ШТАММ ГИБРИДНЫХ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ КЛЕТОК ЖИВОТНЫХ Mus musculus 1E6 - ПРОДУЦЕНТ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ, СПЕЦИФИЧНЫХ К СПОРАМ Bacillus anthracis Российский патент 2012 года по МПК C12N5/18 C12P21/08 C07K16/12 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для специфичного обнаружения спор Bacillus anthracis.

Возбудитель сибирской язвы обладает способностью образовывать споры, высоко устойчивые во внешней среде, что обуславливает не только его дальнейшее сохранение в анабиотическом состоянии в природе, но и возможность размножаться и накапливаться в почве. Эта особенность споровой формы B. anthracis способствует созданию долговременных активных почвенных очагов и потенциально опасных территорий, что приводит к постоянной угрозе заражения. Несмотря на значительное количество методов усовершенствования лабораторной диагностики сибирской язвы, эта задача до сих пор не решена в достаточной мере.

Для индикации биологических патогенов успешно применяются иммунохимические методы определения. В том числе такие современные высокоспецифичные тесты, как иммуноферментный анализ (ИФА), латекс-агглютинация, дот-блот анализ, иммуноблоттинг и иммуномагнитная сепарация.

Основой для всех вариантов иммуноанализа являются антитела. Специфичность иммунологических реакций находится в прямой зависимости от специфичности антитела, используемого для приготовления диагностического препарата. Диагностикумы, приготовленные на основе МКА, строго специфичны, поскольку направлены на выявление одного антигена.

Поэтому одним из важных подходов в обнаружении спор сибирской язвы в объектах внешней среды является использование МКА, продуцируемых гибридомами.

Получение гибридом, продуцентов высоко специфических МКА к спорам B. anthracis - чрезвычайно сложная задача. Споры B. anthracis обладают дополнительным слоем - экзоспориумом, который присутствует также и у некоторых других близкородственных бацилл, таких как Bacillus cereus и Bacillus thuringiensis. Экзоспориумы этих бактерий сходны по структуре и обладают высокой степенью гомологии [1]. В своем составе экзоспориум содержит более 130 различных антигенов, представляющих собой сложную смесь из белков, липидов и углеводов. Один из основных антигенов экзоспориума - коллагеноподобный гликопротеин BclA (Bacillus collagen-like protein of anthracis). По данным литературы BclA является иммунодоминантным антигеном экзоспориума B. anthracis, т.е. большинство антител, вырабатываемых против спор, взаимодействуют с BclA [2].

Известны штаммы гибридом (например, гибридома ЕА-4-10-4), продуцирующие моноклональные антитела, полученные к спорам штамма B. anthracis Sterne, которые взаимодействовали с очищенным рекомбинантным BclA [2].

Однако последовательности BclA у близкородственных бацилл (B. anthracis, B. cereus и B. thuringiensis) гомологичны [3], что может привести к ложно-положительным результатам выявления спор сибирской язвы при использовании антител к этому белку.

Задача изобретения - получение штамма гибридных культивируемых клеток, продуцирующих моноклональные антитела, специфичные к спорам B. anthracis, но не взаимодействующие с BclA и пригодные для конструирования на их основе тест-систем для выявления возбудителя сибирской язвы в споровой форме.

Поставленная задача решается тем, что предложен новый штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus 1E6 - продуцент высокоспецифичных моноклональных антител к спорам B. anthracis, которые не взаимодействуют с рекомбинантным BclA.

Техническим результатом изобретения является успешное использование моноклональных антител, продуцируемых предлагаемым штаммом, для специфического выявления спор B. anthracis методами латекс-агглютинации (пример 8) и иммуномагнитной сепарации с последующим иммуноферментным анализом (пример 9) с чувствительностью 2×10⁶ и 1×10³ спор в одном мл соответственно.

Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus 1E6 - продуцент высокоспецифичных моноклональных антител к спорам B. anthracis депонирован в коллекции микроорганизмов Федерального государственного учреждения науки Государственного научного центра прикладной микробиологии и биотехнологии (ФГУН ГНЦ МПБ) коллекционный номер - Н10.

Штамм гибридомы получали путем иммунизации мышей линии BALB/c. Мышей иммунизировали по общепринятой методике путем двукратного, с тридцатидневной экспозицией, подкожного введения инактивированных спор штамма B. anthracis СТИ-1. На третьи сутки после последней бустер-инъекции проводили гибридизацию спленоцитов иммунных мышей (1×10⁸ клеток) с клетками мышиной миеломы Р3-Х63 Ag/8-653 (1×10⁷ клеток). В качестве агента для слияния применяли полиэтиленгликоль (Sigma, США). После гибридизации проводили селекцию, скрининг, клонирование и криоконсервацию гибридомы.

