СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГОМОГЕННОЙ ПОПУЛЯЦИИ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК И ЕЕ ПРИМЕНЕНИЕ Российский патент 2011 года по МПК C12N5/00 

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение касается нового способа выделения из зубного фолликула человека новой субпопуляции стволовых клеток с эмбрионо-подобными антигенными характеристиками, а также способа наращивания их в культуре: выделенные клетки могут быть охарактеризованы и сохранены в клеточных коллекциях для экспериментальных либо терапевтических нужд.

Более конкретно, изобретение описывает: выделение стволовых клеток из периодонтальной (околокорневой) фолликулярной ткани донора; их наращивание in vitro, в частности в условиях культивирования, при которых возможно получение эмбрионо-подобных клеток; хранение с целью поддержания жизнеспособности;

их дифференцировку в различные типы клеток; применение полученных типов клеток для клеточной терапии и/или тканевой инженерии в отношении самого донора, либо HLA-совместимого индивида, в целях регенерации повреждений различного происхождения.

Уровень техники

Возможность выделения стволовых клеток из тканей человека спорна и широко обсуждаема на сегодняшний день. Само определение стволовых клеток как способных к самообновлению и дифференциации во все типы клеток организма, из которого они происходят, не согласуется с антигенными и функциональными характеристиками взрослых стволовых клеток, на данный момент получаемых от людей после рождения. С точки зрения «самообновления», в действительности, взрослые стволовые клетки, полученные на данный момент, не демонстрируют неограниченного пролиферативного потенциала и, с другой стороны, способность к дифференциации с трудом преодолевает мультипотентность (возможность дифференцироваться во все типы клеток, которые происходят из того же зародышевого листка) или плюрипотентность (возможность дифференцироваться во все типы клеток, которые происходят также из других зародышевых листков), не достигая тотипотентности (возможность дифференцироваться в любой тип клеток); последнее является свойством зиготы и клеток бластоцисты, определяющим первые этапы развития человека. С другой стороны, возможность манипулирования клетками, полученными из человеческих эмбрионов, для терапевтических или исследовательских целей зачастую вступает в противоречие с техническими, этическими и юридическими принципами. По этим причинам, возможность получения недифференцированных типов клеток из взрослых людей предоставляет не только интересную экспериментальную модель клеточной дифференцировки и модель для решения проблем, связанных с онкологией, но также важное терапевтическое средство для излечения болезней, в основе которых лежит дегенерация тканей, вызванных количественными и качественными дефектами.

Стволовые клетки - это типы клеток, характеризующиеся:

1) неограниченным самообновлением;

2) способностью к дифференцировке во множество типов клеток.

Что касается предшествующего уровня техники, представленного WO 03/066840, включающим фолликулярный серотип, данное изобретение имеет следующие отличия:

1) Антигенный паттерн и способ селекции. WO 03/066840 не раскрывает какой-либо селекции, в то время как способ, представленный в данном изобретении, использует селекцию цитофлуориметрией эмбриональных стволовых клеток, путем детекции таких антигенов как SSEA-4, TRA 1-60, TRA 1-81, CD133, CD90, flk-1. Этим способом возможно получить гомогенную популяцию эмбриональных клеток.

2) Методики культивирования, клеточной пролиферации и дифференцировки. В действительности, WO 03/066840 описывает методику сбора клеточной популяции, которая содержит лишь небольшую долю взрослых стволовых элементов, тогда как способ селекции по настоящему изобретению позволяет получить гомогенную популяцию эмбрионо-подобных стволовых клеток.

Раскрытие изобретения

Данное изобретение включает способ выделения из фолликулярного мешочка новой, не гематопоэтической, мезенхимальной субпопуляции стволовых клеток, далее здесь называемой FENC (происходящие из фолликулов стволовые клетки зародышевого нервного гребня), посредством селекции FAC-сортировкой, после соответствующего окрашивания специфическими антителами.

