Отделенный экстракт очищают от механических включений путем фильтрования.

Далее экстракцию обработанного сырья повторяют еще дважды аналогично экстракции, описанной выше. Полученные экстракты объединяют и растворитель удаляют под вакуумом.

Содержание ФЛ составляет 2,95% и ФКК - 1,66%.

Пример 18.

10,0 г сырья, измельченного до размеров частиц 2-4 мм, состоящего из листьев, стеблей и цветков василька шероховатого, заливают 200 мл 70% этанола и нагревают при температуре 80°С в течение 1 часа, затем охлаждают до комнатной температуры, отделяют полученный экстракт от сырья путем процеживания. Отделенный экстракт очищают от механических включений путем фильтрования и растворитель удаляют под вакуумом.

Содержание ФЛ составляет 1,95% и ФКК - 0,94%.

Пример 19.

10,0 г сырья, измельченного до размеров частиц 2-4 мм, состоящего из листьев, стеблей и цветков василька шероховатого, заливают 200 мл 70% этанола и нагревают при температуре 80°С в течение 1 часа, затем охлаждают до комнатной температуры, отделяют полученный экстракт от сырья путем процеживания. Oтдeлeнный экстракт очищают от механических включений путем фильтрования.

Далее экстракцию обработанного сырья повторяют еще раз аналогично экстракции, описанной выше. Полученные экстракты объединяют и растворитель удаляют под вакуумом.

Содержание ФЛ составляет 2,52% и ФКК - 1,44%.

Пример 20.

10,0 г сырья, измельченного до размеров частиц 2-4 мм, состоящего из листьев, стеблей и цветков василька шероховатого, заливают 200 мл 70% этанола и нагревают при температуре 80°С в течение 1 часа, затем охлаждают до комнатной температуры, отделяют полученный экстракт от сырья путем процеживания. Отделенный экстракт очищают от механических включений путем фильтрования.

Далее экстракцию обработанного сырья повторяют еще трижды аналогично экстракции, описанной выше. Полученные экстракты объединяют и растворитель удаляют под вакуумом.

Содержание ФЛ составляет 2,90% и ФКК - 1,65%.

ОБОСНОВАНИЕ РЕЖИМА

В процессе поиска оптимальных условий получения экстракта из растительного сырья, состоящего из измельченных листьев, цветков и стеблей василька шероховатого, было изучено влияние на гепатопротекторную и антиоксидантную активности и содержание флавоноидов и фенолкарбоновых кислот следующих факторов: степени измельчения сырья, соотношения сырье-экстрагент, температуры экстракции, времени экстракции и кратности экстракции.

Исследования антиоксидантной активности водного, 40%, 70% и 96% этанольных экстрактов из надземной части василька шероховатого вольтамперометрическим методом in vitro показали, что все экстракты василька шероховатого в той или иной степени обладают антиоксидантными свойствами, которые наиболее ярко выражены у экстракта полученного на 70% этаноле (табл.2). Исходя из указанных данных, в качестве экстрагента был использован 70% этанол.

При этом установлено, что экстракцию следует вести 70% этанолом при соотношении сырье-экстрагент 1:15-1:20, степени измельчения сырья 2-4 мм, температуре 75-80°С в течение 1,0-1,5 часов и кратности экстракции 3 с последующим удалением экстрагента под вакуумом до получения сухого экстракта.

При соотношении сырье-экстрагент 1:10 наблюдается низкое содержание ФЛ и ФКК в извлечении, и экстракцию в этих условиях вести нецелесообразно. При соотношениях 1:15, 1:20 и 1:25 выход целевого продукта заметно увеличивается. Дальнейшее увеличение соотношения (1:30) не приводит к значительному возрастанию выхода ФЛ и ФКК (таблица 8), поэтому рекомендуем вести экстракцию при соотношении сырье-экстрагент 1:15-1:20.