Характеристика гибридомы 1E6

Морфологическая характеристика. Культура гибридных клеток состоит из слабоприкрепленных к подложке округлых клеток размером с исходную миеломную клетку.

Культуральные свойства. Культивирование штамма гибридомы 1Е6 ведут при температуре 37°С в атмосфере, содержащей 5% углекислого газа. Средой культивирования является среда RPMI - 1640, содержащая 20% эмбриональной телячьей сыворотки, 2 мМ/L-глутамина, 100 мкг/мл гентамицина.

Клетки культивируют в виде стационарной суспензии в пластиковых матрацах "Costar". Пассирование клеток гибридомы проводят 2 раза в неделю с кратностью разведения 1:2-1:3. Посевная концентрация клеток составляет 1×10⁵ в 1 мл среды. Максимальная концентрация гибридных клеток при культивировании составляет 1×10⁵ на 1 мл среды. Гибридный клон не теряет способности синтеза антител при 10 пассажах in vitro (срок наблюдения).

Культивирование гибридомы в организме животного. Мышей линии BALB/c 20-ти недельного возраста обрабатывали пристаном (Sigma, США) по 0,5 мл внутрибрюшинно и через 2-3 недели интраперитонеально вводили по 1×10¹⁰ гибридных клеток. Появление иммуноасцитов регистрировали на 7-15 сутки, отбор иммуноасцитической (ИАЖ) жидкости производили на 10-21 сутки. Синтез иммуноглобулина, продуцируемого гибридомой, определяли методом непрямого ИФА [4].

Характеристика полезного продукта. Гибридома 1Е6 продуцирует специфичные моноклональные антитела к спорам B. anthracis, титр которых составляет в культуральной жидкости (КЖ) 1:1000, в ИАЖ 1:1000000. Моноклональные антитела из КЖ и ИАЖ выделяли путем аффинной хроматографии на колонке с белком G-сефарозой (Protein G Sepharose 4 Fast Flow). Чистоту полученных иммуноглобулиновых фракций оценивали в SDS-PAGE-электрофорезе в денатурирующих условиях. Концентрацию иммуноглобулинов определяли спектрофотометрически при длине волны 280 нм (спектрофотометр Smart Spec Plus, BIO RAD, США).

Продуктивность штамма. Продукция МКА в среде культивирования составляет 20-50 мкг/мл, в асцитической жидкости - 5-10 мг/мл. Продукция МКА в культуральной жидкости сохраняется на протяжении 10 пассажей (срок наблюдения) и 5 пассажей при культивировании в виде асцитных опухолей на мышах (срок наблюдения).

Контаминация штамма. Контаминанты гибридной линии, включая бактерии, дрожжи, грибы, не выявлены. Микоплазмы не определяли.

Криоконсервация. Среда замораживания содержит эмбриональной телячьей сыворотки - 90%, диметилсульфоксида - 10%.

Режим криоконсервации и отогрева. Гибридные клетки вносят в криопробирки, помещают в контейнер из пенопласта с толщиной стенок не менее 1 см и оставляют на 16-24 часа в кельвинаторе при температуре -70°С и затем опускают в жидкий азот.

Размораживание проводят быстро на водяной бане при температуре 37°С.

Ампулы содержат 1,0 мл криозащитной среды с концентрацией гибридных клеток 1×10⁶. Жизнеспособность восстанавливаемых гибридом после криоконсервации составляет 75-85%.

Свойства полезного продукта. Гибридома продуцирует моноклональные антитела, относящиеся к lgG1 подклассу иммуноглобулинов мыши, константа аффинности МКА 1Е6 - 3,9×10^-8 М. МКА специфичны к спорам B. anthracis.

Изобретение иллюстрируется следующими графическими материалами.

Фиг.1 - Дот-блот анализ МКА 1Е6 с клетками гетерологичных микроорганизмов.

Фиг.2 - Дот-блот с МКА 1Е6. Определение неспецифической активности в отношении споророобразующих представителей рода Bacillus.

Фиг.3 - Дот-блот анализ МКА 1Е6 со спорами штаммов B. anthracis. Определение специфической внутривидовой (B. anthracis) активности.

Фиг.4 - SDS-PAGE электрофорез МКА 1Е6.

Фиг.5 - Определение подклассовой принадлежности МКА 1Е6.

Фиг.6 - Иммуноблоттинг МКА 1Е6 с рекомбинантным гликопротеином BclA экзоспориума штамма B. anthracis СТИ-1.

