БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫЙ КОМПЛЕКС, ОБЛАДАЮЩИЙ ПРОТЕКТИВНОЙ АКТИВНОСТЬЮ ПРОТИВ ВИРУСА ГРИППА Российский патент 2011 года по МПК A61K39/145 C12N7/00 

Изобретение относится к области молекулярной биологии, иммунологии, вирусологии и касается биологически активного комплекса, обладающего протективной активностью против вируса гриппа. Данный комплекс может быть использован, например, для получения вакцинных препаратов.

Известен биологически активный комплекс, состоящий из вирусных частиц, несущих на поверхности эпитопы (антигенные детерминанты) различных вирусов животных (M.Bendahmane, M.Koo, E.Karrer, R.N.Beachy, Display of epitopes on the surface of tobacco mosaic virus: impact of charge and isoelectric point of the epitope on virus-host interactions, J. Mol. Biol, 1999, 290, 9-20).

Известен биологически активный комплекс, состоящий из палочковидной частицы вируса табачной мозаики (ВТМ), соединенной по крайней мере с одним полипептидом - антигенным полипептидом вируса иммунодефицита человека (A.A.McCormic, K.E.Palmer, Genetically engineered tobacco mosaic virus as nanoparticle vaccines, Expert Rev Vaccines, 2008, 7(1), 33-41).

Наиболее близким к заявляемому является известный биологически активный комплекс, представляющий собой конъюгат, состоящий из модифицированной палочковидной вирусной частицы, соединенной с водорастворимым полипептидом (патент США 20090053261) - прототип.В этом комплексе в качестве модифицированной палочковидной вирусной частицы используют палочковидную частицу с ковалентно связанным биотином. При этом в качестве полипептида используют полипептид, содержащий ковалентно связанный авидин. При смешении вышеназванных компонентов в водной среде образуется единый биологически активный комплекс за счет взаимодействия биотиновых и авидиновых привитых групп в компонентах комплекса.

Недостатком известного вакцинного препарата является его относительно невысокая протективная активность против вируса гриппа.

Технической задачей изобретения является расширение ассортимента биологически активных комплексов и повышение протективной активности комплекса против вируса гриппа.

Указанный технический результат достигается за счет того, что в биологически активном комплексе, обладающем протективной активностью против вируса гриппа и представляющем собой конъюгат, состоящий из модифицированной палочковидной вирусной частицы, соединенной с водорастворимым полипептидом, модифицированная палочковидная вирусная частица получена путем взаимодействия 1 мас. части палочковидной вирусной частицы и 0,01-0,1 мас. частей по крайней мере одного водорастворимого полимера с катионными группами при следующем соотношении исходных компонентов в конъюгате (мас. части):

модифицированная 1 палочковидная вирусная   частица   полипептид 0,1-25

Предлагаемый биологически активный комплекс не описан в литературе и является новым, что существенно расширяет ассортимент биологически активных комплексов.

В предлагаемом техническом решении в качестве палочковидной вирусной частицы могут быть использованы вирусы различных биологических родов, например рода Tobamovirus, рода Tobravirus, рода Pomovirus и т.д. Данные палочковидные вирусные частицы могут быть выделены из клеток живых организмов известными методами или приобретены у коммерческих организаций, например у фирмы AGDIA (США).

В качестве водорастворимого полимера с катионными группами могут быть использованы различные полимеры, например, такие как полилизин, хитозан, полигексаметиленгуанидиний фосфат, полидиметилдиаллиламмоний хлорид (ПДМДААХ), поли-N-этил-4-винилпиридиний бромид (ПЭВП) и т.д. Помимо катионных групп используемые полимеры могут содержать гидрофильные электронейтральные, и/или анионные, и/или гидрофобные группы (звенья). Можно использовать как индивидуальный полимер с катионными группами, так и смеси двух и более различных полимеров с катионными группами. Молекулярная масса полимеров может варьироваться в широких пределах, например, от одного до нескольких тысяч килодальтон. Нерастворимые в воде полимеры не могут быть использованы в данном техническом решении.

С немодифицированной палочковидной вирусной частицей полипептиды биологически активные комплексы не образуют.

Продукт взаимодействия палочковидной вирусной частицы и, по крайней мере, одного полимера с катионными группами образуется только в водной среде. Можно использовать как дистиллированную воду, так и водный раствор солей при их концентрации не выше 1%, например физиологический раствор. При получении такого продукта на 1 мас. часть палочковидной вирусной частицы должно приходиться 0,01-0,1 мас. частей по крайней мере одного водорастворимого полимера с катионными группами. Оптимальное вышеуказанное соотношение палочковидных вирусных частиц и по крайней мере одного водорастворимого полимера с катионными группами установлено экспериментально. При меньшем, чем заявлено, количестве массовых частей водорастворимого полимера с катионными группами биологическая активность конечного комплекса снижается, в то время как при большем содержании полимера продукт неизбежно требует дополнительной очистки от невступившего в реакцию полимера, что усложняет предлагаемый способ. При этом рН водной среды может варьироваться в широких пределах и подбирается экспериментально в зависимости от природы вирусной частицы и химического строения водорастворимого полимера.

