ЦИКЛОФИЛИН А - СРЕДСТВО, УСИЛИВАЮЩЕЕ АДГЕЗИВНЫЕ СВОЙСТВА ТРОМБОЦИТОВ Российский патент 2011 года по МПК A61K38/43 A61P7/04 

Изобретение относится к области медицины и биологии, а именно к средствам, усиливающим адгезивные свойства тромбоцитов.

Известны вещества, усиливающие процесс свертывания крови (гидрастинин и др.). Серьезным недостатком подобных средств является то, что они действуют системно на весь каскад реакций гемокоагуляции и могут способствовать развитию тромбоэмболических осложнений. Средств, избирательно влияющих на адгезивные свойства тромбоцитов, в практической медицине не существует. В связи с этим актуален поиск средств, усиливающих функциональные свойства тромбоцитов и не влияющих на системные реакции тромбообразования.

Циклофилин A - белок с молекулярной массой 18 кД, обладающий цис-транс-изомеразной активностью и имеющий большое количество функций как внутри клетки, так и во внеклеточном пространстве (Fisher G., Bang С., Mech С. Determination of enzymatic catalysis for the cis-trans-isomerization of peptide binding in proline-containing peptides. // Biomed. Biochem. Acta. 1984, vol.43, p.1101-1111; Khromykh LM, Kulikova NL, Anfalova TV, Muranova ТА, Abramov VM, Vasiliev AM, Khlebnikov VS, Kazansky DB. Cyclophilin A produced by thymocytes regulates the migration of murine bone marrow cells. // Cell Immunol. 2007, 249(1), p.46-53; Q.Xu, M.C.Leiva, S.A.Fischkoff, R.E.Handschumacher, C.R.Lyttle. Leukocyte chemotactic activity of cyclophilin. J Biol. Chem. 1992, 267, p.1168-1171). Циклофилин A секретируется активированными тромбоцитами, а также гладкомышечными клетками стенок сосудов при оксидативном стрессе (Coppinger JA., Cagney G., Toomey S. et al. Characterization of the proteins released from activated platelets leads to localization of novel platelet proteins in human atherosclerotic lesions. // Blood. 2004, vol.103 (6), p.2094-2104; J.Suzuki, Z.Jin, D.F.Meoli, T.Matoba, B.C.Berk. Cyclophilin A Is Secreted by a Vesicular Pathway in Vascular Smooth Muscle Cells. // Circ Res. 2006; 98, p.811-817).

Задачей изобретения является расширение спектра биологической активности циклофилина A как средства, усиливающего адгезивные свойства тромбоцитов.

Для выполнения поставленной задачи оценивали влияние циклофилина A на функциональную активность тромбоцитов in vitro. Рекомбинантный циклофилин A человека получали из трансфецированных геном циклофилина A человека клеток E-coli с дальнейшей очисткой. Чистота используемого белка ~98% (В.Sherry, G.Zybarth, М.Alfano, L.Dubrovsky, et al. Role of cyclophilin A in the uptake of HIV-1 by macrophages and T lymphocytes. // Proc. Natl. Acad. Sci. 1998, Vol.95, p.1758-1763).

Для исследования использовали кровь больных с ишемической болезнью сердца (31 пациент) или ревматическим пороком сердца (25 человек). Кровь получали из центрального венозного катетера, установленного в подключичную или яремную вену, стабилизировали раствором 3,8% цитрата натрия в соотношении кровь/цитрат=9:1 и центрифугировали при скорости 1000 об/мин в течение 7 минут. После центрифугирования отбирали богатую тромбоцитами плазму, которую использовали в экспериментах.

Для проведения исследования от основного объема отбирали аликвоты богатой тромбоцитами плазмы, вносили циклофилин A в оптимальной концентрации 10 мкг/мл и инкубировали при температуре 37°C в течение 3, 10 и 30 минут.

На агрегометре «Solar-2110» («Solar», Беларусь) определяли количество тромбоцитов и индуцированную агрегационную активность тромбоцитов. Для подсчета количества тромбоцитов в кювету агрегометра вносили 0,32 мл богатой тромбоцитами плазмы и измеряли светопропускание в сравнении с дистиллированной водой. В качестве индукторов активности использовали аденозиндифосфат (АДФ), коллаген и ристоцетин «Ренам», Москва. (Деменьтьева И.И. Чарная М.А., Морозов Ю.А. Тромбоцитарное звено гемостаза при кардиохирургических операциях. // Пособие для врачей. - М., 2005, 34 с.) При оценке индуцированной агрегационной активности тромбоцитов подсчитывали количество тромбоцитов, затем вносили анализируемый индуктор (АДФ, коллаген или ристоцетин) в количестве 0,032 мл и проводили запись агрегатограммы в течение 10 минут.