Для лучшего понимания сущности изобретения ниже следуют примеры его конкретного выполнения.

Пример 1. Получение гибридомы 1Е6

Иммунизацация

Мышей линии BALB/c иммунизируют спорами штамма B. anthracis СТИ-1 по следующей схеме:

- подкожное введение мышам инактивированных спор в концентрации 1×10⁷ спор в полном адъюванте Фрейнда;

- через 30 суток повторное введение мышам инактивированных спор в концентрации 1×10⁷ спор в неполном адъюванте Фрейнда;

- через 30 суток внутривенная инъекция мышам инактивированных спор в концентрации 1×10⁷ спор в физиологическом растворе.

Кровь у иммунных мышей отбирают на третий день после последней инъекции инактивированными спорами в концентрации 1×10⁷ спор согласно Animal protocol №Р 02-19 стр.7.

Титры специфических антител в сыворотках животных определяют с помощью непрямого твердофазного ИФА.

Гибридизация

Через 3 суток после последней внутривенной инъекции извлекают селезенку мыши и проводят гибридизацию 1×10⁸ спленоцитов мыши с 1×10⁷ клетками миеломной линии РЗ-Х63 Ag/8-653 в присутствии 1 мл полиэтиленгликоля (SIGMA, США) в течение 1 минуты.

Селекция

После отмывки полиэтиленгликоля клетки высевают на 96-луночныс планшеты на слой перитонеальных макрофагов, взятых у мышей линии BALB/c. Селекцию гибридных клеток проводят на селективной среде с содержанием гипоксантина-аминоптерина-тимидина (HAT). Через 21 сутки из среды убирают аминоптерин. В последующем культивирование проводят на среде RPMI - 1640 "Sigma" с 20% эмбриональной телячьей сыворотки, 2 мM/L-глутамина, 100 мкг/мл гентамицина.

Скрининг гибридных клонов

Для отбора положительных гибридных клонов, продуцирующих МКА, используют непрямой твердофазный ИФА.

Для проведения непрямого варианта ИФА в лунки 96-луночного полистиролового планшета для иммуноферментного анализа вносят по 1×10⁶ спор/лунку штамма B. anthracis СТИ-1 и выдерживают при температуре 65°С в течение 3 ч. Затем в лунки планшета вносят 25 мкл 96° С₂Н₅ОН и выдерживают при температуре 65°С в течение 25 минут. Далее вносят в лунки по 160 мкл 0,5% раствора бычьего сывороточного альбумина (БСА), проверенного на отсутствие пероксидазной активности и инкубируют при температуре 37°С в течение 1 часа. Три раза отмывают фосфатно-солевым буфером рН 7.4, содержащим 0,5% твин-20 (ФСБ-Т), вносят в лунки супернатант культуральной жидкости в объеме 100 мкл и инкубируют при температуре 37°С в течение 1 часа. После этого лунки планшета трижды отмывают раствором ФСБ-Т и добавляют в лунки пероксидазный конъюгат к целой молекуле IgG мыши (Sigma, США) в рабочем разведении. Планшет инкубируют при температуре 37°С в течение 1 часа, затем 6 раз отмывают лунки раствором ФСБ-Т. После этого в лунки вносят по 100 мкл субстрат-индикаторного раствора (10 мкл 30% H₂O₂ и 8 мг ортофенилендиамина на 10 мл фосфатно-цитратного буфера рН 5,0). Положительную реакцию оценивают по появлению желто-коричневого окрашивания раствора. Реакцию останавливают добавлением в лунки по 50 мкл 4N серной кислоты. Учет результатов проводят на фотометре (фотометр Пикон, РФ) для ИФА при длине волны 492 нм.

Клонирование

Клонирование гибридных клеток проводят методом лимитирующих разведении в 96-луночных планшетах на слое перитонсальных макрофагов из расчета 1×10⁴ клеток на лунку. Скрининг клонов проводят непрямым твердофазным ИФА, как описано выше.

Культивирование

Культивирование клонов гибридомы ведут при температуре 37°С в атмосфере, содержащей 5% углекислого газа. Средой культивирования является среда RPMI - 1640, содержащая 20% эмбриональной телячьей сыворотки, 2 мМ/L-глутамина, 100 мкг/мл гентамицина.

Криоконсервация

Клоны гибридомы криоконсервируют на среде замораживания, состоящей из эмбриональной телячьей сыворотки - 90%, диметилсульфоксида - 10%. Клоны гибридомы хранят в сосудах Дюара с жидким азотом.