При увеличении температуры экстракции до 75-80°С выходы ФЛ и ФКК значительно увеличиваются (на 1-1,5%) по сравнению с выходами при температуре экстракции 20-70°С. При нагревании до 85°С выходы ФЛ и ФКК практически не изменяются, поэтому рекомендуем вести экстракцию при температуре не выше 75-80°С (таблица 6).

При экстракции надземной части василька шероховатого в течение 30 минут выход ФЛ и ФКК существенно уменьшается (на 40%) по сравнению с продолжительностью экстракции в течение 1 часа, поэтому рекомендуем вести экстракцию в течение 1,0-1,5 часов. Экстракция в течение 2 часов не приводит к увеличению выхода ФЛ и ФКК (таблица 7).

При проведении однократной экстракции выход ФЛ и ФКК значительно уменьшается. При проведении 3- и 4-кратной экстракции выход ФЛ и ФКК увеличивается (таблица 9), но применение четырехкратной экстракции нерационально с точки зрения затрат времени для получения целевого продукта и большего объема получаемого жидкого экстракта, требующего значительных затрат энергии на его упаривание. Поэтому рекомендуем проводить 3-кратную экстракцию.

Экстракты, полученные из надземной части василька шероховатого на 70% этаноле в дозах 100 и 200 мг/кг, обладают гепатопротекторными и антиоксидантными свойствами и способствует нормализации свободнорадикального окисления липидов. Экстракты василька шероховатого в указанных дозах статистически достоверно уменьшают активность в сыворотке крови АЛТ, ACT, а также содержание общего и конъюгированного билирубина (таблица 2). Указанные эффекты получены за счет повышения общей антиоксидантной активности, увеличения активности каталазы, уменьшения продуктов перекисного окисления липидов (диеновых конъюгатов и малонового диальдегида) у крыс с токсическим поражением печени тетрахлорметаном (таблица 3). Терапия экстрактов василька шероховатого сопровождалась регрессом биохимических показателей.

Положительное влияние экстракт василька шероховатого оказывает также на липидный обмен. Экстракты во всех дозах восстанавливают уровень ОЛ и ОФЛ в сыворотке крови и ткани печени (таблица 4).

Приложение

Таблица 1 - Антирадикальная активность экстрактов василька шероховатого

Таблица 2 - Влияние экстракта василька шероховатого (ВШ) на 70% этаноле на биохимические показатели в сыворотке крови при токсическом поражении печени крыс тетрахлорметаном (M±m)

Примечание:

1 - р≤0,05 достоверные различия по отношению к контротю 1;

2 - р≤0,05 достоверные различия по отношению к контролю 2,

3 - р≤0,05 достоверные различия по отношению к гепатиту 1;

4 - р≤0,05 достоверные различия по отношению к гепатиту 2.

Таблица 3 - Влияние экстракта василька шероховатого (ВШ) на 70% этаноле на процессы ПОЛ в сыворотке крови и печени при токсическом поражении печени крыс тетрахлорметаном (M±m)

Примечание:

1 - р≤0,05 достоверные различия по отношению к контролю 1;

2 - р≤0,05 достоверные различия по отношению к контролю 2;

3 - р≤0,05 достоверные различия по отношению к гепатиту 1;

4 - р≤0,05 достоверные различия по отношению к гепатиту 2.

Таблица 4 - Влияние экстракта василька шероховатого (ВШ) на 70% этаноле на процессы ПОЛ в сыворотке крови и печени при токсическое поражении печени крыс тетрахлорметаном (M±m)

Примечание:

1 - р≤0,05 достоверные различия по отношению к контролю 1;

2 - р≤0,05 достоверные различия по отношению к контролю 2;

3 - р≤0,05 достоверные различия по отношению к гепатиту 1 и гепатиту 2;

4 - р≤0,05 достоверные различия по отношению к гепатиту 2.

Таблица 5 - Влияние степени измельчения сырья на содержание ФЛ и ФКК в экстракте (в пересчете на воздушно-сухое сырье)

Примечание: температура экстракции - 80°С; время экстракции - 1 час; кратность экстракции - 3; соотношение сырье-экстагент - 1:20.

