СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ ОНКОЛОГИЧЕСКОЙ ВЫЖИВАЕМОСТИ БОЛЬНЫХ С НЕМЕТАСТАТИЧЕСКИМ СВЕТЛОКЛЕТОЧНЫМ РАКОМ ПОЧЕК ПОСЛЕ НЕФРЭКТОМИИ ИЛИ РЕЗЕКЦИИ ПОЧКИ С НОВООБРАЗОВАНИЕМ Российский патент 2011 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к области медицины: онкологии, патологической анатомии и урологии, может использоваться для прогнозирования онкологической 3-, 5- и 7-летней выживаемости больных с неметастатическим светлоклеточным раком почек после нефрэктомии или резекции почки с новообразованием.

Способы для оценки онкологической выживаемости больных при почечно-клеточном раке могут быть разделены в соответствии с их структурой по оцениваемым клиническим и патоморфологическим критериям (Galfano A., Novara G., Lafrate M. et at. Mathematical models for prognostic prediction in patients with renal cell carcinoma // Urol. Int. - 2008. - Vol.80. - P.113-123). В основе любого без исключения способа лежит многофакторный (мультивариантный) анализ тех или иных параметров (независимых факторов). Выделяют два основных варианта оценки прогноза онкозаболевания - математический алгоритм и номограмма. Последняя представляет собой графическую модель результатов многофакторного анализа, которая позволяет рассчитать вероятность выживаемости для каждого отдельного пациента. Способы, включающие математические алгоритмы (или интегрированные системы), позволяют разделить пациентов на группы по прогностическим категориям и служат не только для планирования послеоперационного наблюдения за больными, но и для интерпретации результатов различных исследований. Основные критерии отбора этих способов - количество пациентов и индекс конкордации (CI) или коэффициент согласия Кендалла, который позволяет определить точность способа. Если CI находится в пределах между 0,5 и 0,7, то прогностическая точность является низкой, в пределах от 0,71 до 0,9 - умеренной и более 0,9 - высокой (Galfano A., Novara G., Lafrate M. et al. Mathematical models for prognostic prediction in patients with renal cell carcinoma // Urol. Int. - 2008. - Vol.80. - P.113-123; Harrell F.E., Jr., Califf R.M., Pryor D.B. et al. Evaluating the yield of medical tests // JAMA. - 1982. - Vol.247. - P.2543-2546).

Прогностические способы, основанные на клинических параметрах

1. В 2001 г. О.Yaycioglu и соавт. предложили способ для расчета риска рецидива (Р_рец) после радикальной нефрэктомии в зависимости от вида клинического проявления заболевания и «клинического» размера опухоли. Р_рец представлен следующей формулой: Р_рец=1,55 × симптоматика (0 = отсутствие симптомов; 1 = наличие симптомов)+0,19 × клинический размер опухоли (в сантиметрах). В соответствии с этой формулой больные были разделены на 2 группы риска: 1) низкого - с количеством баллов ≤3 (5-летняя онкологическая выживаемость - 92%); 2) высокого - с количеством баллов >3 (5-летняя онкологическая выживаемость - 57%) (Yaycioglu О., Roberts W.W., Chan T. et al. Prognostic assessment of nonmetastatic renal cell carcinoma: a clinically based model // Urol. - 2001. - Vol.58. - P.141-145).

2. L.Cindolo и соавт. (2003) разработали способ для оценки безрецидивной выживаемости (БВ) больных после радикальной нефрэктомии. В ней Р_рец=1,28 × симптоматика (0 = отсутствие симптомов; 1 = наличие симптомов)+0,13 × клинический размер опухоли (в сантиметрах). Группа низкого риска - с количеством баллов ≤1,2 (5-летняя безрецидивная выживаемость - 93%); высокого - с количеством баллов >1,2 (5-летняя безрецидивная выживаемость - 68%) (Cindolo L., de la Taille A., Messina G. et al. A preoperative clinical prognostic model for non-metastatic renal cell carcinoma // BJU Int. - 2003. - Vol.92. - P.901-905).

Между тем, предложенные способы, во-первых, основаны только на клинических параметрах, т.е. по своей сути субъективны, во-вторых, имеют низкую прогностическую точность: для модели Yaycioglu О. и соавт. CI при оценке безрецидивной выживаемости составил 0,65, онкологической выживаемости - 0,63 и общей выживаемости - 0,59, а для модели Cindolo L. и соавт. CI при оценке безрецидивной выживаемости - 0,67, онкологической выживаемости - 0,65 и общей выживаемости - 0,62 (Galfano A., Novara G., Lafrate M. et al. Mathematical models for prognostic prediction in patients with renal cell carcinoma // Urol. Int. - 2008. - Vol.80. - P.113-123).

Способы, основанные на патологоанатомических критериях

В.Leibovich и соавт. (2003), для оценки безрецидивной выживаемости больных с неметастатическим светлоклеточным раком почек, перенесших радикальную нефрэктомию, создали несколько иной способ, в основе которого лежали те же критерии, но основанные уже на классификации pTNM 2002 г. (табл.1): было выделено 8 категорий пациентов с различной онкологической выживаемостью (табл.2) (Leibovich В., Blute M.L, Cheville J.C. et al. Prediction of progression after radical nephrectomy for patients with clear cell renal cell carcinoma // Cancer. - 2003. - Vol.97. - P.1663-1671).

Хотя для модели В.Leibovich и соавт. (2003) значение CI составило 0,82 (Galfano A., Novara G., Lafrate M. et al. Mathematical models for prognostic prediction in patients with renal cell carcinoma // Urol. Int. - 2008. - Vol.80. - P.113-123), в алгоритме В.Leibovich и соавт. (2003), предназначенном для форм светлоклеточного рака почек без отдаленных метастазов, описывается только безрецидивная выживаемость (Galfano А., Novara G., Lafrate M. et al. Mathematical models for prognostic prediction in patients with renal cell carcinoma // Urol. Int. - 2008. - Vol.80. - P.113-123), a имеются ли достоверные различия в показателях специфической онкологической выживаемости у описанных восьми категорий пациентов, в работе не показано.

Комбинированные способы

Большинство из существующих прогностических способов онкологической выживаемости больных, перенесших радикальную нефрэктомию по поводу рака почек, являются, по сути, комбинированными, с относительно произвольным выбором тех или иных клинических, лабораторных, патологоанатомических и молекулярно-биологических показателей, связанных с прогнозом.