Изобретение также предоставляет способы культивирования и пролиферации FENC. Клетки, полученные способом по изобретению, способны дифференцироваться во все ткани, происходящие из трех зародышевых листков, таким образом представляя FENC как популяцию тотипотентных/мультипотентных клеток. FENC могут храниться с поддержанием жизнеспособности так, что становится возможным создание клеточных банков для хранения эмбриональных стволовых клеток, собранных от взрослых пациентов. Изобретение также предоставляет методики для клеточной и/или геномной терапии посредством FENC, равно как и клинического терапевтического применения клеток и тканей, полученных из дифференцированных FENC.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Изобретение касается способа выделения нового цитотипа эмбриональных стволовых клеток, собранных от взрослых людей, в частности способа выделения этих клеток, включая их сбор из фолликулярного мешочка. Зубной фолликул, как тканевый комплекс, окружающий зуб во время его формирования до прорезывания, представляет собой привилегированный источник недифференцированных клеток по двум причинам:

1) Каждый зуб, постоянный либо молочный, представляет собой незавершенный орган при рождении. Он привносит в место развития недифференцированные клетки, которые, после пролиферации, станут одонтогенными клетками. Эмбриональное происхождение из нервного гребня объясняет их незрелость. Также при окончании одонтогенеза эти недифференцированные клетки остаются на месте, внутри фолликула, вплоть до прорезывания, так как им предстоит превратиться в клетки корневой оболочки и верхушки корня зуба, которые развиваются после прорезывания. На данный момент несомненно присутствие взрослых стволовых клеток в периодонтальной связке (Gronthos, Lancet 2004), и зубной пульпе (Gronthos, PNAS 2000; Miura, PNAS 2003; Laino, JBMR 2005).

2) Зубной фолликул является биологической нишей, легко доступной хирургически, также как имеет высокое содержание недифференцированных стволовых клеток в собранном объеме ткани. Количество ткани, жертвуемое для сбора стволовых клеток, минимально, так как извлечение зубов мудрости происходит часто, и оно требует сбора фолликулярных мешочков. Полученные из этих биологических образцов стволовые клетки, имеющие характеристики эмбриональных, могут быть сохранены для исследований и аутологичных терапевтических приложений.

Эти клетки происходят из невральной эктодермы и проявляют способность к дифференцировке, свойственную цитотипам - производным этого слоя.

Изобретение впервые предоставляет способ получения от взрослых людей гомогенной клеточной популяции с эмбриональными характеристиками.

Эта стратегия имеет следующие преимущества: 1) мало-инвазивное хирургическое вмешательство с местной анестезией; 2) низкая болезненность места вмешательства; 3) высоко-клоногенная мезенхимальная культура, ввиду отсутствия гематопоэтической фракции; 4) получение эмбриональных клеток от взрослых людей.

Получение FENC - стволовые клетки, полученные из фолликулярного мешочка, напрямую образуются из мезенхимальных клеток, происходящих из неврального гребня во время органогенеза. Их происхождение объясняет их пластичность. Для выделения стволовых клеток из фолликулярного мешочка, последний должен быть интактным, не иметь контактов с ротовой полостью.

Пациент, за неделю до операции, должен следовать соответствующему протоколу оральной гигиены, например ополаскивание ротовой полости CHX 0.12, либо схожим препаратом, минимум дважды в день. Для сбора фолликулярных мешочков, после анестезии, надрезается лоскут ткани и открывается доступ к кости для достижения ретинированного (непрорезавшегося) зуба, окруженного фолликулярным мешочком. Собранный в стерильных условиях образец погружается в дигестивный («переварочный») раствор на 1 час при 37°С. По окончании первого часа, дигестивный раствор фильтруется, чтобы удалить клеточные агрегаты и ECM частицы. После этого процесс ферментативного расщепления останавливается, и клетки культивируются в среде Mega Cell (SIGMA-Milan, Italy). В качестве альтернативы может применяться среда для эмбриональных стволовых клеток (ES). Наблюдения под микроскопом, начиная с первого дня ведения культуры, выявляют большое число клеток, прикрепленных ко дну культурального флакона, которые дают начало клонам. Через 5 дней во флаконе на 75 мл можно насчитать до 60 клонов.

На 9-10 день супернатант убирается, клетки направляются на FAC для сортировки и отбора клонов, положительных по стволовым маркерам.