Пример 2. Определение неспецифической активности в отношении микробных клеток других микроорганизмов методом дот-блот анализа

Для проведения данного исследования используют панель из 22 штаммов микроорганизмов Y. pestis EV, Klebsiella pneumoniae 963, Y. enterocolitica 287, Fr. tularensis 15, Str. pneumonia 7465, Str. pyogenes 8198, Staphylococcus epidermidis 11047, Pseudomonas aeruginosa 10662, Legionella micadadeis 11371, Pasterella multocida 10322, М. tuberculosis H-37RV, С. jejuni ATCC 11168, Listeria monocytogenes, Brucella abortus вак. шт.19, Salm. paratyphi, Salm. typhimurium, Salm. Paratyphi A, Salm. enteritidis 204, Y. pseudotuberculosis, E. coli IM83, V. cholerae инаб А25, V. cholerae Огава.

В качестве положительного контроля используют споры штаммов B. anthracis СТИ-1 и М71. На нитроцеллюлозную мембрану (GE Water & Process Technologies, США) с помощью прибора BIO-DOT (BIO RAD, США) сорбируют инактивированные микробные клетки в концентрациях от 1×10⁵ до 1×10⁷ спор/мл. Штаммы микроорганизмов были получены из коллекции микроорганизмов ФГУН ГНЦ ПМБ. Далее мембраны блокируют раствором инертного белка и последовательно инкубируют с МКА гибридомы 1Е6 и пероксидазным конъюгатом к целой молекуле IgG мыши (Sigma, США). Визуализацию реакции проводят раствором субстратной смеси на основе диаминобензидина (0.05% диаминобснзидин (Sigma, США), 0.015% H₂O₂, 0.01 М фосфатно-солевой буфер, рН 7.4). Реакцию останавливают промывкой дистиллированной водой.

Как показал проведенный анализ, МКА гибридомы 1Е6 не проявляют перекрестную активность с микробными клетками других микроорганизмов (дорожки с 1 по 22) и взаимодействуют только со спорами B. anthracis (дорожки 23 и 24) (фиг.1).

Проверка специфичности МКА.

Пример 3. Дот-блот. Определение неспсцифической активности в отношении спорообразующих представителей рода Bacillus

Для проведения анализа на нитроцеллюлозную мембрану (GE Water & Process Technologies, США) с помощью прибора BIO-DOT (BIO RAD, США) сорбируют инактивированные споры бацилл в концентрациях от 1×10⁵ до 1×10⁷ спор/мл. В работе используют 21 штамм близкородственных споровых сапрофитов рода Bacillus (B. pantothenticus В-1398, B. larvae В-1400, B. polymyxa В-1559, B. thuringiensis В-214, B. natto В-193, B. alvei В-1555, B. brevis B-1567, B. megaterium В-1435, B. licheniformis B-1411, B. subtilis В-1405, B. antracoides В-217, B. pasteurii В-1962, B. cereus В-160, B. sphaericus В-1152, B. maceraus В-1410, B. species В-1967, B. azotoformaus В-1956, B. pulvifaciens В-1402, B. firmus В-1994, B. laterosporus В-1404, B. pumilis В-5007). Штаммы микроорганизмов были получены из коллекции микроорганизмов ФГУН ГНЦ ПМБ. Далее мембраны блокируют раствором инертного белка и последовательно инкубируют с МКА 1Е6 и пероксидазным конъюгатом к целой молекуле IgG мыши (Sigma, США). Визуализацию реакции проводят раствором субстратной смеси на основе диаминобензидина (0.05% диаминобензидин (Sigma, США), 0.015% H₂O₂, 0.01 М фосфатно-солевой буфер, рН 7.4).

В качестве положительного контроля используют споры штаммов B. anthracis СТИ-1 и B. anthracis М-71.

В результате проведенного анализа было установлено, что МКА гибридомы 1Е6 взаимодействуют только со спорами B. anthracis в концентрации 1×10⁵ спор/мл (дорожки 22 и 23) и не проявляют неспецифической активности по отношению к спорам других бацилл (дорожки с 1 по 21) (фиг.2).