H.G. van der Poel и соавт. (1993) (Van der Poel H.G., Mulders P.F.A., Oosterhof G.O.N. et al. Prognostic value of karyometric and clinical characteristics in renal cell carcinoma // Cancer. - 1993. - Vol.72. - P.2667-2674) предложили способ, разработанный на основе многофакторного регрессионного анализа выживаемости 121 больного с почечно-клеточным раком (по методу Кокса). H.G. van der Poel и соавт. (1993) показали, что стадия заболевания (по классификации International Union Against Cancer, 1987 г.) (р=0,001), соматический статус (по шкале Карновского - от 0 до 100) (р=0,006), снижение массы тела пациента (р=0,008), а также анизокариоз (р=0,018) являются независимыми факторами прогноза. Предлагаемый способ включает в себя регрессионное уравнение: XBeta = (0,875 × стадию)+(-0,04 × показатель соматического статуса)+(-0,74 × показатель снижения веса)+(0,044 × разница между максимальным и наименьшим стандартными отклонениями площади ядер в опухоли). В зависимости от значений показателя XBeta были продемонстрированы различия в функции трехлетней выживаемости больных (по методу Каплана-Мейера): пациенты со значением ≤-2,3 имели хороший прогноз (онкологическая выживаемость - 80%), от -2,3 до -1 - «промежуточный» (онкологическая выживаемость - 41%) и > -2,3 - плохой (онкологическая выживаемость - 21%) (Van der Poel H.G, Mulders P.F.A, Oosterhof G.O.N. et al. Prognostic value of karyometric and clinical characteristics in renal cell carcinoma // Cancer. - 1993. - Vol.72. - P.2667-2674).

Между тем, авторы оценивали только 3-летнюю онкологическую выживаемость, при этом 65 (54%) больных получали иммуно- и/или химиотерапию, 7 (6%) - радиационную терапию, что не может не сказаться на качестве предложенной модели оценки выживаемости больных. Отсутствует прогностическая оценка 5- и 7-летней онкологической выживаемости больных. Кроме того, стадия рака почек определялась по устаревшим (на сегодняшний день) системам Robson C.J. и соавт. (1969) (Robson C.J., Churchill B.M., Anderson W. The results of radical nephrectomy for renal cell carcinoma // J. Urol. - 1969. - Vol.101. - P.297-301) и UICC (1987) (Hermanek P., Sobin L.H. TNM classification of malignant tumours. UICC International Union Against Cancer. - Berlin: Springer-Verlag, 1987). Авторы учитывали гистологическое строение (гистотип) опухоли, которое не имело прогностической значимости не только при многофакторном, но и при однофакторном регрессионном анализе Кокса, вместе с тем, с 1993 г. гистологическая классификация почечно-клеточного рака несколько раз видоизменялась (Юрин А.Г. Опухоли почек (рабочие стандарты патологоанатомического исследования): Библиотека патологоанатома. - СПб., 2006. - Вып.75. - 84 с.), что может также отразиться на точности прогностической модели. Сам способ недостаточно специфичен, то есть отсутствуют критерии для определения онкологической выживаемости больных именно с неметастатическим светлоклеточным раком почек, так как способ-прототип включает в себя все случаи рака почек. Неизвестна и точность прогностической модели.

В клинической практике, как правило, при проведении различных многоцентровых исследований наибольшее распространение получил прогностический алгоритм интегрированной системы стадирования UISS (UCLA (University of California at Los Angeles) Integrated Staging System), предложенный в 2001 г. A.Zisman и соавт. (Zisman A., Pantuck A.J., Dorey F. et al. Improved prognostication of renal cell carcinoma using an Integrated Staging System // J. Clin. Oncol. - 2001. - Vol.19. - P.1649-1657). Эта система была создана на основе анализа общей 5-летней выживаемости 661 больного, перенесшего радикальную нефрэктомию по поводу почечно-клеточного рака (все гистологические подтипы). Оценивались TNM-стадия (1997), соматический статус ECOG PS (табл.3) и гистологическая степень злокачественности по S.A.Fuhrman и соавт. (1982). Все пациенты в зависимости от показателей общей 5-летней выживаемости были разделены на 5 групп: в группе I общая выживаемость больных составила 95%, в группе II - 67%, в группе III - 39%, в группе IV - 23% и в группе V - 0%. Применяя эту систему для прогноза заболевания после радикальной нефрэктомии у 814 больных с почечно-клеточным раком, из которых у 468 был неметастатический рак почек, а у 346 - метастатические формы опухоли, A.Zisman и соавт. (2002) выделили 3 группы пациентов - с низким, средним и высоким риском прогрессирования заболевания и смерти (Zisman A., Pantuck A.J., Wieder J. et al. Risk group assessment and clinical outcome algorithm to predict the natural history of patients with surgically resected renal cell carcinoma // J. Clin. Oncol. - 2002. - Vol.20. - P.4559-4566). Обе системы UISS для оценки степени риска у больных с раком почек с отсутствием или наличием метастазов (лимфогенных и/или отдаленных) представлены в табл.4 и 5, а данные о прогнозируемой 5- и 2-летней выживаемости - в табл.6 и 7.

Хотя K.R.Han и соавт. (2003), применив алгоритм UISS для оценки степени риска прогрессирования и смерти у пациентов с неметастатическим почечно-клеточным раком на достаточно представительном материале, рассчитали, что CI этого способа для оценки онкологической выживаемости и колеблется в пределах от 0,79 до 0,84 (Han K.R., Bleumer I., Pantuck A.J. et al. Validation of an integrated staging system toward improved prognostication of patients with localized renal cell carcinoma in an international population // J. Urol. - 2003. - Vol.170. - P.2221-2224). Предложенный способ также не учитывает вариант почечно-клеточного рака, а, кроме того, основан на оценке соматического статуса больного, поэтому его использование в патологоанатомической практике при исследовании патоморфологом операционного материала затруднительно.

