СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИОКСИДАНТНОГО СОСТОЯНИЯ ОРГАНИЗМА Российский патент 2011 года по МПК G01N33/493 

Изобретение относится к медицине - клинической и спортивной и может быть использовано для оценки реакции организма на внешнее воздействие, при исследовании разных форм патологии и в экологических экспериментах.

Известен способ определения в пробах мочи концентрации тиоловых соединений (метод Эллмана [1]). Концентрация урохрома в пробе мочи определяется лишь на качественном уровне - по окраске мочи. В ряде источников оценка окраски мочи, за которую в 95% отвечает урохром, проводится условно с использованием метода диазореакции [2] или путем сравнительного колориметрирования с окраской эталонных растворов различных красителей [3]. Результаты количественного определения урохрома в пробе мочи (в микромоль на литр - мкМ/л) впервые опубликовано в работе [4].

Известно несколько методов оценки неспецифической резистентности организма человека и животных. Один из них [5] основан на определении содержания в периферической крови лимфоцитов и сегментоядерных нейтрофилов и вычислении их соотношения как характеристики типа адаптационной реакции. Однако по данным [6] тест дает в большом числе случаев ошибки в оценке этой реакции. В работе [7] состояние неспецифической резистентности оценивали по содержанию в нейтрофилах бактерицидных систем и гидролитических ферментов, используя для этих целей трудоемкие цитохимические исследования, при которых решалась одна из частных сторон механизма неспецифической резистентности.

Известен способ оценки состояния неспецифической резистентности организма человека и животных, основанный на определении тиолдисульфидного коэффициента крови [8]. Параллельное сопоставление тиолдисульфидного и лейкоцитарного [исследуемого в 5] коэффициентов в процессе развития экспериментального стресса показало, что тиолдисульфидная система позволяет с более высокой надежностью следить за динамикой развития неспецифической резистентности организма на экстремальное воздействие [9].

Методика определения тиолдисульфидного коэффициента крови по результатам определения прямым амперметрическим титрованием содержания сульфгидрильных и дисульфидных групп приведена в [10].

Многоразовое ежедневное исследование крови у одного и того же биообъекта, с целью определения динамики тиолдисульфидного коэффициента в течение суток (недели, месяца и т.д.), практически невозможно.

Задача - ежедневное, многоразовое определение антиоксидантного состояния организма.

Сущность предложенного способа определения антиоксидантного состояния организма, включающего определение в пробе мочи концентраций тиолов и урохрома, состоит в ежедневном, многократном - 7-8 раз отборе проб мочи в течение суток, определении тиолурохромного коэффициента, как величины отношения концентраций тиолов и урохрома в пробе, определении антиоксидантного состояния организма удовлетворительным при величине этого коэффициента 1.46±0.2; и определении антиоксидантного состояния вышедшим за границы удовлетворительного при величине коэффициента больше 1.66 или меньше 1.26.

Независимость тиолурохромного коэффициента от объема разовой порции мочи создает возможность оценки реакции организма на внешнее воздействие с использованием небольшого числа разовых проб.

Реализация способа: Из бутыли со свежей мочой, после определения объема жидкости, в химическую пробирку мерной пипеткой вносят 8 мл мочи, используемой в дальнейшем для исследования (остальную мочу сливают). Затем последовательно готовят соответствующие растворы в двух пробирках.

В первую вносят 5 мл свежей мочи и столько же фосфатного буфера рН8. Содержимое пробирки фильтруют через бумажный фильтр “синяя лента”. Во вторую пробирку вносят 3 мл мочи и столько же фосфатного буфера pH8. Затем отмеривают 0.2 мл (пипеткой на 1 мл) дитионитробензойной кислоты (приготовленной из реактива Эллмана весом 39.6 мг, растворенного в 10 мл фосфатного буфера pH7), содержимое перемешивают и устанавливают (вместе с первой пробиркой) для отстаивания в течение 20 минут в держатель пробирок в месте, закрытом от прямого освещения.