Пример 4. Определение специфической внутривидовой (B. anthracis) активности

Для проведения анализа, на нитроцеллюлозную мембрану (GE Water & Process Technologies, США) с помощью прибора BIO-DOT (BIO RAD, США) сорбируют инактивированные споры бацилл в концентрациях от 1×10⁵ до 1×10⁷ спор/мл. В работе используют: 2 вакцинных (B. anthracis СТИ-1, B. anthracis - 34F2), 4 аттенуированных штамма (B. anthracis М-71, B. anthracis М-71/12, B. anthracis 228/8, B. anthracis 220). Штаммы микроорганизмов были получены из коллекции микроорганизмов ФГУН ГНЦ ПМБ. Далее мембраны блокируют раствором инертного белка и последовательно инкубируют с МКА гибридомы 1Е6 и пероксидазным конъюгатом к целой молекуле IgG мыши (Sigma, США). Визуализацию реакции проводят раствором субстратной смеси на основе диаминобензидина (0.05% диаминобензидин (Sigma, США), 0.015% H₂O₂, 0.01 М фосфатно-солевой буфер, рН 7.4)

Отрицательный контроль - мембраны, обработанные сывороткой интактной мыши в разведении 1/1000.

В результате проведенного анализа было установлено, что МКА гибридомы 1Е6 взаимодействуют со всеми спорами исследуемых штаммов B. anthracis (дорожки со 2 по 7) (фиг.3).

Пример 5. Выделение и очистка МКА гибридомы 1Е6

Выделение МКА из асцитической жидкости проводят путем аффинной хроматографии на колонке с белком G-ссфарозой (Protein G Sepharose 4 Fast Flow). Клеточные компоненты из культуральной и асцитической жидкостей удаляют центрифугированием (2000 g × 20 мин), рН культуральной жидкости доводят до 8.6 при помощи 1 N раствора NaOH, асцитическую жидкость разводят 1:1 посадочным буфером (0.05 М трис, 0.15 М NaCl, 0.02% NaN₃, рН 8.6). Колонку уравновешивают посадочным буфером и проводят нанесение образцов со скоростью 10 мл/час при комнатной температуре. После нанесения образцов колонку отмывают от не связавшихся компонентов и проводят элюцию иммуноглобулинов 0.05 М глициновым буфером, 0.15 М NaCl, рН 2.3. Контроль выхода фракции иммуноглобулинов осуществляют при помощи УФ-детектора ("Pharmacia LKB", Швеция).

Выделенные иммуноглобулины концентрируют осаждением при помощи сухого сульфата аммония (до 50% насыщения) и переводят в фосфатно-солевой буферный раствор методом гель-фильтрации на колонке с сефадексом G-25 (PD-10, "Pharmacia LKB", Швеция) емкостью 10 мл. Чистоту полученных иммуноглобулиновых фракций оценивают в SDS-PAGE-электрофорезе в денатурирующих условиях.

В результате были получены очищенные препараты иммуноглобулинов (фиг.4).

Пример 6. Определение подклассовой принадлежности МКА гибридомы 1Е6

Подклассы полученных МКА определяют с помощью набора для определения изотипов мышиных моноклональных антител (Roche Diagnostic Corporation, США). В культуральную жидкость объемом 500 мкл погружают иммунохроматографическую полоску для определения изотипов мышиных моноклональных антител не глубже чем на 1,5 см на 5 минут. После проявления контрольной полосы и полосы, соответствующей тестируемым Ig, определяют с помощью контрольной иммунохроматографической полоски (прилагается к набору для определения изотипов мышиных моноклональных антител) подкласс антител.

Определение подкласса МКА, продуцируемых гибридомой 1Е6, показало, что моноклональные антитела относятся к lgG1 подклассу иммуноглобулинов (фиг.5).

Пример 7. Иммуноблоттинг МКА гибридомы 1Е6 с рекомбинантным гликопротсином BclA экзоспориума штамма B. anthracis СТИ-1

Для проверки специфичности МКА гибридомы 1Е6 к рекомбинантному гликопротеину BclA экзоспориума штамма B. anthracis СТИ-1 проводят SDS-PAGE-электрофорсз в 10% полиакриламидном геле (ПААГ) в течение 1 часа при 220 в, 20 мА. Белки из ПААГ переносят на нитроцеллюлозную мембрану (GE Water & Process Technologies, США) в течение 1 часа при силе тока 380 мА. После завершения переноса мембрану блокируют, погружая в 1% раствор БСА в ФСБ рН 7,4 на 1 час при комнатной температуре. Для промывок мембран используют ФСБ-Т рН 7,4. Блокированные и промытые мембраны разрезают на полосы и инкубируют каждую полосу отдельно в растворах МКА гибридомы 1Е6, с Anti-His antibody (Sigma, США) и сывороткой интактной мыши 1 час при температуре 37°С. Далее, после промывки буфером, полоски инкубируют с пероксидазным конъюгатом к суммарной фракции Ig мыши (Sigma, США) в рабочем разведении при тех же условиях, промывают ФСБ-Т. Визуализацию реакции проводят раствором субстратной смеси на основе диаминобензидина (0.05% диаминобензидин (Sigma, США), 0.015% H₂O₂, 0.01 М фосфатно-солевой буфер - ФСБ, рН 7.4). Реакцию останавливают промывкой дистиллированной водой.

