СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СРЕДСТВА, ОБЛАДАЮЩЕГО ПРОТИВОСУДОРОЖНОЙ АКТИВНОСТЬЮ Российский патент 2000 года по МПК A61K35/78 A61P21/02 

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для получения лекарственного средства, обладающего противосудорожной активностью, из растительного сырья.

Известен способ получения препарата из травы водяники черной, обладающего противосудорожным действием (патент РФ N 1312777, БИ 19, 1987) [1]. Сущность способа заключается в экстракции растительного сырья 70%-ным этанолом при температуре 75-85^oC в течение 120-180 минут при соотношении сырье - этанол 1: 10 с последующим упариванием извлечения досуха. Однако средство, полученное по описанному способу, обладает невысокой противосудорожной активностью: ЭД₅₀ по тесту максимального электрошока (МЭШ) составляет 776 мг/кг.

Новый технический результат - повышение противосудорожной активности и расширение арсенала средств, получаемых из растительного сырья - достигают использованием нового способа получения средства, обладающего противосудорожной активностью, путем экстракции в течение 2 - 3 часов растительного сырья водным этанолом и последующим упариванием полученного экстракта, причем в качестве растительного сырья используют надземную часть чертополоха курчавого (Cardnus crispus subsp. crispus L.), собранного в фазу цветения, а экстракцию проводят 40%-ным этанолом при температуре 60 - 80^oC и соотношении сырье - этанол 1:10 - 1:12.

Новым в предлагаемом способе является то, что в качестве растительного сырья используют надземную часть чертополоха курчавого (Carduus crispus subsp. crispus L.), собранного в фазу цветения, а экстракцию проводят 40%-ным этанолом при температуре 60-80^oC и соотношении сырье - этанол 1:10-1:12.

Отличительные признаки проявили в заявляемой совокупности новые свойства: повышение противосудорожной активности по сравнению с прототипом в 7 раз за счет использования нового растительного источника (чертополоха курчавого), собранного в фазу цветения, и более полного извлечения биологически активных веществ за счет применения 40%-ного раствора этанола.

С учетом изложенного, следует считать заявляемое решение соответствующим критерию "существенные отличия ".

Данный способ можно с успехом использовать в фармацевтической промышленности, поэтому изобретение соответствует критерию "промышленная применимость".

Чертополох курчавый - Carduus crispus subsp crispus L. семейства Астровых - Asteraceae
Это двухлетнее травянистое растение до 2 м высотой. Стебель прямой, вверху немного ветвистый; нижние листья с короткими черешками, стеблевые - 4-15 см длиной и 1,5-5 см шириной, сидячие, нисбегающие, почти ланцетовидные, выемчато-зубчатые или лопастные. Корзинки мелкие, диаметром с цветками 1,5-3 см, прямостоячие скученные на концах ветвей.

Растет у дорог и жилья, по залежам, полям, лугам, опушкам, берегам рек, галечникам как сорное растение. Широко распространен в Западной Европе, Европейской части России, на Кавказе, в Западной и Восточной Сибири и на Дальнем Востоке [2, 3].

В надземной части чертополоха курчавого содержатся флавоноиды (лютеолин, апигенин, кемпферол и их гликозиды), кумарины, иридоиды, сесквитерпеновые лактоны, непредельные соединения [4-9].

Способ осуществляют следующим образом.

Измельченные воздушно-сухие надземные части чертополоха курчавого (Carduus crispus subsp. crispus L.), собранные в фазу цветения, состоящие из цветков, листьев и стеблей, заливают 40%-ным этанолом и экстрагируют при температуре 60 - 80^oC в течение 2 - 3 часов при соотношении сырье-экстрагент 1: 10 - 1:12. Полученное извлечение отделяют от сырья процеживанием через 4 слоя марли и упаривают под вакуумом досуха. Высушенный экстракт представляет собой сухой порошок коричневого цвета без запаха. Выход продукта составляет 16,1- 20,6 % от массы исходного сырья, время процесса 4 - 5 часов, противосудорожная активность по тесту МЭШ составляет 64-166 мг/кг, антикоразоловый индекс - 1,27-1,59.