Выделенные FENC дифференцируются, с/без стимуляции, в различные типы клеток. Существует возможность получить пролиферацию без дифференцировки путем добавления в культуральную среду βFGF. По достижении подходящего количества клеток, они могут быть заморожены и сохранены в жидком азоте при -80°С.

Краткое изложение процедуры:

1) Сбор фолликулярных мешочков в стерильных условиях, ферментативное расщепление и культивирование;

2) Аплификация первичной культуры, по необходимости;

3) Сортировка на FAC;

4) Амплификация, заморозка и/или клеточная дифференцировка;

5) Анализ на FAC;

6) Поддержание в условиях, не допускающих дифференцировки;

7) Тканевая инженерия из дифференцированных клеток.

Все типы клеток, полученные из FENC дифференцировкой, могут применяться не только в клеточной терапии, но также для построения различных тканей.

Например, FENC могут быть использованы для получения костеобразующих предшественников, экспрессирующих RUNX-2, из которых происходят остеобласты, экспрессирующие HLA-1, CD44, RUNX-2e, CD54 и остеокальцин.

Остеоидный матрикс, называемый LAB (живая аутологичная кость), также может быть получен из остеобластов, наращенных и сохраненных в заморозке. LAB изготовлен из образцов костной ткани, имеющих толщину более 1 см и объем более 1 см³. Формирование LAB, содержащего остеобласты, которые активно продуцируют кость, характеризуется: 1) формированием кластеров, которые секретируют в центральную область неорганические кристаллы, коллагеновые волокна и гликопротеины; 2) 3D организацией данной структуры при построении минерализованного костного матрикса.

Указанный LAB формируется при росте клеток при 37°С в атмосфере 5% СО₂ в среде α-MEM, дополненной 20% FBS, 100 мкМ 2-фосфо-аскорбиновой кислотой, 2 мМ L-глутамином, 100 ед./мл пенициллином, 100 мкг/мл стрептомицином. Формирование LAB блокируется только недостатком питательных веществ.

Указанный LAB может продуцироваться непрерывно, и остеоидная ткань может сохраняться, при поддержании остеобластов при 4°С либо температурах ниже 0°С, с применением обычных методик сохранения клеток путем криоконсервации.

Также может быть получен 3D матрикс, содержащий LAB, где остеобласты растут в присутствии биосовместимого 3D матрикса, заселяемого клетками. Указанный биосовместимый матрикс может быть абсорбируемым либо нет in vivo: примерами подходящего матрикса могут служить сополимер молочной и гликолевой кислот, синтетические коллагены, HA, биокораллы, сульфат кальция, тогда как к не абсорбируемым относятся полиметакрилаты, PTF, титан, компактные HA, бифазные HA (50% HA и 50% β-TCP), керамика.

Согласно последующим вариантам выполнения изобретения, FENC также могут быть дифференцированы в миобласты, с целью получения гладко-мышечных клеток, с применением культуральной среды Mega Cell с 2% FBS, 100 мкМ 2-фосфо-аскорбиновой кислоты, 2 мМ L-глутамина, 100 ед./мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, плюс 10 нг/мл TGFβ.

FENC также могут быть дифференцированы in vitro в миобласты, с целью получения поперечно-полосатых мышц, с применением со-культивирования с С2С12 мышиными мышечными трубочками. Со-культивирование проводится при соотношении 1:10 в течение 7 дней, используя следующую культуральную среду: модифицированная по методу Дульбекко среда Игла (DMEM, Invitrogen), 4 мМ L-глутамин, 1,5 г/л бикарбоната натрия, 4,5 г/л глюкозы и 1 мМ пируват натрия, дополненная 10% FBS.

FENC также могут быть дифференцированы in vitro в нейроны и глиальные клетки, с применением культивирования в течение 15-30 дней в Neurobasal A (Invitrogen, Milan, Italy), дополненной белком B27 (Invitrogen, Milan).

Полученные дифференциацией из FENC глиальные клетки могут быть отсортированы от нейронов на FAC с использованием анти-GFAP антител для глиальных клеток.