После отстаивания приготовленных в двух пробирках растворов проводят последовательное измерение их оптической плотности (Dk и Dop, соответственно) на фотоэлектрическом микрофотоколориметре МКМФ-01 [11]. Для чего отливают раствор мочи из первой пробирки в кювету, устанавливают кювету в стакан прибора и по отклонению стрелки индикатора фиксируют оптическую плотность Dk. Во вторую кювету отливают раствор из второй пробирки, устанавливают в стакан прибора и фиксируют - Dop. Концентрацию тиолов в полученной пробе мочи определяют с помощью известной калибровочной кривой, характеризующей зависимость оптической плотности d от концентрации HS-глютатиона в серии стандартных растворов (в мкМ SH-групп) [12]. При этом значение параметра d определяют как разность между Dop и Dk.

Затем осуществляют пересчет на мкМ/л для получения значения концентрации тиоловых соединений в исследуемой пробе. Например, если Dop=0.39, a Dk=0.21, то d=0.18. Пользуясь калибровочной кривой, находят, что этой величине соответствует 0.045 мкМ SH-групп. Это означает, что в 3 мл образца содержится 0.045 мкМ SH-групп. Составляют пропорцию и определяют содержание SH-групп в 1000 мл исследуемого раствора - 15 мкМ. В исходной (цельной) моче концентрация тиолов вдвое больше - 30 мкМ/л.

Концентрацию урохрома в той же пробе мочи определяют с помощью той же калибровочной кривой. Основанием для этого послужила обнаруженная способность урохрома мочи поглощать свет с той же длиной волны, что и тионитробензойная кислота (реактив Эллмана). По показателю Dk=0.21 находят, что этой величине соответствует 0.053 мкМ условного урохрома, содержащегося в 3 мл образца. Составляют пропорцию и определяют содержание урохрома в 1000 мл исследуемого раствора - 18 мкМ. В исходной (цельной) моче концентрация урохрома вдвое больше - 36 мкМ/л.

Составляют отношение концентрации тиолов к концентрации урохрома и находят значение тиолурохромного коэффициента (ТУК) - 0.83, что существенно меньше нижней границы удовлетворительного антиоксидантного состояния организма в 1.26.

Определяют поддержание удовлетворительного антиоксидантного состояния организма - если ТУК=1.46±0.2. При ТУК>1.66 или ТУК<1.26 определяют нарушение антиоксидантного состояния организма, выход за границы удовлетворительного.

Пример 1: Определение антиоксидантного состояния организма человека в период длительного (в течение года) пребывания в Антарктике.

Ежедневно (в течение года), в среднем 7-8 раз в сутки, определяют концентрации тиолов и урохрома в разовых порциях мочи и их отношения - тиолурохромные коэффициенты, в соответствии с последовательностью действий, описанной выше. Определяют средние значения ТУК за каждый месяц, путем деления суммы значений ТУК на количество проб мочи. В таблице 1 приведены среднемесячные значения ТУК за исследуемый период - 12 месяцев.

Таблица 1 - Среднемесячные значения ТУК Месяц № ТУК=1.46±0.2 ТУК>1.66 ТУК<1.26 Февраль 1 1.39 - - Март 2 1.42 - - Апрель 3 - - 1.22 Май 4 - - 1.15 Июнь 5 1.41 - - Июль 6 1.31 - - Август 7 1.51 - - Сентябрь 8 - 1.79 - Октябрь 9 - 1.85 - Ноябрь 10 1.46 - - Декабрь 11 1.48 - - Январь 12 1.4 - -

Фиг.1 иллюстрирует сезонный ход среднемесячных значений показателя. По оси абсцисс - порядковый № месяца. По оси ординат - уровень ТУК. Интервал между вертикальными штриховыми линиями соответствует периоду полярной ночи. Тонкая горизонтальная линия определяет среднее значение, а штриховые горизонтальные линии - верхнюю и нижнюю границы уровней ТУК, которые определяют диапазон изменения показателя, характерного для отсутствия возмущающих факторов для организма человека. Видно, что с наступлением полярной ночи (точки 3, 4 на оси абсцисс) уровень отношения минимален, ТУК<1.26, с окончанием полярной ночи (точки 8, 9 на оси абсцисс) и наступлением полярного дня уровень показателя максимальный, ТУК>1.66. В это время происходит, таким образом, нарушение антиоксидантного состояния организма.