В качестве прототипа по наиболее близкой технической сущности выбран способ I.Frank и соавт. (2002), которые для определения онкологической выживаемости у больных после радикальной нефрэктомии у пациентов со светлоклеточным раком почек предложили способ, основанный на патоморфологических критериях, имевших статистическую значимость при многофакторном анализе, таких как стадия (pTNM, 1997) (р<0,001), размер опухоли ≥5 см (р<0,001), гистологическая степень злокачественности по S.A.Fuhrman и соавт. (1982) (Fuhrman S.A., Lasky L.C., Limas С. Prognostic significance of morphologic parameters in renal cell carcinoma // Am. J. Surg. Pathol. - 1982. - Vol.6. - P.655-663) (р<0,001) и наличие микронекрозов в опухоли (р<0,001) - SSIGN (Stage, Size, Grade and Necrosis) (Frank I., Blute M.L, Cheville J.C. et al. An outcome prediction model for patients with clear cell renal cell carcinoma treated with radical nephrectomy based on tumor stage, size, grade and necrosis: the SSIGN score // J. Urol. - 2002. - Vol.168. - P.2395-2400) (табл.8). В соответствии с этим было выделено 10 категорий больных с различной онкологической выживаемостью (табл.9).

Способ, выбранный в качестве прототипа, обладает следующими недостатками:

- Неизвестны уровни различий в показателях онкологической выживаемости у десяти описанных категорий больных, что, несомненно, влияет на точность прогноза.

- Алгоритм, описанный I.Frank и соавт. (2002), зависим от TNM-стадии 1997 г., устаревшей на сегодняшний день.

- I.Frank и соавт. (2002) используют способ определения гистологической степени злокачественности, разработанный S.A.Fuhrman et al. (1982). По мнению автора заявляемого способа, увеличение микроскопа ×100 для определения III гистологической степени злокачественности опухоли в способе S.A.Fuhrman et al. недостаточно, так как при данном увеличении не все ядрышки визуализируются. Так, по собственным данным, при увеличении микроскопа ×100 более половины ядрышек не определялось. Для определения IV гистологической степени злокачественности опухоли авторами данной работы не указаны значения увеличения микроскопа.

- В способе S.A.Fuhrman et al. отсутствуют также четкие данные о средних размерах ядер клеток светлоклеточного варианта почечно-клеточного рака различной гистологической степени злокачественности при обычной (рутинной) обработке материала, а также о таких кариометрических показателях клеток светлоклеточного рака почек, как диаметр, периметр, площадь, объем, индексы формы и удлиненности ядер опухолевых клеток.

- Кроме того, в работе S.A.Fuhrman et al. (1982) отсутствует описание техники фиксации и окраски, в то время как давно установленным фактом является ядерно-цитоплазматическая ретракция от 10 до 70% в любых тканях, в зависимости от применения тех или иных методов обработки материала (Ташкэ К. Введение в количественную цитогистологическую морфологию. - Бухарест: Издательство Академии, 1980. - С.26-28). Необходимо учитывать и тот факт, что на парафиновых или целлоидиновых срезах не следует измерять ядра во внешней зоне препарата шириной 0,5 мм, так как здесь клетки больше сжимаются в процессе гистологической обработки, а между объемами ядер периферических и центральных зон наблюдается разность на 70% при заливке в парафин и на 35% - в целлоидин (Ташкэ К. Введение в количественную цитогистологическую морфологию. - Бухарест: Издательство Академии, 1980. - С.26-28).

- Важно отметить, что в исследовании S.A.Fuhrman et al. (1982) из 103 случаев почечно-клеточного рака на долю его светлоклеточного варианта приходилось только 2/3 (остальные формы рака - папиллярный, «смешанного строения» и с саркоматоидным компонентом). Другие формы рака, при которых кариометрический параметры и наличие или отсутствие ядрышек при различных увеличениях микроскопа могут существенно отличаться от светлоклеточного варианта. Таким образом, данный способ не обладает достаточной специфичностью, то есть отсутствуют критерии для определения гистологической степени злокачественности именно неметастатического светлоклеточного рака почек.

- Кроме того, 17% больным с почечно-клеточным раком, включенным в исследование, проводилась лучевая и/или химиотерапия, что, вероятно, также может сказываться на размерах ядер (Fuhrman S.A., Lasky L.C., Limas C. Prognostic significance of morphologic parameters in renal cell carcinoma // Am. J. Surg. Pathol. - 1982. - Vol.6. - P.655-663).

Техническим результатом изобретения является разработка уровней различий в показателях прогнозирования 3-, 5- и 7-летней онкологической выживаемости больных с неметастатическим светлоклеточным раком почек, что повысит точность прогноза.

Технический результат изобретения достигается тем, что определяют гистологическую степень злокачественности неметастатического светлоклеточного почечно-клеточного рака у больных после нефрэктомии или резекции почки с новообразованием: при значении среднего диаметра ядер опухолевых клеток ≤6 мкм или отсутствии ядрышек в ядрах опухолевых клеток, при кариометрии минимального числа ядер клеток светлоклеточного рака почки, равного 10, определяют I гистологическую степень злокачественности.

При значении среднего диаметра ядер опухолевых клеток 6,1-7 мкм или определении ядрышек при увеличении микроскопа ×400, при кариометрии минимального числа ядер клеток светлоклеточного рака почки, равного 20, определяют II гистологическую степень злокачественности.

При значении среднего диаметра ядер опухолевых клеток 7,1-8 мкм или определении ядрышек при увеличении микроскопа ×125, при кариометрии минимального числа ядер клеток светлоклеточного рака почки, равного 30, определяют III гистологическую степень злокачественности.

При значении среднего диаметра ядер опухолевых клеток >8 или определении ядрышек при увеличении микроскопа ×100, при кариометрии минимального числа ядер клеток светлоклеточного рака почки, равного 40, определяют IV гистологическую степень злокачественности.

При иммуногистохимическом исследовании определяют уровень экспрессии антигена Ki-67: уровню экспрессии антигена Ki-67≤3% присваивают 1 балл, 3,1-10% - 2 балла, >10% - 3 балла.

При иммуногистохимическом исследовании определяют также уровень экспрессии мутантного типа онкогена р53: уровень экспрессии р53≤12%, присваивают 1 балл, 12,1-35% - 2 балла, >35% - 3 балла.

Прогноз онкологической выживаемости осуществляют с помощью формулы:

У_МБП=1,83X₁+1,45Х₂+1,18Х₃,

где X₁ - гистологическая степень злокачественности опухоли (1, 2, 3 или 4); Х₂ - уровень экспрессии Ki-67 в баллах (1, 2 или 3); Х₃ - уровень экспрессии р53 в баллах (1, 2 или 3).

