СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СКОРОСТИ НАКОПЛЕНИЯ КАДМИЯ В ПЕЧЕНИ У КРЫС Российский патент 2023 года по МПК G01N33/50 C12Q1/6806 C12Q1/686 C12Q1/6876 C12Q1/6883 

Изобретение относится к медицине, а именно, к токсикологии, может быть использовано для определения скорости накопления кадмия в печени у крыс.

Кадмий является широко распространенным и не поддающимся биологическому разложению загрязнителем, представляющим серьезную проблему для здоровья человека. Из-за широкого использования в промышленности и антропогенной деятельности содержание кадмия в окружающей среде продолжает увеличиваться. Эпидемиологические исследования связывают воздействие кадмия из окружающей среды с нарушением функций выделительной, опорно-двигательной, репродуктивной и других систем, а также с сердечно-сосудистыми заболеваниями и увеличением заболеваемости раком. Хотя интоксикация кадмием нарушает работу большинства органов и систем организма, печень и почки считаются критическими органами из-за их способности накапливать металл. Аккумуляция металла связана с большим содержанием в печени специфических белков с сульфгидрильными группами - металлотионеинами (МТ), которые способны связывать металлы, концентрируя их в этом органе. Металлсвязывающие белки, в том числе МТ, являются мощными энтеросорбентами для тяжелых металлов и занимают центральное место в естественном ответе организма на воздействие токсичных элементов. Несмотря на достаточное понимание токсичности кадмия, профили экспрессии МТ в различных тканях все еще неизвестны, и диагностический потенциал МТ в распознавании токсичности Cd все еще неясен.

Известен способ оценки кадмия в печени и легких крупного рогатого скота, характеризующийся тем, что проводят микроэлементный анализ волоса крупного рогатого скота. Определяют в волосе концентрацию Fe и/или Ti и рассчитывают уравнение регрессии [патент RU 2548774, 2015].

Наиболее близким аналогом изобретения является способ определения содержания кадмия в органах и мышечной ткани свиней, заключающийся в том, что проводят химический анализ копытного рога свиней методом атомно-абсорбционной спектрометрии, при этом для определения содержания кадмия в мышечной ткани, сердце, печени и почках определяют в копытном роге концентрацию Mn и содержание Cd рассчитывают из уравнения регрессии; для определения содержания кадмия в легких определяют в копытном роге концентрацию Mn и/или К и рассчитывают уравнения регрессии; для определения содержания кадмия в селезенке определяют в копытном роге концентрацию К и рассчитывают уравнение регрессии [патент RU 2342659, 2008]. Недостатком прототипа является отсутствие уравнения регрессии для определения содержания кадмия в печени.

Задачей изобретения является разработка способа определения скорости накопления кадмия в печени у крыс.

Техническим результатом изобретения является повышение точности определения кадмия в печени за счет оценки скорости накопления кадмия по экспрессии генов в крови.

Предлагаемый способ определения скорости накопления кадмия в печени у крыс осуществляется следующим образом. Проводят выделение РНК и количественный анализ мРНК гена МТ3А (Metallothionein-like protein 3А), затем определяют скорость накопления кадмия в печени. Для этого образцы РНК выделяют из лимфоцитов периферической венозной крови. Целостность РНК оценивают электрофорезом в 1%-ном агарозном геле по соотношению интенсивностей полос в геле, соответствующих 28S и 18S рРНК. Синтез первой цепи кДНК проводят с помощью реакции обратной транскрипции. Для изучения количества мРНК гена МТ3А проводят ПЦР со специфичными праймерами. Нормализацию количества мРНК до эндогенного контроля проводят по количеству мРНК гена GAPDH. GAPDH - ген «домашнего хозяйства», экспрессия которого стабильна практически во всех клетках организма. Затем проводят статистический анализ экспрессии гена МТ3А.

При кратности экспрессии гена МТ3А относительно экспрессии GAPDH от -10 до -0,1 определяют низкую скорость накопления кадмия в печени у крыс, оставляющую 0,3±0,03 мг/кг/мес, при кратности экспрессии от 0,1 до 5 - среднюю скорость накопления кадмия в печени у крыс, составляющую 0,6±0,04 мг/кг/мес, при кратности экспрессии от 5,1 до 10 определяют высокую скорость накопления кадмия в печени у крыс, составляющую 1,2±0,06 мг/кг/мес.

В экспериментальном исследовании белых беспородных крыс обоего пола случайным образом разделили на три опытные (Cd1, Cd10, Cd100) и контрольную группу, каждая из которых состояла из 10 крыс. Животных содержали в стандартных условиях с комнатной температурой от 20 до 25С, влажностью от 55 до 60% и циклом 12/12 часов света и темноты. Крысам в исследуемых группах ежедневно через желудочный зонд вводили водный раствор хлорида кадмия, содержащий 1, 10 и 100 мкг кадмия/кг массы тела в группах Cd1, Cd10 и Cd100, соответственно. Воздействие кадмием в группах оценивали через 30 дней. Животных содержали и выводили из эксперимента декапитацией с соблюдением требованиям Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях (ETS N 123). Образцы печени замораживали при температуре -80°С для будущих анализов. Для определения массовой доли кадмия образцы печени подготавливали в системе микроволнового разложения в соответствии с рекомендациями производителя (Speedwave XPERT, Berghof, Германия) и измеряли методом атомно-абсорбционной спектрометрии с электротермической атомизацией (AA240Z, Varian, Австралия).

