ШТАММ ГИБРИДНЫХ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ КЛЕТОК ЖИВОТНЫХ MUS MUSCULUS 11D6-ПРОДУЦЕНТ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ, СПЕЦИФИЧНЫХ К ЛИПОПОЛИСАХАРИДАМ FRANCISELLA TULARENSIS Российский патент 2012 года по МПК C12N15/18 C12P21/08 G01N33/543 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для получения моноклональных антител (МКА) к липополисахаридам (ЛПС) Francisella tularensis.

На территории Российской Федерации определяется наличие природных очагов туляремии, эпизоотическая активность которых подтверждается спорадической заболеваемостью людей и выделением возбудителя туляремии от грызунов, членистоногих, из объектов внешней среды или выявлением антигена в погадках птиц и помете хищных млекопитающих. В последнее десятилетие (1995-2004 гг.) регистрируются преимущественно спорадическая и групповая заболеваемость, которая ежегодно колеблется в пределах 50-100 случаев [1]. Но с 2004 года наблюдается рост случаев заболевания (увеличение в 3 раза по сравнению с 2003 г.). В 2005 увеличилось случаев заболевания в 8,5 раза по сравнению с алогичным периодом в 2004 г.

Многообразие механизмов и путей заражения: контактный (через кожные покровы или слизистую оболочку глаза), инокулятивный (через кожные покровы при укусе членистоногого или млекопитающего), алиментарный (через пищеварительный тракт) и аспирационный (через дыхательные пути) обуславливают полиморфизм клинических проявлений туляремии.

Микроб устойчив в объектах окружающей среды, в воде поверхностных водоемов при температуре 13-15°С бактерии могут сохранятся до 3 месяцев, при 4°С до 4 месяцев и более, при температуре 20-25°С - погибают в течение нескольких дней. В почве или при температуре 4-7°С бактерии выживают до 3 месяцев. Длительно выживают в молоке, сливках, сохраняемых при низкой (8-15°С) - 8 суток, в замороженном молоке - более 3-х месяцев. На зерне и в соломе при температуре - 5°С - около 7 мес, при 8-12°С - до 2 месяцев. Возбудитель туляремии устойчив к высушиванию, особенно если он находится в органах и тканях животных.

На прямом солнечном свете бактерии туляремии погибают в течение 20-30 минут, на рассеянном - могут сохраняться несколько дней.

Микроб малоустойчив к высоким температурам (при 60°С гибнет через 5-10 минут, кипячение - в течение 1-2 минут). Малоустойчив к средствам химической дезинфекции: 3% растворы хлорной извести, хлорамина, других дезинфектантов уничтожают его через 20-30 минут.

Голарктическая раса обнаруживает большую устойчивость во внешней среде без снижения вирулентности: во льду до 10-11 месяцев, в речной воде при 1°С - до 9 мес, на зерне и соломе - до 6 месяцев, при комнатной температуре сохраняются в воде 30-60 суток. Неарктическая раса соответственно 8 месяцев, до 5-6 месяцев, 3-4 месяца, не более 20 суток [2].

В связи с разработкой иммуночипов и мультипараметрических диагностических систем большое значение придается получению специфических иммунореагентов, прежде всего моноклональных или монорецепторных поликлональных антител. Специфичность иммуноглобулиновых препаратов, которая является наиболее важным определяющим свойством их качества, зависит напрямую от степени очистки и максимальной экспрессии специфических эпитопов использованного для получения антител антигена того или иного микроорганизма.

Поэтому одним из важных подходов в обнаружении возбудителя туляремии в объектах внешней среды является использование МКА, продуцируемых гибридомами.

Известны гибридомы продуцирующие моноклональные тела, специфичные к ЛПС F.tularensis (3, 4). Однако упоминаемые в печати моноклональные антитела недостаточно чувствительны для конструирования на их основе тест-систем для выявления возбудителя туляремии. Так, по данным М.Pohanka с соавторами (4), применение моноклональных антител против возбудителя туляремии в методе фермент-меченых антител позволяет выявлять только 6,9×10⁶ микробных клеток на мл и более.

Задача изобретения - получение штамма гибридных культивируемых клеток, продуцирующих моноклональные антитела, специфичные к липополисахаридам F.tularensis и пригодные для конструирования на их основе тест-систем для выявления возбудителя туляремии.