Пример 1. 20 г воздушно-сухих измельченных частей чертополоха курчавого, собранных в фазу цветения, состоящих из цветков, листьев и стеблей растения, заливают 200 мл 40%-ного этанола и нагревают на водяной бане с обратным холодильником при 80^oC в течение 3 часов. Полученное извлечение отделяют от обработанного сырья процеживанием через четыре слоя марли и упаривают под вакуумом досуха.

Выход экстракта составляет 3,21 г или 16,05% от массы исходного сырья, его противосудорожная активность по тесту МЭШ составляет 100 мг/кг, антикоразоловый индекс - 1,39.

Пример 2. 20 г воздушно-сухих измельченных частей чертополоха курчавого, собранных в фазу цветения, состоящих из цветков, листьев и стеблей растения, заливают 200 мл 40%-ного этанола и нагревают на водяной бане с обратным холодильником при 60^oC в течение 3 часов. Полученное извлечение отделяют от обработанного сырья процеживанием через четыре слоя марли и упаривают под вакуумом досуха.

Выход экстракта составляет 3,16 г или 15,81% от массы исходного сырья, его противосудорожная активность по тесту МЭШ составляет 64 мг/кг, антикоразоловый индекс - 1,27.

Пример 3. 20 г воздушно-сухих измельченных частей чертополоха курчавого, собранных в фазу цветения, состоящих из цветков, листьев и стеблей растения, заливают 200 мл 40%-ного этанола и нагревают на водяной бане с обратным холодильником при 80^oC в течение 2 часов. Полученное извлечение отделяют от обработанного сырья процеживанием через четыре слоя марли и упаривают под вакуумом досуха.

Выход экстракта составляет 3,10 г или 15,48% от массы исходного сырья, его противосудорожная активность по тесту МЭШ составляет 166 мг/кг, антикоразоловый индекс - 1,52.

Пример 4. 20 г воздушно-сухих измельченных частей чертополоха курчавого, собраных в фазу цветения, состоящих из цветков, листьев и стеблей растения, заливают 200 мл 40%-ного этанола и нагревают на водяной бане с обратным холодильником при 80^oC в течение 2,5 часов. Полученное извлечение отделяют от обработанного сырья процеживанием через четыре слоя марли и упаривают под вакуумом досуха.

Выход экстракта составляет 3,14 г или 15,72% от массы исходного сырья, его противосудорожная активность по тесту МЭШ составляет 144 мг/кг, антикоразоловый индекс - 1,41.

Пример 5. 20 г воздушно-сухих измельченных частей чертополоха курчавого, собранных в фазу цветения, состоящих из цветков, листьев и стеблей растения, заливают 160 мл 40%-ного этанола и нагревают на водяной бане с обратным холодильником при 80^oC в течение 3 часов. Полученное извлечение отделяют от обработанного сырья процеживанием через четыре слоя марли и упаривают под вакуумом досуха.

Выход экстракта составляет 2,71 г или 13,54% от массы исходного сырья, его противосудорожная активность по тесту МЭШ составляет 415 мг/кг, антикоразоловый индекс - 1,31.

Пример 6. 20 г воздушно-сухих измельченных частей чертополоха курчавого, собранных в фазу цветения, состоящих из цветков, листьев и стеблей растения, заливают 240 мл 40%-ного этанола и нагревают на водяной бане с обратным холодильником при 80^oC в течение 3 часов. Полученное извлечение отделяют от обработанного сырья процеживанием через четыре слоя марли и упаривают под вакуумом досуха.

Выход экстракта составляет 4,12 г или 20,62% от массы исходного сырья, его противосудорожная активность по тесту МЭШ составляет 146 мг/кг, антикоразоловый индекс - 1,59.

Пример 7. 20 г воздушно-сухих измельченных частей чертополоха курчавого, собранных в фазу цветения, состоящих из цветков, листьев и стеблей растения, заливают 200 мл 70%-ного этанола и нагревают на водяной бане с обратным холодильником при 80^oC в течение 3 часов. Полученное извлечение отделяют от обработанного сырья процеживанием через четыре слоя марли и упаривают под вакуумом досуха.