Таблица 6 - Влияние температуры на содержание ФЛ и ФКК в экстракте (в пересчете на воздушно-сухое сырье)

Примечание: степень измельчения сырья - 2-4 мм; время экстракции - 1 час; кратность экстракции - 3; соотношение сырье-экстагент -1:20.

Таблица 7 - Влияние времени экстракции на содержание ФЛ и ФКК в экстракте (в пересчете на воздушно-сухое сырье)

Примечание: степень измельчения сырья - 2-4 мм; температура экстракции - 80°С; кратность экстракции - 3; соотношение сырье-экстагент - 1:20.

Таблица 8 - Влияние соотношения сырье-экстрагент на содержание ФЛ и ФКК в экстракте (в пересчете на воздушно-сухое сырье)

Примечание: степень измельчения сырья - 2-4 мм; температура экстракции - 80°C; время экстракции - 1 час; кратность экстракции - 3.

Таблица 9 - Влияние кратности экстракции на содержание ФЛ и ФКК в экстракте (в перерасчете на воздушно-сухое сырье)

Примечание: температура экстракции - 80°С; время экстракции - 1 час; кратность экстракции - 3; соотношение сырье-экстрагент - 1:20.

Таблица 1 Время реакции, мин Водного экстракта Экстракта на 40% этаноле Экстракта на 70% этаноле Экстракта на 95% этаноле Дигидрокверце-
тина 5 69,53±3,27 67,8±1,86 58,55±0,50 76,01±2,20 9,15±7,25 15 67,68±1,91 63,41±1,65 23,40±1,12 72,07±2,70 6,86±5,05 25 65,47±0,89 60,84±1,21 18,47±0,57 69,70±3,53 4,41±1,70 35 63,87±0,74 59,15±1,25 14,53±0,32 67,80±3,45 - 45 62,96±0,87 57,54±1,30 10,82±0,88 66,45±3,80 - 55 61,59±1,36 56,19±1,23 7,89±0,54 63,99±4,99 - 60 60,78±2,42 55,62±1,43 6,53±0,88 62,98±4,37 -

Таблица 2 Эксперименталь-
ные группы (n=6-10) Изучаемые показатели АЛТ ACT Билирубин, мкмоль/л ЩФ, мкмоль/(мин·л) Тимоловая проба, SH/ед Е/л общий конъюг. Контроль 1 (вода очищ.) 10,27±1,35 9,25±1,43 39,88±9,36 4,05±3,47 136,13±25,01 3,27±1,07 Контроль 2 (раст.масло+крах. слизь) 10,01±1,42 11,96±0,36 32,65±8,37 7,54±1,28 116,58±41,84 3,25±2,02 Гепатит 1 (ССI₄ вводили 4 дн.) 22,08±1,40¹ 15,49±0,78¹ 77,33±16,74¹ 18,31±5,16¹ 194,93±58,08¹ 13,27±6,13¹ Гепатит 2(ССI₄ вводили 4 дн. + крах. слизь 6 дн. введения) 13,75±3,56² 13,49±1,95² 50,75±0,01² 14,02±7,38² 117,50±38,57² 3,25±2,02² Карсил, 100 мг/кг 12,09±1,02³ 13,05±0,63³ 26,10±3,97^3,4 2,93±0,33^3,4 155,5±13,28^3,4 3,50±0,58³ 100 мг/кг экстракта ВШ 10.39±0,82³ 12,68±0,51^3,4 40,07±5,40^3,4 3,31±1,10^3,4 134,17±18,76³ 2,24±0,53^3,4 200 мг/кг экстракта ВШ 11,37±0,98³ 11,38±1,99^3,4 35,54±10,35^3,4 2,90±0,48^3,4 116,76±36,50³ 0,96±0,39^3,4 400 мг/кг экстракта ВШ 10,98±1,53³ 10,64±2,65^3,4 38,67±9,65^3,4 7,70±4,35^3,4 92,5±24,19^3,4 4,07±1,58³

