Способ моделирования оксидативного стресса у кур-несушек Российский патент 2024 года по МПК A61B5/145 G01N33/50 

Изобретение относится к ветеринарной терапии и может быть использовано для диагностики оксидативного стресса у кур-несушек.

Известен способ косвенной диагностики оксидативного стресса у людей и животных, основанный на определении количества и (или) активности антиоксидантов в исследуемых образцах. Предложен способ определения количества и/или активности антиоксиданта в исследуемом образце, в котором фотометрируют реакционную смесь с известными начальными концентрациями источника свободных радикалов и активатора хемилюминесценции с момента инициирования реакции, по зависимости интенсивности светового излучения упомянутой смеси от времени реакции вычисляют константу скорости реакции образования свободных радикалов (k_R) и константу скорости реакции элиминирования свободных радикалов при их взаимодействии с упомянутым активатором (k_Lum), готовят реакционные смеси с известной начальной концентрацией источника и активатора, упомянутых выше, и образца, содержащего антиоксидант, фотометрируют упомянутую смесь с момента инициирования реакции и по изменению интенсивности светового изучения от времени реакции, вычисляют начальную концентрацию антиоксиданта [1n]₀ и константу скорости реакции взаимодействия свободных радикалов и антиоксиданта (k_In). Технический результат - определение начальной концентрации заранее не известного антиоксиданта и его активности (WO 2013058676, МПК G01N 21/76, G01N 33/15, G01N 21/272, G01N 21/76, опубл. 25.04.2013).

Недостатком известного способа является его использование в качестве дополнительного биохимического маркера оксидативного стресса, а также для обоснования назначения антиоксидантов или их комбинаций при различных патологических состояния животных и человека. При данном способе не учитывается выявление конкретных антиоксидантов.

Также предложен способ количественного определения антиоксидантной активности пептидов. Изобретение относится к определениям и испытаниям, а именно к способу определения антиоксидантной активности пептидов животного происхождения, и, в частности, комплекса биорегуляторных пептидов, выделяемых из простаты крупного рогатого скота. Указанные пептиды широко применяются при лечении, например, хронического абактериального простатита (ХАП), доброкачественной гиперплазии предстательной железы (ДГПЖ) и сопутствующих нарушений сперматогенеза (RU 2680604, МПК G01N 33/50, опубл. 25.02.2019).

Недостатком известного способа является определение антиоксидантов ферментативной природы. У продуктивных животных и птицы актуальное значение имеет выявление неферментных антиоксидантов, к которым относят витамины Е, С и коэнзим Q10.

Наиболее близким по диагностическим возможностям предложенному способу являются способы на оценке состояния перекисного окисления липидов. Предложен способ определения антиоксидантного состояния организма, отличающийся тем, что в период внешнего воздействия на организм многократно в течение суток отбирают пробы мочи, в каждой пробе определяют концентрации тиолов и урохрома, рассчитывают тиолурохромный коэффициент как отношение концентраций тиолов и урохрома, и при значении ТУК 1,46±0,2 состояние организма оценивают как удовлетворительное, а при значении ТУК больше 1,66 или меньше 1,26 - как вышедшее за границы удовлетворительного. Изобретение относится к медицине - клинической и спортивной и может быть использовано для оценки реакции организма на внешнее воздействие, при исследовании разных форм патологии и в экспериментах на животных и птице (RU 2431839, МПК G01N 33/493, опубл. 20.10.2011).

К недостаткам известного изобретения является его неадаптированность к стрессу кур-несушек.

Общими недостатками указанных способов оценки количества антиоксидантов являются:

- не адаптированы к диагностике оксидативного стресса у кур-несушек;

- необходимо совместное определение уровня антиоксидантов и свободных радикалов в организме животных и птицы;

- низкая диагностическая информативность лабораторных исследований ввиду быстрого окисления свободных радикалов и развития патологических процессов в органах и тканях.

Технический результат заключается в разработке эффективного и надежного способа ранней и точной диагностики оксидативного стресса у кур-несушек путем определения уровня неферментных антиоксидантов в сыворотке крови кур-несушек - витаминов Е, С, и Коэнзима Q10.

Сущность изобретения заключается в том, что способ моделирования оксидативного стресса у кур-несушек в период разноса, включающий содержание кур в клеточной батарее, в которой плотность посадки кур составляет 0,25 м² на одну голову, производят отбор проб крови на 10 и 30 день эксперимента, в сыворотке крови определяют значение показателей витаминов Е, С и коэнзима Q10, при снижении значений указанных показателей на 30 день по сравнению с первым исследованием, получают модель оксидативного стресса у кур-несушек.