Выход экстракта составляет 3,14г или 15,70% от массы исходного сырья, его противосудорожная активность по тесту МЭШ составляет 226 мг/кг, антикоразоловый индекс - 1,39.

Пример 8. 20 г воздушно - сухих измельченных частей чертополоха курчавого, собранных в фазу цветения, состоящих из цветков, листьев и стеблей растения, заливают 200 мл 25%-ного этанола и нагревают на водяной бане с обратным холодильником при 80^oC в течение 3 часов. Полученное извлечение отделяют от обработанного сырья процеживанием через четыре слоя марли и упаривают под вакуумом досуха.

Выход экстракта составляет 2,70 г или 13,48% от массы исходного сырья, его противосудорожная активность по тесту МЭШ составляет 164 мг/кг, антикоразоловый индекс - 1,19.

Пример 9. 20 г воздушно-сухих измельченных частей чертополоха курчавого, собранных в фазу бутонизации, состоящих из цветков, листьев и стеблей растения, заливают 200 мл 40%-ного этанола и нагревают на водяной бане с обратным холодильником при 80^oC в течение 3 часов. Полученное извлечение отделяют от обработанного сырья процеживанием через четыре слоя марли и упаривают под вакуумом досуха.

Выход экстракта составляет 3,34 г или 16,70% от массы исходного сырья, его противосудорожная активность по тесту МЭШ составляет 421 мг/кг, антикоразоловый индекс - 1,19.

Пример 10. 20 г воздушно-сухих измельченных частей чертополоха курчавого, собранных в фазу цветения, состоящих из цветков, листьев и стеблей растения, заливают 200 мл воды очищенной и нагревают на водяной бане с обратным холодильником при 80^oC в течение 3 часов. Полученное извлечение отделяют от обработанного сырья процеживанием через четыре слоя марли и упаривают под вакуумом досуха.

Выход экстракта составляет 2,45 г или 12,24% от массы исходного сырья, его противосудорожная активность по тесту МЭШ составляет 164 мг/кг, антикоразоловый индекс - 1,19.

Пример 11. 20 г воздушно-сухих измельченных частей чертополоха курчавого, собранных в фазу цветения, состоящих из цветков, листьев и стеблей растения, заливают 200 мл 40%- ного этанола и нагревают на водяной бане с обратным холодильником при 40^oC в течение 3 часов. Полученное извлечение отделяют от обработанного сырья процеживанием через четыре слоя марли и упаривают под вакуумом досуха.

Выход экстракта составляет 2,68 г или 13,40% от массы исходного сырья, его противосудорожная активность по тесту МЭШ составляет 64 мг/кг, антикоразоловый индекс - 1,27.

Пример 12. 20 г воздушно-сухих измельченных частей чертополоха курчавого, собранных в фазу цветения, состоящих из цветков, листьев и стеблей растения, заливают 200 мл 40 %-ного этанола и нагревают на водяной бане с обратным холодильником при 20^oC в течение 3 часов. Полученное извлечение отделяют от обработанного сырья процеживанием через четыре слоя марли и упаривают под вакуумом досуха.

Выход экстракта составляет 2,03 г или 10,14% от массы исходного сырья, его противосудорожная активность по тесту МЭШ составляет 189 мг/кг, антикоразоловый индекс - 1,2.

Пример 13. 20 г воздушно-сухих измельченных частей чертополоха курчавого, собранных в фазу цветения, состоящих из цветков, листьев и стеблей растения, заливают 200 мл 40%- ного этанола и нагревают на водяной бане с обратным холодильником при 90^oC в течение 3 часов. Полученное извлечение отделяют от обработанного сырья процеживанием через четыре слоя марли и упаривают под вакуумом досуха.

Выход экстракта составляет 3,24 г или 16,19% от массы исходного сырья, его противосудорожная активность по тесту МЭШ составляет 269 мг/кг, антикоразоловый индекс - 1,18.

Пример 14. 20 г воздушно-сухих измельченных частей чертополоха курчавого, собранных в фазу цветения, состоящих из цветков, листьев и стеблей растения, заливают 200 мл 40%-ного этанола и нагревают на водяной бане с обратным холодильником при 80^oC в течение 1 часа. Полученное извлечение отделяют от обработанного сырья процеживанием через четыре слоя марли и упаривают под вакуумом досуха.