Поставленная задача решается тем, что предложен новый штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus 11D6 - продуцент высокоспецифичных моноклональных антител к ЛПС F.tularensis.

Штамм депонирован в коллекции микроорганизмов Федерального государственного учреждения науки Государственного научного центра прикладной микробиологии и биотехнологии (ФГУН ГНЦ МПБ) коллекционный номер - H11.

Штамм гибридомы получают путем иммунизации мышей линии BALB/c. Мышей иммунизируют по общепринятой методике путем двукратного подкожного введения ЛПС F.tularensis 15/10. На третьи сутки после последней бустер-инъекции проводят гибридизацию спленоцитов иммунных мышей (1×10⁸ клеток) с клетками мышиной миеломы РЗ-Х63 Ag/8-653 (1×10⁷ клеток). В качестве агента для слияния применяют полиэтиленгликоль (Sigma, США). После гибридизации проводят селекцию, скрининг, клонирование и криоконсервацию гибридомы.

Характеристика гибридомы 11D6.

Морфологическая характеристика. Культура гибридных клеток состоит из слабо прикрепленных к подложке округлых клеток размером с исходную миеломную клетку.

Культуральные свойства. Культивирование штамма гибридомы 11D6 ведут при температуре 37°С в атмосфере, содержащей 5% углекислого газа. Средой культивирования является среда RPMI - 1640, содержащая 20% эмбриональной телячьей сыворотки, 2 мM/L-глутамина, 100 мкг/мл гентамицина.

Клетки культивируют в виде стационарной суспензии в пластиковых матрацах "Costar". Пассирование клеток гибридомы проводят 2 раза в неделю с кратностью разведения 1:2-1:3. Посевная концентрация клеток составляет 1×10⁵ в 1 мл среды. Максимальная концентрация гибридных клеток при культивировании составляет 1×10⁵ на 1 мл среды. Гибридный клон не теряет способности синтеза антител при 10 пассажах in vitro (срок наблюдения).

Культивирование гибридомы в организме животного. Мышей линии BALB/c 20-недельного возраста обрабатывают пристаном (Sigma, США) по 0,5 мл внутрибрюшинно и через 2-3 недели интраперитонеально вводят по 1×10¹⁰ гибридных клеток. Появление иммуноасцитов регистрируют на 7-15 сутки, отбор иммуноасцитической (ИАЖ) жидкости производят на 10-21 сутки. Синтез иммуноглобулина, продуцируемого гибридомой, определяют методом непрямого ИФА [6].

Характеристика полезного продукта. Гибридома 11D6 продуцирует специфичные моноклональные антитела к ЛПС F.tularensis 15/10, титр которых составляет в культуральной жидкости (КЖ) 1:1000, в ИАЖ 1:100000. Моноклональные антитела из КЖ и ИАЖ выделяли путем аффинной хроматографии на колонке с белком G-сефарозой (Protein G Sepharose 4 Fast Flow). Чистоту полученных иммуноглобулиновых фракций оценивали в SDS-PAGE-электрофорезе в денатурирующих условиях.

Концентрацию иммуноглобулинов определяли спектрофотометрически при длине волны 280 нм (спектрофотометр Smart Spec Plus, BIO RAD, США).

Продуктивность штамма. Продукция МКА в среде культивирования составляет 20-50 мкг/мл, в асцитической жидкости - 5-10 мг/мл. Продукция МКА в культуральной жидкости сохраняется на протяжении 10 пассажей (срок наблюдения) и 5 пассажей при культивировании в виде асцитных опухолей на мышах (срок наблюдения)

Контаминация штамма. Контаминанты гибридной линии, включая бактерии, дрожжи, грибы, не выявлены. Микоплазмы не определяли.

Криоконсервация. Среда замораживания содержит эмбриональной телячьей сыворотки - 90%, диметилсульфоксида - 10%.

Режим криоконсервации и отогрева. Гибридные клетки вносят в криопробирки, помещают в контейнер из пенопласта с толщиной стенок не менее 1 см и оставляют на 16-24 часа в кельвинаторе при температуре -70°С и затем опускают в жидкий азот.

Размораживание проводят быстро на водяной бане при температуре 37°С.