Образование именно продукта взаимодействия, а не просто механической смеси палочковидной вирусной частицы и, по крайней мере, одного водорастворимого полимера, содержащего катионные группы, подтверждается результатами следующих экспериментов. Готовят вышеназванный продукт, помещают водную дисперсию полученного продукта в ячейку ультрацентрифуги и подбирают скорость вращения ротора центрифуги таким образом, чтобы обеспечить количественное (полное) осаждение продукта. Убеждаются в том, что надосадочная жидкость (супернатант) не содержит ни свободного водорастворимого полимера, ни свободных вирусных палочковидных частиц. После этого проводят два контрольных эксперимента: в первом центрифугируют водный раствор катионного полимера, во втором - водную суспензию вирусных частиц. Концентрации полимера и вирусных частиц в контрольных экспериментах берут равными концентрациям этих компонентов при формировании продукта. Центрифугирование раствора полимера и суспензии вирусных частиц проводят при той же скорости, при которой наблюдалось полное осаждение продукта. При этом убеждаются, что в указанных условиях ни взятый отдельно полимер, ни взятые отдельно вирусные частицы не осаждаются из раствора (суспензии). Совокупность полученных результатов однозначно свидетельствует о том, что смешение раствора полимера и суспензии вирусных частиц в водной среде сопровождается взаимодействием компонентов (полимера и вирусных частиц) друг с другом и формированием нового продукта, в который количественно входят оба компонента исходной смеси. Полученный продукт не обладает заметной биологической активностью.

В качестве полипептида может быть использован любой биологически активный водорастворимый полипептид, например вакцинные белки вируса гриппа, например, такие как гемагглютинин, нейраминидаза, М2Е. Биологическая активность любого предлагаемого комплекса будет определяться природой использованного при его создании полипептида. Нерастворимый в воде полипептид не может быть использован в предлагаемом техническом решении. Полипептид может быть получен различными методами, например путем биосинтеза в клетках бактерий, дрожжей, растений и т.д. Данный продукт может быть очищен и выделен в виде индивидуального препарата.

При получении биологически активного комплекса одну масс. часть модифицированной палочковидной вирусной частицы смешивают с 0,1-25 мас. частями полипептида. При меньшем, чем заявлено, количестве массовых частей полипептида биологическая активность вышеназванных комплексов существенно снижается. При большем содержании полипептида биологическая активность комплекса не возрастает, но полученный комплекс требует дополнительной очистки от свободного избыточного полипептида, что усложняет предлагаемый способ. При получении комплекса рН водной среды может варьироваться в широких пределах и подбирается экспериментально в зависимости от природы вирусной частицы и химического строения водорастворимого полимера. Получать биологически активный комплекс можно в широком интервале температур, традиционных для получения биологически активных комплексов, например от +4 до +30°С.

Данный комплекс является конъюгатом и представляет собой достаточно стабильное образование, состоящее из модифицированной вирусной частицы и полипептида, которое может быть выделено из раствора в виде гелеобразного осадка. Такой осадок может быть ресуспендирован в водной среде. В зависимости от характеристик модифицированных вирусных частиц, природы полипептида и концентраций обоих компонентов водная суспензия биологически активного комплекса может быть практически прозрачной, слабо опалесцирующей или сильно замутненной.

Образование именно конъюгата (комплекса) при смешении водной суспензии вышеназванных модифицированных вирусных частиц и водного раствора полипептида, а не их простой механической смеси, может быть доказано методом ультрацентрифугирования аналогично тому, как это было сделано выше для продукта взаимодействия вирусных частиц и водорастворимого полимера, содержащего катионные группы. При этом убеждаются в том, что надосадочная жидкость (супернатант) не содержит свободного полипептида, а осадок обладает высокой биологической активностью, которая отсутствовала у модифицированных вирусных частиц.

Биологическая активность комплексов была продемонстрирована с помощью традиционных опытов на лабораторных животных.

Преимущества предлагаемого биологически активного комплекса поясняют следующие примеры.

Пример 1

Из 100 г растений табака, зараженных ВТМ, выделяют препарат палочковидных вирусных частиц методом центрифугирования в градиенте концентрации сахарозы. Готовят 10 мл суспензии палочковидных вирусных частиц в дистиллированной воде, содержащей 100 мг вирусных частиц (концентрация вирусных частиц составляет 10 мг/мл).