Таблица 3 Экспериментальные группы (n=6-10) Изучаемые показатели МДА ДК Каталаза, мкмоль/сек-мл АОА, Радикалсвяз. акт-ть, % Печень, мкмоль/г Сыворотка, мкмоль/мл Печень, у.е./г Сыворотка,у.е./мл Контроль 1 (вода очищ.) 16,6±9,80 0,89±0,40 89,54±4,63 7,82±0,47 154,84±31,16 12,03±3,09 Контроль 2 (раст. масло + крах. слизь) 15,92±3,19 1,47±0,55 84,08±1,85 8,32±0,39 161,9±11,90 14,72±1,27 Гепатит 1 (ССI₄) 24,76±5,87¹ 2,05±0,79¹ 108,75±3,23¹ 9,80±0,41¹ 84,59±6,27¹ 4,1±0,99¹ Гепатит 2 (CCI₄ + крах. слизь) 24,69±10,13² 2,80±0,88² 94,42±3,55² 8,38±0,57² 139,3±5,67² 10,83±2,65² Карсил, 100 мг/кг 28,08±7,35 1,27±0,13^3,4 85,43±3,75^3,4 8,02±0,87³ 145,93±30,01³ 15,43±0,90^3,4 100 мг/кг экстракта ВШ 8,1±2,66^3,4 0,86±0,31^3,4 85,75±1,36^3,4 8,63±0,38³ 153,76±12,00^3,4 22,68±8,77^3,4 200 мг/кг экстракта ВШ 19,59±8,06^3,4 1,59±0,58^3,4 85,00±1,36^3,4 8,44±0,31³ 153,76±12,00^3,4 22,90±6,00^3,4 400 мг/кг экстракта ВШ 22,91±2,70 2,41±0,39 107,25±6,59 9,65±0,50 145,95±22,02³ 22,47±5,18^3,4

Таблица 4 Экспериментальные группы (n=6-10) Изучаемые показатели ОБЩИЕ ЛИПИДЫ, ФОСФОЛИПИДЫ Печень, мг/г Сыворотка, г/л Печень, мг/г Сыворотка, г/л Контроль 1 (вода очиш.) 34,96±6,14 2,93±0,77 11,89±1,35 0,39±0,16 Контроль 2 (раст. масло+крах. слизь) 30,87±12,97 3,26±0,77 11,74±0,72 0,41±0,08 Гепатит 1 (CCl₄) 67,16±10,69¹ 4,00±0,10¹ 23,97±3,54¹ 1,01±0,03¹ Гепатит 2 (CCl₄ + крах. слизь) 48,06±2,33² 3,60±0,22² 18,67±5,23² 0,80±0,26² Карсил, 100 мг/кг 36,58±1,56^3,4 2,38±0,41^3,4 12,22±1,17^3,4 0,59±0,25^3,4 100 мг/кг экстракта ВШ 43,48±3,10³ 3,38±0,55³ 12,61±0,88^3,4 0,29±0,05^3,4 200 мг/кг экстракта ВШ 32,88±2,60^3,4 2,93±0,21^3,4 11,15±1,78^3,4 0,44±0,08^3,4 400 мг/кг экстракта ВШ 43,63±3,07 3,48±0,22³ 11,86±0,84^3,4 0,31±0,03^3,4

Таблица 5 № п/п Степень измельчения сырья, мм Содержание, % ФЛ, в пересчете на рутин ФКК, в пересчете на кофейную кислоту 1 1-2 2,10 1,30 2. 2-4 2.85 1,60 3. 4-6 2.50 1,40 4. 6-8 2,30 1,20

Таблица 6 № п/п Температура, °С Содержание, % ФЛ, в пересчете на рутин ФКК, в пересчете на кофейную кислоту 1. 20 0,50 0,50 2. 40 1,65 0,91 3. 60 2,10 1,20 4. 70 2,63 1,51 5. 75 2,80 1,62 6. 80 2,85 1,60 7. 85 2,90 1,58