Статистическую обработку полученных результатов проводили с помощью программы SPSS Statistics 21.0. Для количественных переменных данные выражали как среднее ± ошибка среднего. В качестве критерия нормальности распределения признаков в изучаемых группах использовали критерий Колмогорова-Смирнова. Для сравнения независимых групп по количественным признакам, распределение которых не отличалось от нормального, использовали однофакторный дисперсионный анализ (ANOVA). Попарно повторные сравнения проводились с использованием критерия Тьюки и Тамхейна. Критерий Тьюки использовался при предполагаемом равенстве дисперсий, Тамхейна в случаях, когда дисперсии различались. Силу связи между парами измеряемых параметров определяли с помощью коэффициента корреляции Пирсона, а ее значимость оценивали с помощью t-критерия Стьюдента. Различия и взаимосвязи считали статистически значимыми при р<0,05.

Сравнение уровня экспрессии исследуемых генов в печени показало, что экспрессия гена МТ3А имела корреляцию со скоростью накопления кадмия в печени у крыс (r=0,751; р=0,018).

В ходе экспериментального отравления кадмием показано, что уровень накопления кадмия в печени крыс имел статистически значимые различия (F=66,536; р=0,0001). В группе Cd1 среднее содержания кадмия составило 0,3±0,03 мг/кг, уровень кратности экспрессии варьировал от -10 до -0,1. В группе Cd10 среднее содержания кадмия составило 0,6±0,04 мг/кг, уровень кратности экспрессии варьировал от 0,1 до 5. В группе Cd100 среднее содержания кадмия составило 1,2±0,06 мг/кг, уровень кратности экспрессии варьировал от 5,1 до 10.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами: Пример 1.

Животное 1, мужского пола, вес 204 г. Получало кадмий в дозе 1 мкг кадмия/кг массы тела вместе с питьем в течение месяца. У животного из латеральной вены хвоста взяли 0,2 мл крови. Провели количественный анализ экспрессии гена МТ3А путем обратной транскрипции и последующей ПЦР с использованием специфичных праймеров, нормализацией количества мРНК до эндогенного контроля GAPDH и статистический анализ данных. Кратность относительной экспрессии гена МТ3А равна -10, что говорит о том, что скорость накопления кадмия в печени у крысы составила 0,3±0,03 мг/кг кадмия.

Пример 2.

Животное 2, мужского пола, вес 201 г. Получало кадмий в дозе 1 мкг кадмия/кг массы тела вместе с питьем в течение месяца. У животного из латеральной вены хвоста взяли 0,2 мл крови. Провели количественный анализ экспрессии гена МТ3А путем обратной транскрипции и последующей ПЦР с использованием специфичных праймеров, нормализацией количества мРНК до эндогенного контроля GAPDH и статистический анализ данных. Кратность относительной экспрессии гена МТ3А равна -5,3, что говорит о том, что скорость накопления кадмия в печени у крысы составила 0,3±0,03 мг/кг кадмия.

Пример 3.

Животное 3, мужского пола, вес 207 г. Получало кадмий в дозе 1 мкг кадмия/кг массы тела вместе с питьем в течение месяца. У животного из латеральной вены хвоста взяли 0,2 мл крови. Провели количественный анализ экспрессии гена МТ3А путем обратной транскрипции и последующей ПЦР с использованием специфичных праймеров, нормализацией количества мРНК до эндогенного контроля GAPDH и статистический анализ данных. Кратность относительной экспрессии гена МТ3А равна -0,1, что говорит о том, что скорость накопления кадмия в печени у крысы составила 0,3±0,03 мг/кг кадмия.

Пример 4.

Животное 4, мужского пола, вес 202 г. Получало кадмий в дозе 10 мкг кадмия/кг массы тела вместе с питьем в течение месяца. У животного из латеральной вены хвоста взяли 0,2 мл крови. Провели количественный анализ экспрессии гена МТ3А путем обратной транскрипции и последующей ПЦР с использованием специфичных праймеров, нормализацией количества мРНК до эндогенного контроля GAPDH и статистический анализ данных. Кратность относительной экспрессии гена МТ3А равна 0,1, что говорит о том, что скорость накопления кадмия в печени у крысы составила 0,6±0,04 мг/кг кадмия.

Пример 5.