Пример 2: Определение антиоксидантного состояния организма человека на интервале, включающем солнечно-лунное явление - солнечное затмение 21.06.2001 г. (18 ч 59 мин).

В течение двух суток до затмения Солнца и двух суток после затмения определяли концентрации тиолов и урохрома в разовых порциях мочи и их отношения - тиолурохромные коэффициенты, в соответствии с последовательностью действий, описанной выше. В таблице 2 приведены значения ТУК за исследуемый период - четверо суток (21 показатель).

Таблица 2 - Значения ТУК разовых проб мочи День № пробы ТУК=1.46±0.2 ТУК>1.66 ТУК<1.26 20.06 1 1.28 - - 2 1.3 - - 3 1.6 - - 4 1.64 - - 5 1.5 - - 6 1.55 - - 21.06 7 - 1.78 - 8 - - 1.0 9 - - 0.98 10 - 1.83 - 11 1.56 - - 12 1.51 - - 22.06 13 1.42 - - 14 - - 1.03 15 - - 1.09   16 - - 1.15 17 1.39 - - 23.06 18 1.53 - - 19 - 2.04 - 20 - 1.75 - 21 1.51 - -

Фиг.2 иллюстрирует динамику ТУК - изменение отношений в 21 разовых порциях мочи на интервале, включающем солнечно-лунное явление - солнечное затмение. По оси абсцисс - порядковый № пробы мочи. По оси ординат - уровень ТУК. Вертикальная штриховая линия - момент наступления затмения (точка 11 на оси абсцисс). Тонкая горизонтальная линия определяет среднее значение, а штриховые горизонтальные линии - верхнюю и нижнюю границы уровней ТУК, которые определяют диапазон изменения показателя, характеризующий отсутствие возмущающих факторов на человека. Видно, что динамика показателя носит сложный характер: падение уровня показателя от 1.78 к 0.98 (ТУК<1.26) с резким подъемом до 1.83 (ТУК>1.66) сменяется повторным снижением уровня к 1.03 (ТУК<1.26) и дальнейшим повышением значения отношения до 2.04 (ТУК>1.66). Здесь также наблюдается последовательное нарушение антиоксидантного состояния организма, но уже на уровне анализа разовых порций мочи.

Пример 3: Определение антиоксидантного состояния организма человека на интервале, включающем воздействие “тепловым” фактором - мытьем в русской бане 21.04.2001 г. (8-10 ч утра).

В течение суток до русской бани и двух суток после определяют концентрации тиолов и урохрома в разовых порциях мочи и их отношения - тиолурохромные коэффициенты, в соответствии с последовательностью действий, описанной выше. В таблице 3 приведены значения ТУК за исследуемый период - трое суток (17 показателей).

Таблица 3 - Значения ТУК разовых проб мочи День № пробы ТУК=1.46±0.2 ТУК<1.26 20.04 1 1.56 - 2 1.49 - 3 1.49 - 4 1.54 - 5 1.42 - 6 1.39 - 21.04 7 1.32 - 8 - 1.2 9 - 1.16 10 - 1.16 11 - 1.25 12 - 1.1 22.04 13 - 1.22 14 1.33 - 15 1.36 - 16 1.49 - 17 1.44 -

Фиг.3 иллюстрирует динамику ТУК - изменение отношений в 17-ти разовых порциях мочи на интервале, включающем “банное” воздействие. По оси абсцисс - порядковый № пробы мочи. По оси ординат - уровень ТУК. Вертикальная штриховая линия разделяет две пробы мочи исследуемые до воздействия (точка 7 на оси абсцисс) и после (точка 8). Тонкая горизонтальная линия определяет среднее значение, а штриховые горизонтальные линии - верхнюю и нижнюю границы уровней ТУК, которые определяют изменение показателя, характеризующее отсутствие возмущающих факторов для организма человека.