В табл. 1 приведены показатели оксидативного стресса у кур-несушек, в табл. 2 приведен гормональный статус кур-несушек при оксидативном стрессе.

Пример. Целью исследований явилась разработка доступных критериев диагностики оксидатного стресса у кур-несушек в период разноса на фоне экспериментального технологического стресса. С этой целью нами были подобраны контрольная и опытная группы кур-несушек яичного направления Хайсекс Браун в возрасте 5-6 месяцев по 20 голов в каждой. Исследования проводили в условиях вивария аграрного института ФГБОУ ВО «МГУ им. Н.П. Огарёва».

Кур-несушек содержали в клеточной батарее. Технологический стресс моделировали путем изменения плотности посадки кур опытной группы. В начале исследований плотность посадки птицы составляла 0,25 м² на одну голову. Через 2 месяца опытов плотность посадки уменьшили до 0,4 м² на одну курицу. Отбор проб крови осуществляли трехкратно через 10 и 30 суток от начала опытов, через 10 суток после уменьшения плотности посадки. У кур-несушек контрольной группы плотность посадки не изменялась за все время опытов и составляла 0,4 м² на голову. Показатели освещенности, температуры воздуха в помещении, а также режим кормления соответствовали технологическим нормативам.

Оценку состояния птицы осуществляли по изменению клинических признаков и биохимических показателей крови. Из биохимических показателей сыворотки крови были выявлены содержание витаминов Е и С, Коэнзим Q10 (убихинон), адренокортикотропного гормона АКТГ, кортизола, тиреотропного гормона ТТГ, тироксина (Т4 общий).

Установлено, что увеличение плотности посадки птицы отражается на ее поведенческих реакциях. Куры-несушки заметно возбуждены и агрессивны по отношению к друг другу. В течение первых 2-3 суток возникают иерархические взаимоотношения. Появляются куры-доминаты, которые провоцируют расклев более слабой птицы. Постоянно идет борьба за фронт кормления и поения. Также наблюдаются бесцельные и быстрые движения птицы в клетках.

Витамин С (аскорбиновая кислота) – растворимое в воде соединение, необходимое для образования коллагена, серотонина, катехоламинов, кортикостероидов, для превращения холестерина в желчные кислоты; обеспечивает процессы детоксикации в печени; обладает мощным антиоксидантным действием; восстанавливает убихинон и витамин Е; влияет на работу иммунной системы за счет стимулирования интерферона; улучшает усвоение железа; обладает нейропротекторным действием.

Витамин Е снижает интенсивность перекисного окисления липидов, уменьшает эритему, ограничивает активацию иммунных клеток, уменьшает синтез воспалительного простагландина, продукцию интерлейкинов, а также ограничивает воспалительную реакцию. Действие витаминов синергично. Витамин С переводит окисленную форму витамина Е в восстановленную, а также в разы увеличивает осветляющий эффект при гиперпигментации.

Коэнзим Q10 (убихинон) - витаминоподобное соединение, обеспечивающее энергетический обмен клеток. Убихинон обладает антиоксидантным действием и восстанавливает антиоксидантную активность витамина Е. Изменение концентрации коэнзима Q10 (убихинона) в крови позволяет оценить уровень окислительного стресса в организме.

Данные о содержании витаминов Е и С, Коэнзима Q10 (убихинон) у кур-несушек опытной группы имели достоверные отличия от аналогичных показателей контрольных кур и представлены в табл. 1.

При оценке таких показателей оксидативного стресса как витамины Е, С и Коэнзим Q10 нами установлено, что с развитием стресс реакции их содержание в крови кур опытной группы резко снижается по сравнению с контрольной птицей. Максимальное снижение наблюдали на 30 сутки опытов при плотности посадки 0,25 м². При снижении плотности посадки до 0,4 м² происходят незначительные сдвиги изучаемых показателей в сторону увеличения. Данные изменения следует рассматривать как начало развития приспособительной реакции и снижения уровня оксидатного стресса у кур.

Изменения в антиоксидантной системе организма кур-несушек подтверждаются данными гормональных исследований в табл. 2.

При оценке гормонального статуса кур-несушек следует отметить, что исследуемые показатели при оксидативном стрессе имеют разную динамику изменения. Так, уровень адренокортикотропного (АКТГ) у опытных кур-несушек сопоставим с аналогичным показателем контрольной птицы, а все изменения данного показателя в течение 60 суток наблюдения находятся в пределах статистической погрешности. Гормон надпочечников кортизол у опытных кур-несушек имеет значительно высокую концентрацию в сыворотке крови, по сравнению с контрольной птицей. У опытных кур-несушек данный показатель выше более чем в 2 раза аналогичного показателя контрольной птицы. Данные уровни кортизола и адренокортикотропного гормона свидетельствуют о периферической стимуляции надпочечников и воздействии на них свободных радикалов.