Животное 5, мужского пола, вес 201 г. Получало кадмий в дозе 10 мкг кадмия/кг массы тела вместе с питьем в течение месяца. У животного из латеральной вены хвоста взяли 0,2 мл крови. Провели количественный анализ экспрессии гена МТ3А путем обратной транскрипции и последующей ПЦР с использованием специфичных праймеров, нормализацией количества мРНК до эндогенного контроля GAPDH и статистический анализ данных. Кратность относительной экспрессии гена МТ3А равна 2,5, что говорит о том, что скорость накопления кадмия в печени у крысы составила 0,6±0,04 мг/кг кадмия.

Пример 6.

Животное 6, мужского пола, вес 202 г. Получало кадмий в дозе 10 мкг кадмия/кг массы тела вместе с питьем в течение месяца. У животного из латеральной вены хвоста взяли 0,2 мл крови. Провели количественный анализ экспрессии гена МТ3А путем обратной транскрипции и последующей ПЦР с использованием специфичных праймеров, нормализацией количества мРНК до эндогенного контроля GAPDH и статистический анализ данных. Кратность относительной экспрессии гена МТ3А равна 5, что говорит о том, что скорость накопления кадмия в печени у крысы составила 0,6±0,04 мг/кг кадмия.

Пример 7.

Животное 7, мужского пола, вес 204 г. Получало кадмий в дозе 100 мкг кадмия/кг массы тела вместе с питьем в течение месяца. У животного из латеральной вены хвоста взяли 0,2 мл крови. Провели количественный анализ экспрессии гена МТ3А путем обратной транскрипции и последующей ПЦР с использованием специфичных праймеров, нормализацией количества мРНК до эндогенного контроля GAPDH и статистический анализ данных. Кратность относительной экспрессии гена МТ3А равна 5,1, что говорит о том, что скорость накопления кадмия в печени у крысы составила 1,2±0,06 мг/кг кадмия.

Пример 8.

Животное 8, мужского пола, вес 204 г. Получало кадмий в дозе 100 мкг кадмия/кг массы тела вместе с питьем в течение месяца. У животного из латеральной вены хвоста взяли 0,2 мл крови. Провели количественный анализ экспрессии гена МТ3А путем обратной транскрипции и последующей ПЦР с использованием специфичных праймеров, нормализацией количества мРНК до эндогенного контроля GAPDH и статистический анализ данных. Кратность относительной экспрессии гена МТ3А равна 7,5, что говорит о том, что скорость накопления кадмия в печени у крысы составила 1,2±0,06 мг/кг кадмия.

Пример 9.

Животное 9, мужского пола, вес 206 г. Получало кадмий в дозе 100 мкг кадмия/кг массы тела вместе с питьем в течение месяца. У животного из латеральной вены хвоста взяли 0,2 мл крови. Провели количественный анализ экспрессии гена МТ3А путем обратной транскрипции и последующей ПЦР с использованием специфичных праймеров, нормализацией количества мРНК до эндогенного контроля GAPDH и статистический анализ данных. Кратность относительной экспрессии гена МТ3А равна 10, что говорит о том, что скорость накопления кадмия в печени у крысы составила 1,2±0,06 мг/кг кадмия.

Изобретение относится к медицине, а именно к токсикологии, может быть использовано для определения скорости накопления кадмия в печени у крыс. Проводят выделение РНК из лимфоцитов периферической венозной крови, определяют количество мРНК гена МТ3А. Затем проводят нормализацию количества мРНК до эндогенного контроля GAPDH. При кратности экспрессии гена МТ3А относительно экспрессии GAPDH от -10 до -0,1 определяют низкую скорость накопления кадмия в печени у крыс, составляющую 0,3±0,03 мг/кг/мес. При кратности экспрессии гена МТ3А относительно экспрессии GAPDH от 0,1 до 5 определяют среднюю скорость накопления, составляющую 0,6±0,04 мг/кг/мес. При кратности экспрессии гена МТ3А относительно экспрессии GAPDH от 5,1 до 10 определяют высокую скорость накопления кадмия в печени, составляющую 1,2±0,06 мг/кг/мес. Использование изобретения обеспечивает повышение точности определения содержания кадмия в печени за счет оценки скорости его накопления. 9 пр.

Способ определения скорости накопления кадмия в печени крыс, включающий исследование биоматериала, отличающийся тем, что в качестве биоматериала используют кровь, проводят выделение РНК из лимфоцитов периферической венозной крови, определяют количество мРНК гена МТ3А, затем проводят нормализацию количества мРНК до эндогенного контроля GAPDH, при кратности экспрессии гена МТ3А относительно экспрессии GAPDH от -10 до -0,1 определяют низкую скорость накопления кадмия в печени у крыс, составляющую 0,3±0,03 мг/кг/мес, от 0,1 до 5 - среднюю скорость накопления, составляющую 0,6±0,04 мг/кг/мес, от 5,1 до 10 определяют высокую скорость накопления кадмия в печени, составляющую 1,2±0,06 мг/кг/мес.