Ампулы содержат 1,0 мл криозащитной среды с концентрацией гибридных клеток 1×10⁶. Жизнеспособность восстанавливаемых гибридом после криоконсервации составляет 75-85%.

Свойства полезного продукта. Гибридома продуцирует моноклональные антитела, относящиеся к IgG3 подклассу иммуноглобулинов мыши, константа аффинности МКА 11D6 - 1,4×10^-9 МКА специфичны к ЛПС F.tularensis 15/10.

Изобретение иллюстрируется следующими графическими материалами.

Фиг.1 Дот-блот с МКА 11D6. Определение неспецифической активности в отношении микробных клеток других микроорганизмов.

Фиг.2 Дот-блот с МКА 11D6. Определение специфической активности в отношении представителей рода Francisella.

Фиг.3 SDS-PAGE электрофорез МКА 11D6.

Фиг.4 Определение подклассовой принадлежности МКА 11D6.

Фиг.5 Иммуноблотинг МКА 11D6 с ЛПС F.tularensis 15/10.

Для лучшего понимания сущности изобретения ниже следуют примеры его конкретного выполнения.

Пример 1. Получение гибридомы 11D6.

Иммунизацация.

Для иммунизации используют мышей линии BALB/c в возрасте 3-4 месяцев. Иммунизацию проводят по следующей схеме:

0 день - 100 мкг ЛПС в PBS эмульгированного в ПАФ (0.2 мл) подкожно;

21 день - 100 мкг ЛПС в PBS эмульгированного в НАФ (0.2 мл) подкожно;

51 день - 100 мкг ЛПС в PBS внутривенно.

Кровь у иммунных мышей отбирают на третий день после последней инъекции ЛПС в концентрации 100 мкг согласно Animal protocol №Р 02-19 стр.7.

Титры специфических антител в сыворотках животных определяют с помощью непрямого твердофазного ИФА. Гибридизация. Через 3 суток после последней внутривенной инъекции извлекают селезенку мыши и проводят гибридизацию 1×10⁸ спленоцитов мыши с 1×10⁷ клетками миеломной линии РЗ-Х63 Ag/8-653 в присутствии 1 мл полиэтиленгликоля (SIGMA, США) в течение 1 минуты.

Селекция.

После отмывки полиэтиленгликоля клетки высевают на 96-луночные планшеты на слой перитонеальных макрофагов, взятых у мышей линии BALB/c. Селекцию гибридных клеток проводят на селективной среде с содержанием гипоксантина-аминоптерина-тимидина (HAT). Через 21 сутки из среды убирают аминоптерин. В последующем культивирование проводят на среде RPMI - 1640 "Sigma" с 20% эмбриональной телячьей сыворотки, 2 мM/L-глутамина, 100 мкг/мл гентамицина.

Скрининг гибридных клонов.

Для отбора положительных гибридных клонов, продуцирующих МКА, используют непрямой твердофазный ИФА.

Для проведения непрямого варианта ИФА в лунки 96-луночного полистиролового планшета для иммуноферментного анализа вносят по 1 мкг/лунку ЛПС F.tularensis 15/10 и выдерживают при температуре 37°С в течение 1 часа или при 4°С в течение 18 часов. Три раза отмывают фосфатно-солевым буфером рН 7.4, содержащим 0,5% твин-20 (ФСБ-Т). Далее вносят в лунки по 160 мкл 0,5% раствора бычьего сывороточного альбумина (БСА), проверенного на отсутствие пероксидазной активности и инкубируют при температуре 37°С в течение 1 часа. Три раза отмывают ФСБ-Т, вносят в лунки супернатант культуральной жидкости в объеме 100 мкл и инкубируют при температуре 37°С в течение 1 часа. После этого лунки планшета трижды отмывают раствором ФСБ-Т и добавляют в лунки пероксидазный конъюгат к целой молекуле IgG мыши (Sigma, США) в рабочем разведении. Планшет инкубируют при температуре 37°С в течение 1 часа, затем 6 раз отмывают лунки раствором ФСБ-Т. После этого в лунки вносят по 100 мкл субстрат -индикаторного раствора (10 мкл 30% H₂O₂ и 8 мг ортофенилендиамина на 10 мл фосфатно-цитратного буфера рН 5,0). Положительную реакцию оценивают по появлению желто-коричневого окрашивания раствора. Реакцию останавливают добавлением в лунки по 50 мкл 4 N серной кислоты. Учет результатов проводят на фотометре (фотометр Пикон, РФ) для ИФА при длине волны 492 нм.