При значении У_МБП≤6,29 прогнозируют онкологическую 7-летнюю выживаемость у больных с неметастатическим светлоклеточным раком почек после нефрэктомии или резекции почки с новообразованием в 100% случаев, при значении У_МБП 6,82-8,92 прогнозируют онкологическую 3-, 5- и 7-летнюю выживаемость у данной категории больных в 96,5%, 75% и 71,2% случаев соответственно, при значении У_МБП 9,19-11,55 прогнозируют онкологическую 3-, 5- и 7-летнюю выживаемость у данной категории больных в 81,8%, 54,5% и 42,4% случаев соответственно, при значении У_МБП>11,55 прогнозируют онкологическую 3-, 5- и 7-летнюю выживаемость у данной категории больных в 20%, 10% и 10% случаев соответственно.

При значении У_МБП≤6,29 прогноз онкологической выживаемости больных с неметастатическим светлоклеточным раком почек после нефрэктомии или резекции почки с новообразованием расценивают как благоприятный, при значении У_МБП=6,82-8,92 - как относительно благоприятный, при значении У_МБП=9,19-11,55 - как относительно неблагоприятный, при значении У_МБП>11,55 - как неблагоприятный.

Способ выполняется следующим образом.

Из каждой опухоли вырезают не менее 10 кусочков из разных отделов по методу случайных чисел. Материал фиксируют в 10% нейтральном забуференном формалине с последующей заливкой в парафин, изготавливают срезы толщиной 7 мкм и окрашивают их гематоксилином и эозином. В исследование не включают случаи светлоклеточного рака почек с наличием саркоматоидного компонента. Не измеряют ядра во внешней зоне препарата шириной до 500 мкм.

На основании критериев, разработанных на базе СПб ГУЗ «Городское патологоанатомическое бюро» (Юрин А.Г., Ковальский Г.Б. Гистологическая степень злокачественности рака почек: карио- и стереометрический анализ // Арх. пат. - 2009. - Вып.2. - С.13-18), для оценки гистологической степени злокачественности определяют такие параметры, как отсутствие или наличие ядрышек при различном увеличении микроскопа (×100, ×125 и ×400) или средний диаметр ядер опухолевых клеток. При кариометрическом исследовании можно ограничиться определенным минимальным числом ядер клеток светлоклеточного рака почки.

При значении среднего диаметра ядер опухолевых клеток ≤6 мкм или отсутствии ядрышек в ядрах опухолевых клеток, при кариометрии минимального числа ядер клеток светлоклеточного рака почки, равного 10, определяют I гистологическую степень злокачественности.

При значении среднего диаметра ядер опухолевых клеток 6,1-7 мкм или определении ядрышек при увеличении микроскопа ×400, при кариометрии минимального числа ядер клеток светлоклеточного рака почки, равного 20, определяют II гистологическую степень злокачественности.

При значении среднего диаметра ядер опухолевых клеток 7,1-8 мкм или определении ядрышек при увеличении микроскопа ×125, при кариометрии минимального числа ядер клеток светлоклеточного рака почки, равного 30, определяют III гистологическую степень злокачественности.

При значении среднего диаметра ядер опухолевых клеток >8 или определении ядрышек при увеличении микроскопа ×100, при кариометрии минимального числа ядер клеток светлоклеточного рака почки, равного 40, определяют IV гистологическую степень злокачественности.

Иммуногистохимическое исследование опухолей проводят с использованием моноклональных антител Ki-67 («Dako») и р53 («NovoCastra») после обработки препаратов (срезы толщиной 5 мкм, помещенные на высокоадгезивные стекла) в скороварке с целью восстановления антигенной реактивности, а также детекционной системы (вторичный комплекс) «EnVizion» («Dako»), Ставятся контрольные реакции: для позитивного контроля используется аденокарцинома толстой кишки; отрицательная реакция ставится без первичных антител.

При иммуногистохимическом исследовании долю клеток с окрашенными ядрами определяют среди 1000 клеток в участках с наибольшим содержанием «позитивных» клеток, в процентах:

1) при уровне экспрессии антигена Ki-67≤3% присваивают 1 балл, 3,1-10% - 2 балла, >10% - 3 балла;

2) при уровне экспрессии онкогена р53≤12% присваивают 1 балл, 12,1-35% - 2 балла, >35% - 3 балла.

Рассчитывают морфо-биомолекулярный показатель (У_МБП) согласно приведенной формуле: при значении У_МБП≤6,29 прогнозируют онкологическую 7-летнюю выживаемость в 100% случаев, при значении У_МБП=6,82-8,92 прогнозируют онкологическую 3-, 5- и 7-летнюю выживаемость у данной категории больных в 96,5%, 75% и 71,2% случаев соответственно, при значении У_МБП=9,19-11,55 прогнозируют онкологическую 3-, 5- и 7-летнюю выживаемость у данной категории больных в 81,8%, 54,5% и 42,4% случаев соответственно, при значении У_МБП>11,55 прогнозируют онкологическую 3-, 5- и 7-летнюю выживаемость у больных с неметастатическим светлоклеточным раком почек после нефрэктомии или резекции почки с новообразованием в 20%, 10% и 10% случаев соответственно.

При значении У_МБП≤6,29 прогноз онкологической выживаемости больных с неметастатическим светлоклеточным раком почек после нефрэктомии или резекции почки с новообразованием расценивают как благоприятный, при значении У_МБП=6,82-8,92 - как относительно благоприятный, при значении У_МБП=9,19-11,55 - как относительно неблагоприятный, при значении У_МБП>11,55 - как неблагоприятный.

Существенными отличительными признаками заявляемого способа являются:

1. При определении гистологической степени злокачественности неметастатического светлоклеточного почечно-клеточного рака у больных после нефрэктомии или резекции почки с новообразованием определяют средний диаметр ядер опухолевых клеток или наличие (или отсутствие) ядрышек в ядрах опухолевых клеток.

2. Наличие или отсутствие ядрышек в ядрах опухолевых клеток определяют при различных увеличениях микроскопа.