Отрицательный контроль - сыворотка интактной мыши в разведении 1/1000. Положительный контроль Anti-His antibody (Sigma, США).

Моноклональные антитела, продуцируемые гибридомой 1Е6, не взаимодействуют в иммуноблоте с рекомбинантным гликопротеином Вс1А экзоспориума штамма B. anthracis СТИ-1 (фиг.6).

Пример 8. Обнаружение спор Bacillus anthracis в реакции латекс-агглютинации

Для постановки реакции латекс-аглютинации (РЛА) используют латексные частицы А-63-21 (Институт биоорганической химии им. акад. М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН, Москва) и МКА гибридомы 1Е6. Синтезированные монодисперсные акролеиновые частицы имели средний диаметр 1180 нм. Иммобилизацию МКА на латексных частицах проводят согласно протоколу производителя: к 50 мкл 10% латексной суспензии добавляют 100 мкл МКА гибридомы 1Е6 с концентрацией 1 мг/мл, доводят объем до 0,5 мл и инкубируют 2 часа при комнатной температуре и перемешивании. Для блокировки не прореагировавших групп добавляют 4 мл 1% раствора овальбумина (Sigma, США) в 0,1 М боратном буфере (ББ), рН 8,2. От не связавшихся МКА латексные частицы отмывают в ББ трехкратным 10-минутным центрифугированием при 1200 g. Осадок ресуспендируют в 5 мл ББ с 1% овальбумином.

Реакцию латекс-агглютинации проводят в круглодонных 96-луночных планшетах с U-образным профилем лунок (фирма Пан Эко, Россия). В качестве контрольных штаммов используют споры штаммов: B. anthracis 71/12, B. anthracis М-71, B. anthracis СТИ-1. Для контроля специфичности используют штаммы B. licheniformis В-1411, B. subtilis В-1405, B. antracoides В-217, B. megaterium В-1435, B. cereus 160. В качестве отрицательного контроля используют 0,1 М боратный буфер, рН 8,2.

Разведения спор штаммов микроорганизмов с шагом 2 готовят в объеме 25 мкл в круглодонных 96-луночных планшетах в боратном буфере. После добавления во все лунки по 25 мкл латексных частиц с иммобилизованными МКА гибридомы 1Е6 планшет встряхивают и инкубируют 1,5-2,0 часа при комнатной температуре.

Учет результатов проводят визуально по четырехкрестной системе на светлом фоне при хорошем освещении.

4+ - все частицы латекса агглютинированы, равномерно покрывают дно лунки, образуя «зонтик».

3+ - агглютинированы почти все частицы латекса, что выражается в уменьшении диаметра «зонтика».

2+ - агглютинирована половина латексных частиц.

1+ - большинство частиц не агглютинировано и осело на дно лунки, но диаметр «пуговицы» пока еще отличается от «точки».

«-» - признаков агглютинации нет, латексные частицы осели на дно лунки в виде «точки» ярко синего цвета в центре лунки.

Положительной считается реакция, оцениваемая не менее чем на 3+.

В результате проведенной реакции латекс-агглютинации было установлено, что латексные частицы с иммобилизованными МКА 1Е6 выявляют споры штаммов сибирской язвы в концентрации 4,5×10⁵-1,8×10⁶ спор/мл и не выявляют гетерологичные культуры рода Bacillus в концентрации 2×10⁸ спор/мл и ниже (фиг.7).

Пример 9. Выявление спор Bacillus anthracis методом ИФА с использованием магнитных частиц с иммобилизованными МКА гибридомы 1Е6.