Видно, что уровень показателя снижается от 1.32 (до воздействия) к минимуму 1.1 (точка 12), ТУК<1.26. а затем, спустя сутки, возвращается к исходному уровню 1.33. Интервал, включающий минимум показателя (точки 8-13), характеризует нарушение антиоксидантного состояния организма.

Предложенный способ позволяет отслеживать динамику изменения антиоксидантного состояния организма, его реакцию на внешние воздействия на организм, в том числе и космофизические, и для реализации не требует дефицитных дорогих реактивов и сложных продолжительных измерений.

Литература

1. Ellman G. Tissue sulfhydryl groups //Archives of biochemistry and biophysics. - 1959. V.82. P.70-77.

2. Калинин B.C. Методика лабораторных клинических исследований //Гос. медиц. изд-во. Л.: 1928. 526 с. (с.104-105, 107-109).

3. Асатиани B.C. Определение урохрома и урохромогена //Методы биохимических исследований. М.: Медгиз. 1956, с.295-296.

4. Иванов В.В., Горшков Э.С., Соколовский В.В., Соколовская Т.М. О связи колебаний интенсивности экскреции тиолов и урохрома мочи с вариациями космофизических факторов //Сборник избр. тр. V Межд. конгр. “Слабые и сверхслабые поля и излучения в биологии и медицине”. 29.06 - 03.07.2009 г. СПб.: 2009. 185 с (с.111-117).

5. Гаркави Л.Х., Квакина Е.Б., Уколова М.А. Адаптационные реакции и резистентность организма. Ростов-на-Дону: Ростов, ун., 1979. 125 с. (с.79-81).

6. Гуляева С.Ф. Терминальные состояния в эксперименте и клинике. Алма-Ата.: 1990, с.47-49.

7. Темурьянц Н.А., Михайлов А.В., Малыгина В.И. Биофизика 1995. 40 (5), с.969-973.

8. Соколовский В.В. Вопросы мед. химии. 1988. 34 (6), с.2-11.

9. Соколовский В.В., Гончарова Л.Л., Покровская Л.А., Тырнова Е.В. Тиоловые соединения и ацетилхолинэстераза эритроцитов при экспериментальном иммобилизационном стрессе //Междунар. мед. обзоры. 1993. Т. 1, №3. С.194-196.

10. Соколовский В.В. Тиолдисульфидное соотношение крови как показатель состояния неспецифической резистентности организма. Спб.: МАПО, 1996. 30 с. (с.15-24).

11. Микрофотоколориметр МКМФ-01. Интернет сайт.http://www.informsys.ru.

12. Булатов М.И., Калинкин И.П. Практическое руководство по фотоколориметрическим и спектрофотометрическим методам анализа //Химия. Л.: 1972. 407 с. (с.19, 25).

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для оценки реакции организма на внешнее воздействие, при исследовании разных форм патологии и в экологических экспериментах. Сущность способа: в период внешнего воздействия на организм многократно в течение суток отбирают пробы мочи. В каждой пробе определяют концентрации тиолов и урохрома, затем рассчитывают тиолурохромный коэффициент (ТУК) как отношение концентраций тиолов и урохрома. При значении ТУК 1,46±0,2 состояние организма оценивают как удовлетворительное. При значении ТУК больше 1,66 или меньше 1,26 - как вышедшее за границы удовлетворительного. Использование способа позволяет определить динамику антиоксидантного состояния организма, его реакцию на внешнее воздействие, в том числе и на космофизическое. 3 табл., 3 ил.

Способ определения антиоксидантного состояния организма, отличающийся тем, что в период внешнего воздействия на организм многократно в течение суток отбирают пробы мочи, в каждой пробе определяют концентрации тиолов и урохрома, рассчитывают тиолурохромный коэффициент как отношение концентраций тиолов и урохрома, и при значении ТУК 1,46±0,2 состояние организма оценивают как удовлетворительное, а при значении ТУК больше 1,66 или меньше 1,26 - как вышедшее за границы удовлетворительного.