3. Кариометрию осуществляют при определенном минимальном числе ядер клеток светлоклеточного рака почки: 10 ядер клеток светлоклеточного рака почки - при I гистологической степени злокачественности, 20 - при II, 30 - при III и 40 - при IV гистологической степени злокачественности.

4. При значении среднего диаметра ядер опухолевых клеток ≤6 мкм или отсутствии ядрышек в ядрах опухолевых клеток, при кариометрии минимального числа ядер клеток светлоклеточного рака почки, равного 10, определяют I гистологическую степень злокачественности.

5. При значении среднего диаметра ядер опухолевых клеток 6,1-7 мкм или определении ядрышек при увеличении микроскопа ×400, при кариометрии минимального числа ядер клеток светлоклеточного рака почки, равного 20, определяют II гистологическую степень злокачественности.

6. При значении среднего диаметра ядер опухолевых клеток 7,1-8 мкм или определении ядрышек при увеличении микроскопа ×125, при кариометрии минимального числа ядер клеток светлоклеточного рака почки, равного 30, определяют III гистологическую степень злокачественности.

7. При значении среднего диаметра ядер опухолевых клеток >8 или определении ядрышек при увеличении микроскопа ×100, при кариометрии минимального числа ядер клеток светлоклеточного рака почки, равного 40, определяют IV гистологическую степень злокачественности.

8. Осуществляют иммуногистохимическое исследование, при котором определяют уровни экспрессии антигенов Ki-67 и р53.

При уровне экспрессии антигена Ki-67≤3% присваивают 1 балл, 3,1-10% - 2 балла, >10% - 3 балла.

При уровне экспрессии онкогена р53≤12% присваивают 1 балл, 12,1-35% - 2 балла, >35% - 3 балла.

9. Рассчитывают морфо-биомолекулярный показатель (У_МБП) по формуле:

У_МБП=1,83X₁+1,45Х₂+1,18Х₃,

где X₁ - гистологическая степень злокачественности опухоли (от 1 до 4); Х₂ - уровень экспрессии Ki-67 (в баллах - 1, 2 или 3); Х₃ - уровень экспрессии р53 (в баллах - 1, 2 или 3).

10. При значении У_МБП≤6,29 прогнозируют онкологическую 7-летнюю выживаемость больных с неметастатическим светлоклеточным раком почек после нефрэктомии или резекции почки с новообразованием в 100% случаев.

При значении У_МБП=6,82-8,92 прогнозируют онкологическую 3-, 5- и 7-летнюю выживаемость больных с неметастатическим светлоклеточным раком почек после нефрэктомии или резекции почки с новообразованием в 96,5%, 75% и 71,2% случаев соответственно.

При значении У_МБП=9,19-11,55 прогнозируют онкологическую 3-, 5- и 7-летнюю выживаемость больных с неметастатическим светлоклеточным раком почек после нефрэктомии или резекции почки с новообразованием в 81,8%, 54,5% и 42,4% случаев соответственно.

При значении У_МБП>11,55 прогнозируют онкологическую 3-, 5- и 7-летнюю выживаемость больных с неметастатическим светлоклеточным раком почек после нефрэктомии или резекции почки с новообразованием в 20%, 10% и 10% случаев соответственно.

11. При значении У_МБП≤6,29 прогноз онкологической выживаемости больных с неметастатическим светлоклеточным раком почек после нефрэктомии или резекции почки с новообразованием расценивают как благоприятный.

При значении У_МБП=6,82-8,92 прогноз расценивают как относительно благоприятный.

При значении У_МБП=9,19-11,55 прогноз расценивают как относительно неблагоприятный.

При значении У_МБП>11,55 прогноз расценивают как неблагоприятный.

Причинно-следственная связь между существенными отличительными признаками и достигаемым эффектом:

Установлена значительная прямая достоверная корреляция между средним диаметром ядер опухолевых клеток и наличием или отсутствием ядрышек в ядрах опухолевых клеток при различных увеличениях микроскопа (r=0,88, p<0,0001). При этом использовались различные увеличения микроскопа: при увеличении микроскопа ×100 отчетливо визуализировались ядрышки только в новообразованиях IV гистологической степени злокачественности, в опухолях III гистологической степени злокачественности отчетливая визуализация ядрышек в ядрах опухолевых клеток наблюдалась только при увеличении микроскопа ×125, а при увеличении ×100 более половина ядрышек не определялась.

Для получения достоверного результата возможна кариометрия минимального числа ядер: 10 ядер клеток светлоклеточного рака почки - при I гистологической степени злокачественности, 20 - при II, 30 - при III и 40 - при IV гистологической степени злокачественности.

При значении среднего диаметра ядер опухолевых клеток ≤6 мкм или отсутствии ядрышек в ядрах опухолевых клеток, при кариометрии минимального числа ядер клеток светлоклеточного рака почки, равного 10, определяют I степень злокачественности, при значении среднего диаметра ядер, равном 6,1-7 мкм, или определении ядрышек при увеличении микроскопа ×400, при кариометрии минимального числа ядер клеток светлоклеточного рака почки, равного 20, - II степень, при значении среднего диаметра ядер, равном 7,1-8 мкм, или определении ядрышек при увеличении микроскопа ×125, при кариометрии минимального числа ядер клеток светлоклеточного рака почки, равного 30, - III степень, и при значении среднего диаметра ядер >8 мкм или определении ядрышек при увеличении микроскопа ×100, при кариометрии минимального числа ядер клеток светлоклеточного рака почки, равного 40, определяют IV степень злокачественности (Гистологическая степень злокачественности рака почек: карио- и стереометрический анализ // Арх. пат. - 2009. - Вып.2. - С.13-18).

На основании многофакторного регрессионного анализа Кокса выживаемости больных с неметастатическим светлоклеточным раком почек были определены следующие независимые прогностические факторы (в порядке убывания значимости признака): гистологическая степень злокачественности (p<0,0002), уровень экспрессии Ki-67 (p<0,007) и уровень экспрессии р53 (p<0,05), что представлено в табл.10. Такие клинико-анатомические предикторы, как пол, возраст, индекс массы тела, pTN0M0-стадия, максимальный размер опухоли, наличие/отсутствие инвазии последней в околопочечную клетчатку и/или почечную вену, не имели прогностической значимости при оценке скорректированной выживаемости больных (p>0,05).