FENC также могут быть дифференцированы в адипоциты, при культивировании в течение 30 дней в культуральной среде α-MEM, дополненной 20% FBS, 100 мкМ 2-фосфо-аскорбиновой кислоты, 2 мМ L-глутамина, 100 ед./мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, плюс 10^-8 М дексаметазона.

Дифференцировка FENC в хондроциты, с целью получения хряща, может быть получена при культивировании в течение 30 дней в культуральной среде α-MEM, дополненной 20% FBS, 100 мкМ 2-фосфо-аскорбиновой кислоты, 2 мМ L-глутамина, 100 ед./мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, при снижении рО₂ ниже 40 мм рт. ст.

Изобретение обеспечивает аутологичное использование FENC в протоколах клеточной терапии.

В особенности, аутологичное использование FENC и клеток, происходящих из них, может быть полезно в следующих практических приложениях:

- при патологиях скелетного аппарата, таких как дефекты кости, посредством остеобластов - производных FENC.

- при дегенерациях мышечной ткани, как гладкой, так и поперечно-полосатой, посредством миобластов - производных FENC.

- при патологиях центральной нервной системы, посредством нейронов - производных FENC.

- при дегенерации миелина, посредством глиальных клеток - производных FENC.

- в пластической хирургии, при нарушениях формирования жировой ткани, посредством адипоцитов - производных FENC.

- в областях онкологии и пластической хирургии, посредством хондроцитов - производных FENC.

Тесты на канцерогенез - чтобы исключить вероятность канцерогенеза, FENC и дифференцированные из них клетки были инъецированы в безтимусных мышей (мутантных по гену nude), после инфицирования лентивирусом III (Invitrogen, Milan, Italy) в векторе, содержащем кДНК зеленого флуоресцентного белка GFP. После трансплантации, животные были умерщвлены через 30 дней. Гистологическое наблюдение как мест трансплантации, так и важнейших органов, не выявило развития опухолей.

Клетки были проанализированы на наличие основных раковых маркеров и дефекты клеточного цикла: все клетки были эуплоидны, без опухолевых признаков.

Некоторые примеры практического применения FENC приведены ниже.

Пример 1. Выделение клеток и культивирование

Каждому здоровому пациенту, начиная за неделю до операции, было предписано ополаскивание ротовой полости СНХ 0.12 (вес/объем) дважды в день. Для сбора фолликулярных мешочков, после локальной анестезии, надрезался лоскут ткани и открывался доступ к кости для достижения ретинированного (непрорезавшегося) зуба, окруженного фолликулярным мешочком. Собранный, кюретой Грейси либо альвеолярной ложечкой, в стерильных условиях образец был погружен в дигестивный («переварочный») раствор на 1 час при 37°С. В качестве дигестивного раствора использовался PBS (фосфатно-солевой буфер рН 7,4, 1 М), содержащий 3 мг/мл коллагеназы типа I, 4 мг/мл диспазы, 100 ед./мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина и 500 мкг/мл кларитромицина. Объем раствора зависел от объема собранного фолликулярного мешочка и варьировал от 8 до 15 мл. Образцы выдерживались в растворе в течение 1 часа при 37°С. По окончании первого часа, дигестивный раствор фильтровался через 70 мкм фильтр Falcon®, чтобы удалить фрагменты ECM, клетки или крупные клеточные агрегаты. Образец подвергался ферментативному расщеплению вновь в течение 30 мин, если все еще присутствовали тканевые фрагменты. Для остановки ферментативного расщепления, к образцу было добавлено 10 объемов к объему дигестивного раствора, затем образец центрифугировался 10 мин при 140 г. В качестве культуральной среды использовалась среда Mega Cell (SIGMA-Milan, Italy), дополненная 10% плодной бычьей сывороткой (FBS), 100 мкМ 2-фосфо-аскорбиновой кислотой, 2 мМ L-глутамином, 100 ед./мл пенициллином, 100 мкг/мл стрептомицином. По окончании центрифугирования, осадок со дна пробирки был переведен в 25 мл суспензии, культивирование в культуральных матрасах на 50 мл при 37°С и 5% СО₂, со сменой среды дважды в неделю. Наблюдения под микроскопом, начиная с первого дня ведения культуры, показали прикрепленные клетки, которые дают начало клонам.