Из 100 г клеток E.coli (кишечная палочка) на Ni-содержащей агарозе выделяют водорастворимый полипептид, содержащий фрагмент гемагглютинина вируса гриппа. Готовят 2 мл раствора полипептида в дистиллированной воде, содержащей 8 мг полипептида.

Для получения модифицированных палочковидных частиц используют следующую процедуру. Готовят раствор ПЭВП со степенью полимеризации 600 в воде в концентрации 0,3 мг/мл и 10^-2 М ТРИС-HCl буферный раствор с рН 7,5. Смешивают 0,04 мл раствора ПЭВП (0,012 мг полимера, содержащего катионные группы, 0,02 мас. части), 1,76 мл буферного раствора и 0,06 мл суспензии ВТМ с концентрацией 10 мг/мл (0,06 мг палочковидных вирусных частиц, 1 мас. часть). Смесь инкубируют в течение 1 часа при 4°С. Модифицированные палочковидные частицы выделяют центрифугированием полученной смеси в течение 30 мин при 60000 g и 4°С. Осажденный комплекс ресуспендируют в физиологическом растворе.

Образование продукта - модифицированных палочковидных частиц, а не механической смеси палочковидных вирусных частиц и свободного полимера - доказывают следующим образом. Полученный образец помещают в ячейку ультрацентрифуги и подбирают скорость вращения ротора центрифуги таким образом, чтобы обеспечить количественное (полное) осаждение продукта. Убеждаются в том, что надосадочная жидкость (супернатант) не содержит ни свободных вирусных частиц, ни полимера. После этого проводят два контрольных эксперимента: в первом центрифугируют водную суспензию вирусных частиц, во втором - водный раствор полимера. Концентраци вирусных частиц и полимера в контрольных экспериментах берут равными концентрациям этих компонентов при формировании продукта. Центрифугирование суспензии вирусных частиц и раствора полимера проводят при той же скорости, при которой наблюдается полное осаждение продукта. При этом убеждаются, что в указанных условиях ни взятые отдельно вирусные частицы, ни взятый отдельно полимер не осаждаются из суспензии (раствора). Совокупность полученных результатов однозначно свидетельствует о том, что смешение раствора вирусных частиц и полимера в вышеуказанном соотношении сопровождается взаимодействием компонентов - вирусных частиц и полимера - друг с другом и формированием нового продукта, в который количественно входят оба компонента исходной смеси.

Конъюгат (комплекс) палочковидной частицы и полипептида получают путем смешения 1 мл суспензии модифицированных палочковидных вирусных частиц в физиологическом растворе, содержащей 1 мг частиц (1 мас. часть) и 0,25 мл водного раствора вышеназванного полипептида, содержащего 1 мг полипептида (1 мас. часть). Смесь инкубируют в течение 1 часа при 4°С. Образование именно комплекса, а не их простой механической смеси вышеназванных компонентов доказывают методом ультрацентрифугирования аналогично тому, как это было сделано выше для продукта взаимодействия вирусных частиц и водорастворимого полимера, содержащего катионные группы. При этом убеждаются в том, что надосадочная жидкость (супернатант) не содержит несвязанного полипептида, берущегося изначально в большом молярном (но не массовом) избытке по отношению к палочковидной частице. После этого убеждаются, что осадок обладает высокой биологической активностью, которая отсутствует у модифицированных вирусных частиц. Комплекс выделяют центрифугированием полученной смеси в течение 30 мин при 60000 g и 4°С. Осажденный комплекс ресуспендируют в физиологическом растворе. Методом электрофореза в денатурирующем полиакриламидном геле определяют состав комплекса: палочковидная частица - 1 мас. часть, полипептид - 1 мас. часть.

Полученный комплекс не требует дополнительной очистки.

Биологическую активность полученного комплекса оценивают по его протективной активности. Лабораторных животных (мышей) иммунизируют путем подкожной инъекции, вводя по 50 мкг препарата в присутствии адъюванта Фрейнда в мышь три раза с интервалом 7 дней. Через две недели после третьей иммунизации животных заражают вирусом гриппа, используя адаптированный к мышам штамм вируса гриппа A/PR/8/34 (H1N1). Перед заражением животных проводят титрование вируса на мышах для определения летальной дозы (LD) вируса. Для заражения мышей используют летальные дозы LD70 и LD90, при которых погибает соответственно 70 и 90% неиммунизированных мышей.

Биологическая активность комплекса, определенная указанным способом, показана в Таблице 1. Полученный результат сравнивают с биологической активностью известного биологически активного препарата, выбранного в качестве прототипа.