На основании результатов мультивариантного анализа Кокса (табл.10) была получена формула, приведенная выше, включающая в себя факторы, имеющие прогностическое значение для неметастатического светлоклеточного почечно-клеточного рака.

В соответствии с уравнением были рассчитаны морфо-биомолекулярные показатели (У_МБП) для каждого из 100 случаев неметастатического светлоклеточного рака почек. Среднее значение У_МБП для всех новообразований составило 8,15±0,28 (М±m; с пределами колебаний от 4,46 до 15,21); медиана - 7,74. Установлена умеренная прямая линейная корреляционная связь между У_МБП и pTN0M0-стадией заболевания (r=0,34, р=0,001), максимальным размером опухоли (r=0,3, р=0,002), инвазией рака в паранефральную клетчатку (r=0,31, р=0,004) и почечную вену (r=0,34, р=0,0006), а также инвазией опухоли в капсулу почки (r=0,3, р=0,003).

Силу и значимость связи между анализируемыми признаками оценивали с помощью корреляционно-регрессионного анализа. Для анализа выживаемости (по методу Каплана-Мейера) использовалась регрессионная модель пропорциональных интенсивностей Кокса (Сох D.R., 1972) (Боровиков В. Statistica. Искусство анализа данных на компьютере: для профессионалов. - 2-е изд. - СПб.: Питер, 2003. - 688 с.).

Функцию выживания (по методу Каплана-Мейера) оценивали по формуле:

S(t)=П[(n-j)/(n-j+1)^δ(j)],

где S(t) - оценка функции выживания, n - общее число событий (объем выборки), j - порядковый (хронологически) номер отдельного события, δ(j)=1, если событие означает отказ (смерть), δ(j)=0, если событие означает потерю наблюдения (индикатор цензурирования), П - произведение по всем наблюдениям j, завершившимся к моменту t.

Для анализа выживаемости использовалась регрессионная модель пропорциональных интенсивностей Кокса в виде:

h(t)=h₀(t)y(z₁,…,z_m),

где h(t) - функция интенсивности (риска), h₀(t) - базовая функция интенсивности, z - переменные (ковариаты).

Достоверность различий между кривыми выживаемости подтверждали с помощью критерия Гехана и лог-рангового теста с использованием пакета программ Statistica для Microsoft Windows, версия 6.0, StatSoft Inc., США.

Для определения точности прогностической модели использовался модифицированный коэффициент конкордации:

,

где n - объем выборки, k - максимально возможное значение признака, m - минимально возможное значение признака.

Однофакторный регрессионный анализ Кокса показал достоверное влияние на выживаемость больных с неметастатическим светлоклеточным раком почек такого фактора, как морфо-биомолекулярный показатель (У_МБП) (х²=40,8, β=0,439+0,07, t=6,34, p<0,000001).

В зависимости от значения У_МБП на основании лог-рангового теста и критерия Гехана были определены четыре группы пациентов, имевших достоверные различия в показателях выживаемости (табл.11; Приложение 5) что, в свою очередь, стало основанием (по результатам многофакторного регрессионного анализа Кокса) для создания комбинированной биомолекулярно-морфометрической модели для расчета показателей выживаемости больных с неметастатическим светлоклеточным раком почек.

Индекс (коэффициент) конкордации (CI) предлагаемой биомолекулярно-морфометрической модели для оценки прогноза у больных с неметастатическим светлоклеточным раком почек при сравнительном анализе трехлетней онкологической выживаемости с контрольной группой («внутренняя валидация») из 30 больных (после нефрэктомии по поводу неметастатического светлоклеточного рака почек, выполненной за период с 28.11.2003 г. по 28.11.2005 г.) составил 0,84 (р<0,05), что ближе к высокому уровню прогностической точности (Harrell F.E., Jr., Califf R.M., Pryor D.B. et al. Evaluating the yield of medical tests // JAMA. - 1982. - Vol.247. - P.2543-2546).

Совокупность отличительных существенных признаков является новой и позволила разработать уровни различий в показателях прогнозирования 3-, 5- и 7-летней онкологической выживаемости больных с неметастатическим светлоклеточным раком почек, что повысит точность прогноза.

В заявляемом способе не используются постоянно видоизменяющиеся классификации TNM для рака почек, что, несомненно, также повысит точность прогноза.

Примеры конкретного выполнения способа.

Пример 1: Гистологическое исследование №20461. Пациент П., 63 лет.

На патологоанатомическое исследование после нефрэктомии справа доставлена почка (с образованием) с клиническим диагнозом: опухоль верхнего полюса правой почки. Макропрепарат: почка с образованием (3×3×2,5 см) в верхнем полюсе и околопочечной жировой клетчаткой общими размерами 12×6×5,5 см.

Заключение патоморфологического исследования.

Почечно-клеточный рак верхнего полюса правой почки, светлоклеточный вариант; без инвазии в капсулу почки и метастазов в пяти лимфатических узлах; стадия pT1aN0.

С помощью окуляр-микрометра определили, что средний диаметр ядер клеток опухоли составил 6 мкм; ядрышки не определяются. Приведенные показатели соответствуют I гистологической степени злокачественности опухоли.

При иммуногистохимическом исследовании индекс экспрессии Ki-67 составил 2%, а мутантного типа гена-онкосупрессора р53 - 10%, что соответствует баллам 1 и 1 соответственно.

Подставили полученные данные в уравнение для расчета морфо-биомолекулярного показателя (У_МБП):

У_МБП=1,83×1+1,45×1+1,18×1=4,46

Таким образом, пациент имеет благоприятный прогноз для своего онкологического заболевания: 7-летняя выживаемость больных с таким морфо-биомолекулярным показателем составляет 100% (при условии отсутствия отдаленных метастазов на момент верификации диагноза).

Пример 2: Гистологическое исследование №523222. Пациентка А., 54 лет.

На патологоанатомическое исследование после нефрэктомии справа доставлена почка (с образованием) с клиническим диагнозом: опухоль средней трети левой почки. Макропрепарат: почка с околопочечной жировой клетчаткой, лимфатическими узлами (6 шт., отдельно). В средней трети почки, ближе к латеральному краю, имеется образование (6,5×6×5,5 см), прорастающее капсулу органа и врастающее в паранефральную клетчатку.

Заключение патоморфологического исследования.