Пример 2. Наращивание и характеризация

Через 5 дней культивирования в среде, описанной выше, либо в среде для эмбриональных стволовых клеток (ES medium, Invitrogen, Milan, Italy) во флаконах на 75 мл было подсчитано до 60 клонов.

На 9-10 день, после удаления супернатанта и промыва стерильным PBS, клетки были откреплены от дна культурального матраса. После выдерживания в 4 мл EDTA 0,02%, разведенного в свободном от ионов Mg/Ca растворе PBS, в течение 10 мин при 37°C, была проведена сортировка на FAC и сбор клонов клеток, положительных по стволовым маркерам. Клетки были осаждены (10 мин при 140 г), промыты 0,01% BSA (Бычий Сывороточный Альбумин) в растворе PBS при 4°C и инкубировались 30 мин при 4°C для окрашивания 10 мкл стокового раствора антител. После инкубации, клетки были промыты 1 мл 0,1% BSA в PBS, чтобы удалить не прореагировавшие либо неспецифические антитела, и анализировались на позитивное окрашивание для следующих антител: SSEA-4, TRA 1-60, TRA 1-81, CD133, CD90, flk-1 (Santa Cruz, CA, USA). 70% клеток были позитивны по SSEA-4 и 80% по TRA 1-60 и TRA 1-81. А именно, SSEA-4⁺ клетки были также позитивны как по TRA 1-60, так и по TRA 1-81. SSEA-4, TRA 1-60 и TRA 1-81 являются поверхностными молекулами, присутствующими только на недифференцированных клетках, либо на эмбриональных стволовых клетках (ES тотипотентные) и эмбриональных герминальных клетках (EG плюрипотентные). После сортировки небольшой образец был проанализирован на наличие трех транскрипционных факторов, Nanog, OCT-4 и Rex-1, которые обычно детектируемы только в недифференцированных эмбриональных клетках. Позитивность по предыдущим антигенам подтверждает эмбриональную природу клеток (ES) (Zhang Nature 2003). Позитивность по OCT-4 составила 100% во всех отсортированных клетках. Для определения Nanog и Rexl, после получения соответствующего числа клеток, из них была выделена РНК, и анализировалась с помощью RT-PCR.

Пример 3. Дифференциация по типу а (кости, гладкая мускулатура и хрящ)

FENC, выделенные и охарактеризованные, как показано в примерах 1 и 2, могут быть дифференцированы, с - либо без стимуляции, или пролиферировать с подавлением дифференциации, при добавлении 8 нг/мл βFGF в культуральную среду.

Для остеогенной дифференциации, клетки могут быть культивируемы в среде α-MEM, дополненной 20% FBS (вес/объем), 100 мкМ 2-фосфо-аскорбиновой кислотой, 2 мМ L-глутамином, 100 ед./мл пенициллином, 100 мкг/мл стрептомицином. Клетки дифференцируются в остеобласты в течение примерно 25 дней, образуя незрелую костную ткань (положительны по антителам к коллагену типа I и III, остеокальцину, остеонектину, BAP).

Для дифференцировки в гладкую мускулатуру, FENC должны быть культивируемы в среде Mega Cell (SIGMA) с 2% FBS, 100 мкМ 2-фосфо-аскорбиновой кислотой, 2 мМ L-глутамином, 100 ед./мл пенициллином, 100 мкг/мл стрептомицином, с добавлением 10 нг/мл TGFβ. В этих условиях клетки дифференцируются в течение 4-5 дней и становятся позитивными по окрашиванию SMA, что является маркером дифференциации в гладкие мышцы.

Для дифференцировки в хрящ, FENC были культивируемы в среде α-MEM, дополненной 20% FBS, 100 мкМ 2-фосфо-аскорбиновой кислотой, 2 мМ L-глутамином, 100 ед./мл пенициллином, 100 мкг/мл стрептомицином, при снижении рО₂ ниже 40 мм рт. ст., при 37°C с 5% CO₂. Построение хряща, благодаря высокой клеточной концентрации (500,000/ 15 мл), занимает примерно 30 дней и может быть подтверждено анализом экспрессии коллагеназы типа II.