Для постановки ИФА с использованием магнитных частиц используют магноиммуносорбенты (МИС), разработанные по методике, описанной в изобретении (Пат. РФ. №2138813, G-01, №33/543, от 27.09.99. Бюл. №27). Активацию магнитных частиц проводят методом окисления с использованием натрия перхлората (ХимМед, РФ) следующим образом: к 0,5 г магнитных частиц приливают 3 мл дистиллированной воды, содержащей 0,20 г натрия перхлората. Инкубируют при температуре (22±4)°С в течение 1 часа в темноте. Затем магнитные частицы отмывают забуференным физиологическим раствором (ЗФР) до отсутствия величины экстинции на спектрофотометре при длине волны 280 нм. Иммобилизацию МКА гибридомы 1Е6 на магнитных частицах проводят следующим образом: к 0,4 г активированных магнитных частиц добавляют 2 мл МКА гибридомы 1Е6 с концентрацией 2 мг/мл. Инкубируют в течение 2 ч при температуре (22±4)°С. Для постановки ИФА иммунопсроксидазные конъюгаты получают методом периодатного окисления по P.K.Nakane, A.Kawaoi [5]: к 5 мг пероксидазы хрена (Sigma, США) добавляют 1 мл 0,3 М раствора гидрокарбоната натрия и 0,025 мл 32% формалина, инкубируют полученную смесь на шейкере в течение 30 минут. Далее в реакционную смесь вносят 1 мл переодата натрия и инкубируют на шейкере 30 минут. После к реакционной смеси добавляют 1 мл 0,16 М этиленгликоля и инкубируют 1 час на шейкере. Далее реакционную смесь диализуют ночь при +4°С против 0,01 М карбонат-бикарбонатного буфера, рН 9,6. После диализа к активированной пероксидазе хрена добавляют 1 мл МКА 1Е6 в концентрации 5 мг/мл и инкубируют на шейкере 2 часа, вносят 5 мг боргидрида натрия и инкубируют в темноте 2 часа при +4°С. После чего диализуют ночь против 0,1 М PBS. После диализа добавляют БСА (10 мг БСА на 1 мл конъюгата).

Постановка ИФА с использованием магнитных частиц с иммобилизованными МКА 1Е6 (МИС). В эппендорфы вносят по 50 мкл 10% взвеси МИС. Далее в эппендорф с отрицательным контролем вносят по 200 мкл ФСБ с альбумин-твином (USB, США) (ФСБ-АТ), в другие эппендорфы вносят по 200 мкл взвесей убитых культур сибиреязвенного микроба и штаммов гетерологичных микроорганизмов. Все эппендорфы со взвесями инкубируют при температуре (37+1)°С в течение 40 мин. После инкубации жидкость удаляют, придерживая эппендорфы постоянным магнитом (Invitrogen, Норвегия), а МИС два раза промывают фосфатно-солевым буфером с твином (ФСБ-Т). Далее в каждый эппендорф вносят по 200 мкл рабочего разведения конъюгата. Эппендорфы с конъюгатом инкубируют при температуре (37+1)°С в течение 15 мин и промывают ФСБ-Т 6 раз. После этого в эппендорфы вносят по 200 мкл субстрат-индикаторного раствора. Учитывают изменение окраски растворов в эппендорфах в течение 1-3 мин. Надосадочную жидкость переносят по 100 мкл в лунки планшета полистиролового для иммуноферментного анализа (табл.1), придерживая эппендорф постоянным магнитом, и останавливают реакцию внесением 50 мкл 4 N раствора серной кислоты (ХимМед, РФ). Учет результатов проводят на фотометре (фотометр Пикон, РФ) для ИФА при длине волны 492 нм. Положительными считают результаты, если оптическая плотность образцов в 2 и в более раз превышала оптическую плотность отрицательного контроля.

В качестве контрольных штаммов используют споры штаммов: B. anthracis 71/12, B. anthracis 228/8, B. anthracis СТИ-1 в концентрациях от 1,0×10⁷ спор/мл до 1,0×10² спор/мл. Для контроля специфичности используют споры штаммов: B. cereus 160, B. megaterium 2, B. cereus 19, B. cereus 16, B. cereus 8035 B. subtilis 37, B. subtilis 83 B. megaterium 5, B. megaterium 89, B. cereus 104, B. cereus 250, в концентрациях от 1,0×10⁵ спор/мл до 1,0×10⁴ спор/мл.

В результате проведенных испытаний установлено, что магнитные частицы с иммобилизованными МКА 1Е6 выявляют споры штаммов сибирской язвы в концентрациях - 1×10²-1×10³ спор/мл и не выявляют контрольные гетерологичные культуры рода Bacillus в споровой форме в концентрации 1,0×10⁵ м.к./мл и ниже при использовании конъюгата в рабочем разведении 1:600 (табл.2).

Источники информации

1. Quinlant J. J. and Foegeding P. M. Monoclonal Antibodies for Use in Detection of Bacillus and Clostridium Spores. // Appl. Environ. Microbiol. - 1997. - V.63. - p.482-87.

2. Christopher Steichen, Ping Chen, John F. Kearney, and Charles L. Turnbough, Jr. Identification of the Immunodominant Protein and Other Proteins of the Bacillus anthracis Exosporium. // Bacteriology, March 2003. - V.185, No. 6. - p.1903-1910.