Почечно-клеточный рак верхнего полюса правой почки, светлоклеточный вариант, врастающий в паранефральную жировую клетчатку; лимфатические узлы (6 шт.) без метастазов опухоли; стадия pT3aN0.

С помощью окуляр-микрометра определили, что средний диаметр ядер клеток опухоли составил 9,8 мкм; крупные базофильные ядрышки определяются при увеличении микроскопа ×100. Приведенные показатели соответствуют IV гистологической степени злокачественности опухоли.

При иммуногистохимическом исследовании индекс экспрессии Ki-67 составил 20%, а мутантного типа гена-онкосупрессора р53 - 30%, что соответствует баллам 3 и 2 соответственно.

Подставили полученные данные в уравнение для расчета морфо-биомолекулярного показателя (У_МБП):

У_МБП=1,83×4+1,45×3+1,18×2=14,03

Таким образом, пациент имеет неблагоприятный прогноз для своего онкологического заболевания: трехлетняя выживаемость больных с таким морфо-биомолекулярным показателем составляет 20%, а пяти- и семилетняя - 10%).

Было исследовано 100 случаев светлоклеточного варианта неметастатического почечно-клеточного рака стадий рТ1а-T3bN0M0 (по системе pTNM, 2002), по 20 случаев каждого из указанных анатомических распространений поражения, после нефрэктомии, выполненной в Городской многопрофильной больнице №2 за период с 4 февраля 1999 г. по 28 ноября 2003 г.

Таким образом, впервые разработаны уровни различий в показателях прогнозирования 3-, 5- и 7-летней онкологической выживаемости больных с неметастатическим светлоклеточным раком почек, что повысит точность прогноза.

В заявляемом способе не используются постоянно видоизменяющиеся классификации TNM для рака почек, что, несомненно, также повысит точность прогноза.

Коэффициент конкордации заявляемого способа составил 0,84 (р<0,05), что ближе к высокому уровню прогностической точности. Коэффициент конкордации (CI) для способа Frank I. et al. (способ-прототип) составляет 0,83.

Таблица 1 Прогнозирование безрецидивной выживаемости у больных с неметастатическим светлоклеточным раком почек (по Leibovich В. и соавт., 2003) Переменные   Очки Т-стадия рТ1а 0 pT1b 2 рТ2 3 рТ3а 4 pT3b 4 рТ3с 4 рТ4 4 N-стадия pNx 0 pN0 0 pN1 2 pN2 2 Размер опухоли (см) <10 0 >10 1 Гистологическая степень злокачественности 1 0 2 0 3 1 4 3 Некроз Отсутствие 0 Наличие 1

Таблица 2 Оценка прогноза 10-летней безрецидивной выживаемости пациентов с неметастатическим светлоклеточным раком почек (по Leibovich В. и соавт., 2003) Количество баллов 0-1 2 3 4 5 6 7 ≥8 Выживаемость (в %) 96,1 88,5 78,6 63,2 54,8 29,8 24,7 10,2

Таблица 3 Шкала оценки состояния (общего статуса) пациента (ECOG PS) 0 Активный образ жизни, в состоянии вести такой же образ жизни, как и до болезни 1 Не может выполнять работу, требующую больших физических усилий, но может заниматься легким трудом или сидячей работой. Не требует постоянного пребывания в стационаре 2 В состоянии обслуживать себя сам, но не может работать. Сидит в кресле или лежит в постели менее 50% от времени бодрствования. Не требует постоянного пребывания в стационаре 3 Не в состоянии обслуживать себя. Лежит в постели/сидит в кресле более 50% от времени бодрствования 4 Полная инвалидизация. Полная неспособность обслуживать себя. Прикован к постели 5 Летальный исход

Таблица 4 Оценка степени риска у пациентов с неметастатическим раком почек (UCLA Integrated Staging System) Т-стадия 1 2 3 4 Grade 1-2 3-4 1 >1 Соматический статус ECOG 0 ≥1 0 ≥1 0 ≥1 0 ≥1 Риск Низкий Промежуточный Высокий

Таблица 5 Оценка степени риска у пациентов с метастатическим раком почек (UCLA Integrated Staging System) TNM N1M0 N2M0/M1 Grade 1 2 3 4 Соматический статус ECOG 0 ≥1 0 ≥1 0 ≥1 0 ≥1 Риск Низкий Промежуточный Низкий Промежуточный Высокий

Таблица 6 Прогнозируемая 5-летняя выживаемость пациентов с неметастатическим раком почек (UCLA Integrated Staging System) Риск Общая выживаемость Онкологическая выживаемость Безрецидивная выживаемость Низкий 83,8% 91,1% 91,4% Промежуточный 71,9% 80,4% 64% Высокий 44% 54,7% 37,3%

Таблица 7 Прогнозируемая 2-летняя выживаемость пациентов с метастатическим раком почек (UCLA Integrated Staging System) Риск Общая выживаемость Онкологическая выживаемость Низкий 63% 65% Промежуточный 40,5% 40,9% Высокий 10,1% 10,5%

Таблица 8 Прогнозирование онкологической выживаемости у больных со светлоклеточным раком почек (по Frank I. и соавт., 2002) Переменные   Очки Т-стадия рТ1а 0 pT1b 0 рТ2 1 рТ3а 2 pT3b 2 рТ3с 2 рТ4 0 N-стадия pNx 0 pN0 0 pN1 2 pN2 2 М-стадия pM0 0 pM1 4 Размер опухоли (см) <5 0 ≥5 2 Гистологическая степень злокачественности 1 0 2 0 3 1 4 3 Некроз (-) 0 (+) 2

Таблица 9 Оценка прогноза 10-летней онкологической выживаемости пациентов со светлоклеточным раком почек (по Frank I. и соавт., 2002) Количество баллов 0-1 2 3 4 5 6 7 8 9 ≥10 Выживаемость (в %) 97,1 85,3 77,9 66,2 50 38,8 28,1 12,7 14,8 4,6

Таблица 10 Влияние морфологических и биомолекулярных факторов на выживаемость больных с неметастатическим светлоклеточным раком почек (по результатам многофакторного регрессионного анализа) Факторы β Стандартная ошибка t p Гистологическая степень злокачественности 1,8251 0,4822 3,7847 0,000154 Уровень экспрессии Ki-67 1,4526 0,5374 2,7032 0,006872 Уровень экспрессии р53 1,1812 0,4597 2,5692 0,010197 Примечание. Для всей модели: χ²=77,28; df=16; р<0,000001

Таблица 11 Зависимость выживаемости больных с неметастатическим светлоклеточным раком почек от значений морфо-биомолекулярных показателей Группа Показатель (У_МБП) Доля выживших (%) p-уровни различий между группами Период наблюдения (годы) I-II I-III I-IV II-III II-IV III-IV 3 5 7 I ≤6,29 100 100 100 ** *** *** * *** * II 6,82-8,92 96,5 75 71,2 III 9,19-11,55 81,8 54,5 42,4 IV >11,55 20 10 10 Примечания. 1. Звездочки - достоверность различий: * - р<0,05, ** - р<0,01, *** - р<0,0001. 2.I - прогноз благоприятный, II - прогноз относительно благоприятный, III - прогноз относительно неблагоприятный, IV - прогноз неблагоприятный.