Таблица 7 № п/п Время экстракции, мин Содержание, % ФЛ, в пересчете на рутин ФКК, в пересчете на кофейную кислоту 1. 30 1,20 0,70 2. 45 2,15 1,30 3. 60 2,85 1,60 4. 90 2,90 1,65

Таблица 8 № п/п Соотношение сырье-экстрагент Содержание, % ФЛ, в пересчете на рутин ФКК, в пересчете на кофейную кислоту 1. 1:10 2,55 1,45 2. 1:15 2,70 1,50 3. 1:20 2,85 1,60 4. 1:25 2,95 1,65 5. 1:30 2,95 1,66

Таблица 9 № п/п Кратность экстракции Содержание, % ФЛ, в пересчете па рутин ФКК, в пересчете на кофейную кислоту 1. 1 1,95 0,94 2. 2 2,52 1,44 3. 3 2,85 1,60 4. 4 2,90 1,65

Источники информации, принятые во внимание

1. Промышленная технология лекарств: Учебник в 2-х т. Том 2 / В.И.Чуешов, М.Ю.Чернов, Л.М.Хохлова и др.; Под ред. профессора В.И.Чуешова. - Харьков: изд-во МГК-Книга; НФАУ, 2002. - С.158-159.

2. Руководство по экспериментальным (доклиническим исследованиям) новых фармакологических веществ / Под ред. члена - корр. РАМН проф. Р.У.Хабриева. - 2 - изд., перераб. и доп. - М.: Медицина, 2005. - 836 с.

3. Владимиров Ю.А. Перекисное окисление липидов в биологических мембранах / Ю.А.Владимиров, А.И.Арчаков. - М.: Наука, 1972. - 239 с.

4. Камышников B.C. Клинические методы диагностики в биохимии / В.С.Камышников. - М.: Наука, 2002. -568 с.

5. Катикова О.Ю. Влияние средств растительного происхождения на показатели ПОЛ при остром токсическом гепатите / О.Ю.Катикова // Вопросы медицинской химии. - 2001. - Т. 47, №6. - С.593-598.

6. Косман В.М. Количественное экстракционно-спектрофотометрическое определение суммарного содержания гидроксикоричных кислот в присутствии флавоноидов в экстрактивных веществах некоторых лекарственных растений / В.М.Косман, И.Г.Зенкевич // Растительные ресурсы. - 2001. - Т.37, №4. - С.123-129.

7. Государственная фармакопея СССР: Вып 2. Общие методы анализа. Лекарственное растительное сырье / МЗ СССР. - 11-е изд - М.: Медицина, 1990. - 337 с.

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности, а именно к применению экстракта из надземной части василька шероховатого (Centaurea scabiosa L.) в качестве гепатопротекторного средства, обладающего антиоксидантным действием. Способ получения гепатопротекторного средства, обладающего антиоксидантным действием, заключается в измельчении надземной части василька шероховатого (Centaurea scabiosa L.) до размеров частиц 2-4 мм с последующей трехкратной экстракцией 70% этанолом при температуре 75-80°С в течение 1-1,5 часов, при соотношении сырье-экстрагент 1:15-1:20, с последующим упариванием досуха полученного экстракта. Применение экстракта из надземной части василька шероховатого (Centaurea scabiosa L.) позволяет расширить арсенал гепатопротекторных средств растительного происхождения, обладающих антиоксидантным действием, способствует нормализации антиоксидантной активности в ткани печени, регрессии основных биохимических показателей при гепатите. 2 н.п. ф-лы, 9 табл.

1. Применение экстракта из надземной части василька шероховатого (Centaurea scabiosa L.) в качестве гепатопротекторного средства, обладающего антиоксидантным действием.

2. Способ получения гепатопротекторного средства, обладающего антиоксидантным действием, характеризующийся тем, что измельченную до размеров частиц 2-4 мм надземную часть василька шероховатого (Centaurea scabiosa L.) трижды экстрагируют 70%-ным этанолом при температуре 75-80°С в течение 1-1,5 ч, при соотношении сырье-экстрагент 1:15-1:20, с последующим упариванием досуха полученного экстракта.