Влияние циклофилина A на количество тромбоцитов. Проведено изучение прямого влияния циклофилина A на количество тромбоцитов (лизис или спонтанная агрегация). Показано, что оптическая плотность суспензии тромбоциов не изменялась под влиянием циклофилина A, а значит циклофилин A не оказывал влияния на количество тромбоцитов независимо от времени инкубации (Табл. 1).

Таблица 1 Время инкубации (мин) Количество тромбоцитов (тыс/мкл) 0 243,1±9,5 3 240,8±5,9 10 238,2±6,1 30 235,9±10,8 Примечание: * - достоверность p<0,05 по сравнению с временем 0

Влияние циклофилина A на индуцированную агрегацию тромбоцитов.

При оценке влияния циклофилина A на агрегацию тромбоцитов использовали богатую тромбоцитами плазму, полученную от пациентов, независимо от функционального состояния тромбоцитов (Табл. 2). Было показано, что под влиянием циклофилина A коллаген-индуцированная агрегация тромбоцитов достоверно возрастала через 3 минуты инкубации и сохранялась до 30 минут инкубации. АДФ и ристоцетин-индуцированная агрегации тромбоцитов не изменялись в присутствии циклофилина A.

Таблица 2 Время инкубации (мин) Коллаген-индуцированная агрегация АДФ-индуцированная агрегация Ристоцетин-индуцированная агрегация % Δ % Δ % Δ 0 44,1±4,2   38,7±3,8   58,0±5,1   3 57,3±3,1* +15,6 35,0±5,4 -9,5 59,5±6,8 +2,6 10 58,1±4,5* +26,0 38,3±4,7 -1,0 61,0±3,5 +5,2 30 58,0±5,3* +17,8 33,4±3,9 -13,7 62,8±5,8 +8,3 Примечание: * - достоверность p<0,05 по сравнению с временем 0

Изучено влияние циклофилина A на агрегационную способность тромбоцитов. Богатую тромбоцитами плазму от пациентов разделили на две группы: I группа (23 человека) с нормальными показателями агрегационной способности тромбоцитов и II группа (25 человек) со сниженной агрегационной спсобностью тромбоцитов. При инкубации с циклофилином A тромбоцитов первой группы выявлено увеличение коллаген-индуцированной агрегации тромбоцитов на 5,6% через 3 минуты с последующим снижением агрегации на 21,3 и 13,1% соответственно через 10 и 30 минут инкубации. Во второй группе под действием циклофилина А наблюдалось увеличение коллаген-индуцированной агрегации тромбоцитов на 68,5% к 3 минуте, 49,4% - к 10 минуте и 42,7% - к 30 минуте инкубации соответственно. АДФ-индуцированная агрегация не изменялась независимо от исходной агрегационной способности тромбоцитов (Табл. 3).

Таблица 3 Время инкубации (мин) Нормальная агрегация тромбоцитов Гипоагрегация тромбоцитов АДФ-агрегация, % Коллаген-агрегация, % АДФ-агрегация, % Коллаген-агрегация, % 0 41,9±2,8 53,4±2,6 30,3±11,9 26,7±1,7 3 36,3±4,3 56,4±4,3 29,0±2,9 45,0±9,1* 10 37,0±5,9 42,0±9,6 28,0±4,6 39,9±5,7* 30 39,2±1,8 46,4±5,6 32,7±7,8 38,1±3,2* Примечание: * - достоверность различий р<0,05 по сравнению со значениями до инкубации

Технический результат изобретения

Таким образом, показано, что циклофилин A, не изменяя количество тромбоцитов, увеличивает коллаген-индуцированную агрегацию тромбоцитов и не оказывает влияния на АДФ-индуцированную и ристоцетин-индуцированную агрегацию тромбоцитов.

Предложено средство, усиливающее адгезивные свойства тромбоцитов, представляющее собой циклофилин А. Показано, что циклофилин А, не изменяя количество тромбоцитов, увеличивает коллаген-индуцированную агрегацию тромбоцитов без участия тромбина и не оказывает влияния на АДФ-индуцированную и ристоцетин-индуцированную агрегацию тромбоцитов. Следовательно, циклофилин-А оказывает адгезивное действие, при этом не способствует развитию тромбоэмболических осложнений. 3 табл.

Средство, усиливающее адгезивные свойства тромбоцитов, представляющее собой циклофилин А.