Изобретение относится к области медицины, а именно к онкологии, и может использоваться для прогнозирования онкологической 3-, 5- и 7-летней выживаемости больных с неметастатическим светлоклеточным раком почек после нефрэктомии или резекции почки с новообразованием. Для этого проводят иммуногистохимическое исследование и патоморфологическое исследование операционного материала. Определяют уровень экспрессии антигена Ki-67 и уровень экспрессии мутантного типа онкогена р53. Определяют средний диаметр ядер опухолевых клеток или наличие или отсутствие ядрышек в ядрах опухолевых клеток, причем наличие или отсутствие ядрышек в ядрах опухолевых клеток определяют при различных увеличениях микроскопа, а кариометрию осуществляют при определенном минимальном числе ядер клеток светлоклеточного рака почки. Прогноз онкологической выживаемости осуществляют с помощью формулы:

у_мбп=1,83Х₁+1,45Х₂+1,18Х₃,

где у_мбп - морфо-биомолекулярный показатель; X₁ - гистологическая степень злокачественности опухоли в баллах; X₂ - уровень экспрессии Ki-67 в баллах; Х₃ - уровень экспрессии р53 в баллах. При этом гистологическую степень злокачественности опухоли определяют по значению среднего диаметра ядер опухолевых клеток или наличию или отсутствию ядрышек в ядрах опухолевых клеток. При значении у_умб≤6,29 прогноз онкологической выживаемости больных расценивают как благоприятный, при у_мбп=6,82-8,92 - как относительно благоприятный, при у_мбп=9,19-11,55 - как относительно неблагоприятный, при у_мбп>11,55 - как неблагоприятный. 5 ил., 11 табл.

Способ прогнозирования онкологической выживаемости больных с неметастатическим светлоклеточным раком почек после нефрэктомии или резекции почки с новообразованием, заключающийся в патоморфологическом исследовании операционного материала после нефрэктомии или резекции почки с новообразованием, отличающийся тем, что дополнительно проводят иммуногистохимическое исследование и определяют уровень экспрессии антигена Ki-67, а также уровень экспрессии мутантного типа онкогена р53, а при патоморфологическом исследовании операционного материала определяют средний диаметр ядер опухолевых клеток или наличие или отсутствие ядрышек в ядрах опухолевых клеток, причем наличие или отсутствие ядрышек в ядрах опухолевых клеток определяют при различных увеличениях микроскопа, а кариометрию осуществляют при определенном минимальном числе ядер клеток светлоклеточного рака почки, так при значении среднего диаметра ядер опухолевых клеток ≤6 мкм или отсутствии ядрышек в ядрах опухолевых клеток, при кариометрии минимального числа ядер клеток светлоклеточного рака почки, равного 10, определяют I гистологическую степень злокачественности, при значении среднего диаметра ядер, равном 6,1-7 мкм, или определении ядрышек при увеличении микроскопа ×400, при кариометрии минимального числа ядер клеток светлоклеточного рака почки, равного 20, - II степень, при значении среднего диаметра ядер, равном 7,1-8 мкм, или определении ядрышек при увеличении микроскопа ×125, при кариометрии минимального числа ядер клеток светлоклеточного рака почки, равного 30, - III степень, и при значении среднего диаметра ядер >8 мкм или определении ядрышек при увеличении микроскопа ×100, при кариометрии минимального числа ядер клеток светлоклеточного рака почки, равного 40, определяют IV степень гистологической злокачественности; уровню экспрессии Ki-67≤3% присваивают 1 балл, 3,1-10% - 2 балла, >10% - 3 балла; уровню экспрессии р53≤12% присваивают 1 балл, 12,1-35% - 2 балла, >35% - 3 балла; прогноз онкологической выживаемости осуществляют с помощью формулы:
у_мбп=1,83Х₁+1,45Х₂+1,18Х₃,
где у_мбп - морфо-биомолекулярный показатель; X₁ - гистологическая степень злокачественности опухоли; Х₂ - уровень экспрессии Ki-67 в баллах; Х₃ - уровень экспрессии р53 в баллах, причем гистологическую степень злокачественности опухоли определяют по значению среднего диаметра ядер опухолевых клеток или наличию или отсутствию ядрышек в ядрах опухолевых клеток; и при значении у_мбп≤6,29 прогнозируют онкологическую 7-летнюю выживаемость у больных с неметастатическим светлоклеточным раком почек после нефрэктомии или резекции почки с новообразованием в 100% случаев, при значении у_мбп 6,82-8,92 прогнозируют онкологическую 3-, 5- и 7-летнюю выживаемость у данной категории больных в 96,5%, 75% и 71,2% случаев соответственно, при значении у_мбп 9,19-11,55 прогнозируют онкологическую 3-, 5- и 7-летнюю выживаемость у данной категории больных в 81,8%, 54,5% и 42,4% случаев соответственно, при значении у_мбп>11,55 прогнозируют онкологическую 3-, 5- и 7-летнюю выживаемость у данной категории больных в 20%, 10% и 10% случаев соответственно; при значении у_мбп≤6,29 прогноз онкологической выживаемости больных с неметастатическим светлоклеточным раком почек после нефрэктомии или резекции почки с новообразованием расценивают как благоприятный, при значении у_мбп=6,82-8,92 - как относительно благоприятный, при значении у_мбп=9,19-11,55 - как относительно неблагоприятный, при значении у_мбп>11,55 - как неблагоприятный.