Выход экстракта составляет 2,61 г или 13,07% от массы исходного сырья, его противосудорожная активность по тесту МЭШ составляет 166 мг/кг, антикоразоловый индекс - 1,52.

Пример 15. 20 г воздушно-сухих измельченных частей чертополоха курчавого, собранных в фазу цветения, состоящих из цветков, листьев и стеблей растения, заливают 200 мл 40 %-ного этанола и нагревают на водяной бане с обратным холодильником при 80^oC в течение 4 часов. Полученное извлечение отделяют от обработанного сырья процеживанием через четыре слоя марли и упаривают под вакуумом досуха.

Выход экстракта составляет 3,23 г или 16,13% от массы исходного сырья, его противосудорожная активность по тесту МЭШ составляет 126 мг/кг, антикоразоловый индекс - 1,39.

Пример 16. 20 г воздушно-сухих измельченных частей чертополоха курчавого, собранных в фазу цветения, состоящих из цветков, листьев и стеблей растения, заливают 280 мл 40%-ного этанола и нагревают на водяной бане с обратным холодильником при 80^oC в течение 3 часов. Полученное извлечение отделяют от обработанного сырья процеживанием через четыре слоя марли и упаривают под вакуумом досуха.

Выход экстракта составляет 4,24 г или 21,18% от массы исходного сырья, его противосудорожная активность по тесту МЭШ составляет 146 мг/кг, антикоразоловый индекс - 1,59.

Было проведено исследование влияния экстрактов чертополоха курчавого, полученных при различных режимах экстракции на белых беспородных мышах массой 18-20 г по скрининговым тестам: максимальный электрошок и коразоловое "титрование" [10-14].

Экстракт чертополоха курчавого, полученный предлагаемым способом, как видно из табл. 1, обладает выраженной противосудорожной активностью по тесту МЭШ (ЭД₅₀ 100 мг/кг), он значительно повышает судорожный порог коразола (АКИ 1,39); по тесту МЭШ превосходит прототип (препарат из травы водяники) в 7,8 раза.

Обоснование режимов
В процессе поиска оптимальных условий получения экстракта из надземных частей чертополоха курчавого было изучено влияние ряда факторов (концентрации этанола, температурного режима, времени экстракции, соотношения сырье - экстрагент) на выход целевого продукта (табл. 1-5). При этом установлено, что экстракцию сырья следует вести при температуре 60-80^oC: понижение температуры ведет к уменьшению выхода целевого продукта за счет уменьшения его растворимости, а дальнейшее повышение температуры нецелесообразно, так как выход экстракта при этом практически не увеличивается (табл. 3).

Оптимальной концентрацией этанола является 40%-ный раствор; изменение ее в сторону уменьшения или увеличения приводит к снижению фармакологической активности извлекаемого экстракта (табл. 2).

Оптимальное время экстракции 2 - 3 часа: в случае уменьшения продолжительности процесса снижается выход целевого продукта; увеличение времени экстракции нерационально, так как при этом выход экстракта возрастает незначительно (табл. 4).

Наилучшее соотношение сырья и экстрагента 1:10-1:12 (табл. 5). При уменьшении количества экстрагента, например 1:8, происходит снижение выхода целевого продукта. Сдвиг в сторону увеличения соотношения нецелесообразен, так как при этом выход экстрактивных веществ возрастает незначительно.

Оптимальной фазой сбора надземной части чертополоха курчавого, состоящей из цветков, листьев и стеблей, является фаза цветения. Что касается фазы бутонизации, то противосудорожное действие полученных экстрактов в оптимальных условиях экстрагирования резко снижается (табл. 1).

Таким образом, предлагаемый способ позволяет повысить противосудорожную активность в 7,8 раза за счет использования нового растительного источника - надземной части чертополоха курчавого Carduus crispus subsp. crispus L., собранной в фазу цветения, и более полного извлечения биологически активных веществ за счет экстракции 40%-ным этанолом при температуре 60 - 80^oC и соотношении сырья и экстрагента 1:10 - 1:12. Способ отличается значительной экономичностью, так как чертополох курчавый имеет широкое распространение на всей территории Российской Федерации в отличие от прототипа - побегов водяники, произрастающих в высокогорных районах Сибири; кроме того, сбор чертополоха может осуществляться ежегодно, в то время как периодичность заготовки водяники составляет 10-15 лет.