3. Tomas A. Lcski, Clayton C. Caswell, Marcin Pawlowski, David J. Klinke, Janusz M. Bujnicki, Sean J. Hart, and Slawomir Lukomski. Identification and Classification of bcl Genes and Proteins of Bacillus cereus Group Organisms and Their Application in Bacillus anthracis Detection and Fingerprinting. // Applied and Environmental Microbiology, Nov. 2009, - p.7163-7172.

4. Егоров A.M., Осипов А.П., Дзантиев Б.Б., Гаврилова Е.М. Теория и практика иммуноферментного анализа. / Т 33 - M.: Высш. Шк., 1991. - С.174-175.

5. Nakane P.K., Kawaoi A. Peroxidase-labelled antibody-a new method of conjugation. // J.Histochem. Cytochem. - 1974. - V.22, N 4. - P.506-508-1084-1091.

Таблица 1 Схема внесения исследуемого материала (взвеси, положительный и отрицательный контроли) Номер лунки Взвеси B. anthracis СТИ-1, спор/мл Взвеси B. anthracis 71/12, спор/мл Взвеси B. anthracis 228/8, спор/мл Взвеси гетерологичных штаммов спор/мл 1 2 3 4 5 6 А бланк - - 1,0×10⁵ B. subtilis 37 1,0×10⁵ B. cereus 104 1,0×10⁵ B. cereus 19 В 1,0×10² 1,0×10² 1,0×10² 1,0×10⁴ B. subtilis 37 1,0×10⁴ B. cereus 104 1,0×10⁴ B. cereus 19 С 1,0×10³ 1,0×10³ 1,0×10³ 1,0×10⁵ B. subtilis 83 1,0×10⁵ B. cereus 250 1,0×10⁵ B. cereus 16 D 1,0×10⁴ 1,0×10⁴ 1,0×10⁴ 1,0×10⁴ B. subtilis 83 1,0×10⁴ B. cereus 250 1,0×10⁴ B. cereus 106 Е 1,0×10⁵ 1,0×10⁵ 1,0×10⁵ 1,0×10⁵ B. megaterium 5 1,0×10⁵ B. cereus 160 1,0×10⁵ B. megaterium 2 F 1,0×10⁶ 1,0×10⁶ 1,0×10⁶ 1,0×10⁴ B. megaterium 5 1,0×10⁴ B. cereus 160 1,0×10⁴ B. megaterium 2 G 1,0×10⁷ 1,0×10⁷ 1,0×10⁷ 1,0×10⁵ B. megaterium 89 1,0×10⁵ B. cereus 8035 - Н Отрицат. контроль Отрицат. контроль Отрицат. контроль 1,0×10⁴ B. megaterium 89 1,0×10⁴ B. cereus 8035 -

Таблица 2 Результаты спектрометрической обработки ИФА   1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 А 0,000 - - 0,145 0,132 0,181             В 0,385 0,378 0,401 0,136 0,129 0,169             С 0,527 0,590 0,562 0,158 0,199 0,111             D 0,589 0,601 0,628 0,154 0,187 0,142             Е 0,610 0,627 0,679 0,133 0,132 0,164             F 0,715 0,694 0,764 0,128 0,146 0,170             G 0,801 0,842 0,879 0,175 0,161 -             Н 0,160 0,127 0,149 0,150 0,153 -            

Штамм гибридомы получают путем иммунизации мышей линии BALB/c. Мышей иммунизируют по общепринятой методике путем двукратного с тридцатидневной экспозицией подкожного введения инактивированных спор штамма В. anthracis СТИ-1. На третьи сутки после последней бустер-инъекции проводят гибридизацию спленоцитов иммунных мышей (1×10⁸ клеток) с клетками мышиной миеломы РЗ-Х63 Ag/8-653 (1х10⁷ клеток), используя для слияния полиэтиленгликоль (Sigma, США). После гибридизации проводят селекцию, скрининг, клонирование и криоконсервацию гибридомы. Полученная гибридома депонирована в коллекции микроорганизмов ФГУН ГНЦ МПБ под номером Н10. Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для получения моноклональных антител (МКА) к спорам Bacillus anthracis. Продуктивность штамма - 20-50 мкг/мл моноклональных антител (МКА), а в асцитической жидкости - 5-10 мг/мл. Гибридома продуцирует МКА, относящиеся к IgG1 подклассу иммуноглобулинов мыши и специфичные к спорам Bac.anthracis. 7 ил., 2 табл.

Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus 1E6 - продуцент моноклональных антител, специфичных к спорам Bacillus anthracis, депонирован в коллекции микроорганизмов Федерального государственного учреждения науки Государственного научного центра прикладной микробиологии и биотехнологии (ФГУН ГНЦ МПБ), коллекционный номер Н10.