Таблица 1 Группы мышей Вводимый препарат Количество выживших мышей
на 14-е сутки Выжившие животные, % Доза заражения Доза заражения LD70 LD90 LD70 LD90 Опытная Заявляемый комплекс 20/14* 20/8 70 40 Контрольная Прототип 20/8 20/5 40 25 Примечание: * в числителе общее количество мышей в опыте, в знаменателе количество выживших мышей.

Пример 2

Опыт проводят аналогично примеру 1, однако в качестве модифицированной палочковидной вирусной частицы используют продукт взаимодействия 1 мас. части вируса штриховатой мозаики ячменя (ВШМЯ) и 0,01 мас. части водорастворимого полимера с катионными группами полилизина, в качестве водорастворимого полипептида используют фрагмент белка вируса гриппа нейраминидазы при соотношении компонентов в комплексе: модифицированная палочковидная вирусная частица 1 мас. часть, полипептид 0,1 мас. часть.

Полученный комплекс не требует дополнительной очистки.

Биологическая активность комплекса показана в Таблице 2.

Таблица 2 Группы мышей Вводимый препарат Количество выживших мышей
на 14-е сутки Выжившие животные, %     Доза заражения Доза заражения     LD70 LD90 LD70 LD90 Опытная Заявляемый комплекс 20/15* 20/9 75 45 Контрольная Модифицированная палочковидная частица ВШМЯ 20/5 20/1 25 5 Примечание: * в числителе общее количество мышей в опыте, в знаменателе количество выживших мышей.

Пример 3

Опыт проводят аналогично примеру 1, однако в качестве модифицированной палочковидной вирусной частицы используют продукт взаимодействия 0,05 мас. частей водорастворимого полимера с катионными группами ПДМДААХ, 0,05 мас. частей водорастворимого полимера с катионными группами хитозана и 1 мас. части ВТМ, в качестве водорастворимого полипептида используют фрагмент гемагглютенина при соотношении компонентов в комплексе: модифицированная палочковидная вирусная частица 1 мас. часть, полипептид 25 мас. частей.

Полученный комплекс не требует дополнительной очистки.

Биологическая активность комплекса показана в Таблице 3.

Таблица 3 Группы мышей Вводимый препарат Количество выживших мышей
на 14-е сутки Выжившие животные, % Доза заражения Доза заражения LD70 LD90 LD70 LD90 Опытная Заявляемый комплекс 20/13* 20/7 65 35 Контрольная Модифицированная палочковидная частица ВТМ 20/4 20/2 20 10 Примечание: * в числителе общее количество мышей в опыте, в знаменателе количество выживших мышей.

Пример 4

Опыт проводят аналогично Примеру 1, однако в качестве катионного полимера вместо ПЭВП используют смесь 0,008 мг полилизина и 0,004 мг хитозана. Биологическая активность полученного комплекса с точностью до погрешности эксперимента совпадает с биологической активностью предлагаемого комплекса, описанного в Примере 1.

Пример 5

Опыт проводят аналогично Примеру 2, однако в качестве катионного полимера вместо полилизина используют смесь 0,003 мас. частей ПЭВП, 0,003 мас. частей хитозана и 0,004 мас. частей ПДМДААХ. Биологическая активность полученного комплекса с точностью до погрешности эксперимента совпадает с биологической активностью предлагаемого комплекса, описанного в Примере 2.

Таким образом, из приведенных примеров видно, что предлагаемый комплекс обладает протективной активностью против вируса гриппа и его биологическая активность превышает в 1,6-1,7 раза биологическую активность известного комплекса, выбранного в качестве прототипа. Предлагаемый комплекс является новым, что расширяет ассортимент биологически активных комплексов.

Изобретение относится к области молекулярной биологии, иммунологии, вирусологии. Описан биологически активный комплекс, который может быть использован для получения вакцинных и лечебных препаратов для борьбы с вирусными и другими заболеваниями инфекционной природы и других целей. Изобретение позволяет расширить ассортимент биологически активных комплексов и повышает биологическую активность комплекса в 1,6-1,7 раза. 3 табл.

Биологически активный комплекс, обладающий протективной активностью против вируса гриппа, представляющий собой конъюгат, состоящий из модифицированной палочковидной вирусной частицы, соединенной с водорастворимым полипептидом, отличающийся тем, что модифицированная палочковидная вирусная частица получена путем взаимодействия 1 мас.ч. палочковидной вирусной частицы и 0,01-0,1 мас.ч. по крайней мере одного водорастворимого полимера с катионными группами при следующем соотношении исходных компонентов в конъюгате, мас.ч.:
модифицированная палочковидная вирусная частица 1 полипептид 0,1-25