Содержание тиреотропина (ТТГ) и общего тироксина (Т4) у опытных кур не имеют достоверных отличий от аналогичных показателей контрольных кур и не могут считаться диагностическими критериями оксидативного стресса у кур-несушек.

На основании проведенных исследований установлено, что при диагностике оксидативного стресса у кур-несушек в возрасте 6-8 месяцев важное значение имеет определение таких показателей в сыворотке крови, как витамины Е, С, Коэнзима Q10 и гормонов – адренокортикотропного гормона (АКТГ) и кортизола. Изменение уровня тиреотропина (ТТГ) и тироксина (Т4) происходит на уровне контрольной птицы и не могут служить диагностическим критерием оксидативного стресса у кур-несушек.

По сравнению с известными решениями заявленное изобретение позволяет разработать эффективный и надежный способ ранней и точной диагностики оксидативного стресса у кур-несушек путем определения уровня неферментных антиоксидантов в сыворотке крови кур-несушек - витаминов Е, С, и Коэнзима Q10.

Таблица 1

Показатель Группы кур-несушек Опытная Контрольная В начале опытов (плотность посадки 0,25 м²) Витамин С, мкг/мл 16,23+2,71 18,45+4,12 Витамин Е, мкг/мл 1,45+0,41* 3,17+0,04 Коэнзим Q10 общий, нг/мл 432,09+34,07* 560,12+13,24 Через 30 суток от начала опытов (плотность посадки 0,25 м²) Витамин С, мкг/мл 12,45+2,44* 19,12+1,21 Витамин Е, мкг/мл 0,98+0,11** 3,45+1,02 Коэнзим Q10 общий, нг/мл 279,31+15,28*** 579,14+13,76 Через 60 суток от начала опытов (плотность посадки 0,4 м²) Витамин С, мкг/мл 13,24+4,12* 18,95+3,13 Витамин Е, мкг/мл 1,12+0,09** 3,29+0,54 Коэнзим Q10 общий, нг/мл 465,24+22,13** 580,21+11,47

Примечание: случаи достоверных отклонений *при P≤ 0,05, **п ри P≤0,01, ***при P≤0,001

Таблица 2

Показатель Группы кур-несушек Опытная Контрольная В начале опытов (плотность посадки 0,25 м²) АКТГ, пг/мл 5,51+0,85 4,17+1,53 Кортизол, нмоль/л 27,89+3,27** 13,41+1,14 ТТГ, мЕд/л 0,089+0,02 0,102+0,02 Т4 общий (тироксин), нмоль/л 39,42+2,17 38,61+3,28 Через 30 суток от начала опытов АКТГ, пг/мл 5,89+1,11 4,93+0,73 Кортизол, нмоль/л 31,14+5,22* 13,95+1,71 ТТГ, мЕд/л 0,092+0,03 0,098+0,01 Т4 общий (тироксин), нмоль/л 41,17+2,48 38,22+4,11 Через 60 суток от начала опытов АКТГ, пг/мл 6,03+1,16 5,43+0,83 Кортизол, нмоль/л 35,62+5,13** 14,05+2,17 ТТГ, мЕд/л 0,096+0,03 0,087+0,01 Т4 общий (тироксин), нмоль/л 41,65+2,49 39,12+4,13

Примечание: случаи достоверных отклонений *при P≤ 0,05, **при P≤0,01

Изобретение относится к ветеринарной медицине, а именно к экспериментальной биологии. Кур содержат в клеточной батарее, в которой плотность посадки кур составляет 0,25 м² на одну голову. Затем производят отбор проб крови на 10 и 30 день эксперимента. В сыворотке крови определяют значение показателей витаминов Е, С и коэнзима Q10. При снижении значений указанных показателей на 30 день по сравнению с первым исследованием, получают модель оксидативного стресса у кур-несушек. Способ позволяет получить модель оксидативного стресса у кур-несушек, что в свою очередь дает возможность разработать эффективный и надежный способ ранней и точной диагностики оксидативного стресса у кур-несушек путем определения уровня неферментных антиоксидантов в сыворотке крови кур-несушек - витаминов Е, С, и коэнзима Q10. 2 табл., 1 пр.

Способ моделирования оксидативного стресса у кур-несушек в период разноса, включающий содержание кур в клеточной батарее, в которой плотность посадки кур составляет 0,25 м² на одну голову, производят отбор проб крови на 10 и 30 день эксперимента, в сыворотке крови определяют значение показателей витаминов Е, С и коэнзима Q10, при снижении значений указанных показателей на 30 день по сравнению с первым исследованием, получают модель оксидативного стресса у кур-несушек.