Пример 4. Дифференциация по типу b ( нейроны и глиальные клетки)

Фолликулярные клетки могут дифференцироваться либо спонтанно, либо с применением среды Neurobasal A (Invitrogen, Milan, Italy), с добавлением белка B27 (Invitrogen, Milan, Italy). Культура ведется 5-7 дней. В обоих случаях было получено большое число дифференцированных нейронов и глиальных клеток. Затем, применение цитофлуориметрического анализа с анти-GFAP антителами может дать возможность отобрать и выделить клетки двух типов. В действительности, дифференцированные клетки являются:

- глиальными, если они позитивны по антителу к GFAP;

- нейронами, если они позитивны по антителу анти-TuJl, анти-нейрофиламент, анти-Bra3A (транскрипционный фактор);

- периферическими нейронами, если они позитивны по антителу анти-периферин и анти-p75.

Пример 5. Дифференцировка по типу c (поперечно-полосатые мышцы, адипоциты)

Дифференцировка FENC в поперечно-полосатые мышечные клетки может быть достигнута посредством со-культивирования с С2С12 мышиными мышечными трубочками. Со-культивирование проводится при соотношении 1:10, по известным методикам (например, Laino et al., 2006), в течение недели в следующей культуральной среде: модифицированная по методу Дульбекко среда Игла (DMEM, Invitrogen), 4 мМ L-глутамин, 1,5 г/л бикарбонат натрия, 4,5 г/л глюкозы и 1 мМ пируват натрия, и 10% FBS. После совместного культивирования, процентное отношение FENC, слившихся с мышиными мышечными трубочками, было подсчитано посредством анти-человеческого ядерного ламинина. Обычно, процентное отношение слияний составляло примерно 15-20%. Слитые мышечные трубочки могут быть использованы для трансплантации.

Дифференцировка в адипоциты была получена в течение 30 дней добавлением 10^-8 М дексаметазона в культуральную среду α-MEM, дополненную 20% FBS, 100 мкМ 2-фосфо-аскорбиновой кислотой, 2 мМ L-глутамином, 100 ед./мл пенициллином, 100 мкг/мл стрептомицином. По окончании, наблюдалось множество адипоцитов, которые могут быть окрашены Суданом черным, либо, заново, масляным красным. Жировые клетки могут применяться в пластической хирургии.

Пример 6. Тканевая инженерия и клиническое применение

Дифференцированные FENC также могут быть использованы для восстановления тканей посредством роллерных культур, в аппарате для вращающихся колб. Клетки, дифференцированные в остеобласты, например, могут быть посажены на матрикс из сополимера молочной и гликолевой кислот (85: 15) (который рассасывается в течение 15 дней). Роллерные культуры (1/5 сек) создавались в 5% CO₂ инкубаторе в течение 30 дней. Как только была достигнута толщина в 1 см, наблюдалась 3D тканевая структура, и оценивалась при помощи методик гистологических, иммуногистохимических и сканирующего электронного микроскопа.

Костная ткань может использоваться для регенерации дефектных областей. Если эти клетки могут быть получены от пациентов, матрикс может быть смоделирован, и создана культура с трехмерной структурой. Через 20-30 дней, комплекс матрикс-клетки готов для имплантации в орган пациента.

Трансплантант может быть сделан с применением стандартных хирургических методов. Подготовка органа для трансплантации включает создание локуса открытого кровоизлияния и урезание наружных покровов. Таким образом, интеграция комплекса матрикс-клетки в организм хозяина будет легче, и затем будет проведена трансплантация.

Наилучшая интеграция достигалась за 40-60 дней.

Репарация тканей может быть достигнута благодаря данной аутологичной методике с применением стволовых клеток.