Источники информации, принятые во внимание
1. Патент РФ N 1312777 "Способ получения средства, обладающего противосудорожной активностью". БИ, 1987. - N 19 (прототип).

2. Флора Сибири / Под ред. И.М. Красноборова /. - Новосибирск: Наука, 1997-Т. 13.-С. 210- 212. (Род Carduus - Asteraceae).

3. Флора СССР. - М.: Издательство АН СССР, 1963.- 653 с.

4. Андрейченко Ф.И., Сюзева З.Ф., Огурцова Л.Н и др. О химическом составе и фармакологическом действии чертополохов поникающего, крючочкового и курчавого. // Материалы 3-го Всероссийского съезда фармацевтов. - Свердловск, 1975. - С. 291 - 292.

5. Гейдеман Т.О., Иванова Б.И., Ляликов С.И. и др. Полезные дикорастущие растения Молдавии. - Кишинев: Наука, 1962. - 416 с.

6. Дикорастущие полезные растения Коми АССР. - Сыктывкар: Наука, 1966. -192 с.

7. Кучеров Б. В., Байков Г.К., Гуфранова И.Б. Полезные растения Южного Урала - М.: Медицина, 1976. - 264 с.

8. Краснов Е., Саратиков А., Ермилова Б., Терентьева С. Проблема создания растительных антиконвульсантов // Природные условия, история и культура Западной Монголии и сопредельных регионов / Тезисы док ладов III Международной конференции (24-26 сентября 1997 г., г. Ховд, Монголия). - Томск, 1997. - С. 163.

9. Терентьева С.В., Краснов Б.А., Саратиков А. С. Чертополох курчавый - новый перспективный источник антиконвульсантов. // Экология и здоровье человека / Тезисы докладов IV Всесоюзной научно-практической конференции с международным участием. - Самара, 1997. - С. 216-217.

10. Беленький М.Л. Элементы количественной оценки фармакологического эффекта - Л.: Наука, 1963. -149 с.

11. Krall R, Penry J., White B. et al. Antiepileptic Drug Development Anticon- vulsant Drug Screening. // Epilepsia. -1978. - V. 19.-P. 409- 428.

12. Qrloff M. , Williams H., Pfeiffer С. Timed Itraveonous Infusion of Metrasol and Strychnine for Testing Anticonvulsant Drugs. // Proc. Exp. Soc. Biol. Med. - 1949. -V. 70.-P. 254- 257.

13. Swiniard E. , Brown W., Goodman L. Comparative Assays of Antiepileptic Drugs in Mice and Rats. // J. Pharmacol. Exp. Ther. - 1952. -V. 106. -P. 319 -330.

14. Toman 1., Swiniard E., Goodman L. Propeties of Maximal Seizures and their Alterations bu Anticonvusant Drugs and other Agents. // J. Neuiophysiol. - 1946. - V. 9.-P. 231- 239.

Изобретение относится к медицине. Для экстракции используют надземную часть чертополоха курчавого (Carduus crispus subsp, crispus L.), собранного в фазу цветения. Экстракцию проводят 40%-ным этанолом при температуре 60 - 80^oC и соотношении сырье - этанол 1 : 10 - 1 : 12 в течение 2 - 3 ч. Изобретение позволяет повысить противосудорожную активность средства и расширить их арсенал. 5 табл.

Способ получения средства, обладающего противосудорожной активностью, путем экстракции в течение 2 - 3 ч растительного сырья водным этанолом и последующим упариванием этанольного экстракта, отличающийся тем, что в качестве растительного сырья используют надземную часть чертополоха курчавого (Carduus crispus subsp, crispus L.), собранного в фазу цветения, а экстракцию проводят 40%-ным этанолом при температуре 60 - 80^oC и соотношении сырье - этанол 1 : 10 - 1 : 12.