Терминология

Mega cell = культуральная среда для клеток (Sigma-Aldrich, Milan, Italy)

ES = культуральная среда (Invitrogen, Milan, Italy)

βFGF = фактор роста фибробластов β

α-MEM = минимальная поддерживающая среда альфа (Invitrogen)

анти-GFAP = антитела к глиальному фибриллярному кислому белку

GFAP = глиальный фибриллярный кислый белок

SMA = антитело к гладким мышцам

TGFβ = трансформирующий фактор роста бета

BAP = костная щелочная фосфатаза

βFGF = фактор роста фибробластов β

RT-PCR = обратная транскрипция - полимеразная цепная реакция

Nanog = транскрипционный фактор эмбриональных клеток во время раннего развития

Rexl = транскрипционный фактор эмбриональных клеток во время раннего развития

OCT-4 - октамер 4

SSEA-4 = стадиеспецифический эмбриональный антиген 4

TRA 1= антиген отторжения опухоли 1

CD = дифференцировочный кластер

flk-1 = фетальная печеночная киназа 1

HA = гидроксиапатит

TCP = трикальцийфосфат

Изобретение относится к биотехнологии. Описан способ получения популяции стволовых клеток, происходящих из зубного фолликула человека, называемых FENC (происходящие из фолликулов стволовые клетки зародышевого нервного гребня), предусматривающие: а) сбор фолликулярного мешочка в стерильных условиях, расщепление, рост и наращивание первичной культуры; b) необязательно амплификацию; с) сортировку на FAC-сортере по следующим стволовым маркерам: SSEA-4, TRA 1-60, TRA 1-81, ОСТ-4+; d) анализ РНК в отношении позитивности по транскрипционным факторам Nanog и Rex-1. Изобретение позволяет получать гомогенную популяцию стволовых клеток. 2 н. и 8 з.п. ф-лы.

1. Способ получения популяции стволовых клеток, которые происходят из зубного фолликула человека и называются FENC (происходящие из фолликулов стволовые клетки зародышевого нервного гребня), предусматривающий:
a) сбор фолликулярного мешочка в стерильных условиях, расщепление, рост и наращивание первичной культуры;
b) необязательно амплификацию;
c) сортировку на FAC-сортере по следующим стволовым маркерам: SSEA-4, TRA 1-60, TRA 1-81, OCT-4+;
d) анализ РНК в отношении позитивности по транскрипционным факторам Nanog и Rex-1.

2. Способ по п.1, где расщепление проводится с применением протеолитических ферментов и антител.

3. Способ по п.2, где ферментативное расщепление проводится посредством водного раствора, содержащего: 3 мг/мл коллагеназы типа I, 4 мг/мл диспазы, 100 ед./мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина и 500 мкг/мл кларитромицина в PBS.

4. Способ по п.2, где ферментативное расщепление проводится в течение 1 ч при 37°С при встряхивании.

5. Способ по п.1, где рост и наращивание первичной культуры осуществляют с применением культуральной среды, специализированной для стволовых клеток.

6. Способ по п.5, где культуральная среда состоит из Mega Cell, дополненной 10% плодной бычьей сывороткой (FBS), 100 мкМ 2-фосфо-аскорбиновой кислоты, 2 мМ L-глутамина, 100 ед./мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина.

7. Способ по п.5, где инкубация происходит при 37°С в атмосфере 5% СО₂ в течение 15-20 дней, со сменой среды каждые 3 дня.

8. Способ по любому из пп.1-7, в котором сортировка на FAC-сортере проводится с применением антител дополнительно к CD133, CD90 и flk-1 как маркерам стволовых клеток.

9. Применение популяции стволовых клеток, полученной посредством способа по любому из пп.1-8, для получения остеогенных предшественников, остеобластов, миобластов, хондроцитов, адипоцитов, нейронов, глиальных клеток.

10. Применение по п.9, где остеогенные предшественники, остеобласты, миобласты, хондроциты, адипоциты, нейроны, глиальные клетки предназначены для получения аутологичных препаратов, применяемых в протоколах клеточной терапии для лечения патологий скелетного аппарата, дегенерации мышечной ткани, патологий центральной нервной системы, дегенерации миелина, онкологических заболеваний и в пластической хирургии.