Клонирование.

Клонирование гибридных клеток проводят методом лимитирующих разведений в 96-луночных планшетах на слое перитонеальных макрофагов из расчета 1×10⁴ клеток на лунку. Скрининг клонов проводят непрямым твердофазным ИФА, как описано выше.

Культивирование.

Культивирование клонов гибридомы ведут при температуре 37°С в атмосфере, содержащей 5% углекислого газа. Средой культивирования является среда RPMI - 1640, содержащая 20% эмбриональной телячьей сыворотки, 2 мМ/L-глутамина, 100 мкг/мл гентамицина.

Криоконсервация.

Клоны гибридомы криоконсервируют на среде замораживания, состоящей из эмбриональной телячьей сыворотки - 90%, диметилсульфоксида - 10%. Клоны гибридомы хранят в сосудах Дюара с жидким азотом.

Пример 2. Определение неспецифической активности в отношении микробных клеток других микроорганизмов методом дот-блот анализа.

Для проведения данного исследования использовали панель из 30 микроорганизмов различных видов. В качестве положительного контроля использовали клетки пяти штаммов F.tularensis. На нитроцеллюлозную мембрану (GE Water & Process Technologies, США) с помощью прибора BIO-DOT (BIO RAD, США) сорбировали инактивированные микробные клетки в концентрациях 1×10⁶ клеток/мл. Штаммы микроорганизмов были получены из коллекции микроорганизмов ФГУН ГНЦ ПМБ. Далее мембраны блокировали раствором инертного белка и последовательно инкубировали с МКА 11D6 и пероксидазным конъюгатом к целой молекуле IgG мыши (Sigma, США). Визуализацию реакции проводили раствором субстратной смеси на основе диаминобензидина (0.05% диаминобензидина (Sigma, США), 0.015% Н₂O₂, 0.01 М фосфатно-солевой буфер, рН - 7.4). Реакцию останавливали промывкой дистиллированной водой.

Как показал проведенный анализ, МКА 11D6 не проявляли перекрестную активность с микробными клетками других микроорганизмов (лунки с 1 по 26 и 28) и взаимодействовали только с клетками штаммов F.tularensis (лунки 25-27 и 29-30) (фиг.1).

Проверка специфичности МКА.

Пример 3. Дот-блот. Определение специфической активности в отношении представителей рода Francisella.

Проверка специфической активности МКА 11D6 в отношении различных штаммов F.tularensis проводили методом дот-блот анализа. На нитроцеллюлозный фильтр с помощью прибора Bio-Dot («Bio-Rad», США) сорбировали микробные клетки различных штаммов рода Francisella в концентрации 1×10⁷ клеток/мл, 1×10⁶ клеток/мл, 1×10⁵ клеток/мл, 1×10⁴ клеток/мл. Штаммы микроорганизмов были получены из коллекции микроорганизмов ФГУН ГНЦ ПМБ. Далее мембраны блокировали раствором инертного белка и последовательно инкубировали с МКА 11D6 и пероксидазным конъюгатом к целой молекуле IgG мыши (Sigma, США). Визуализацию реакции проводили раствором субстратной смеси на основе диаминобензидина (0.05% диаминобензидина (Sigma, США), 0.015% Н₂O₂, 0.01 М фосфатно-солевой буфер, рН - 7.4). Реакцию останавливали промывкой дистиллированной водой.

В результате проведенного анализа было установлено, что МКА 11D6 взаимодействуют с микробными клетками F.tularensis в концентрации 1×10⁵ клеток/мл и не обладают перекрестной активностью в отношении шт. Francisella novicida. (фиг.2).

Пример 4. Выделение и очистка МКА 11D6.

Выделение МКА из асцитической жидкости проводят путем аффинной хроматографии на колонке с белком G-сефарозой (Protein G Sepharose 4 Fast Flow). Клеточные компоненты из культуральной и асцитической жидкостей удаляют центрифугированием (2000 g × 20 мин), рН культуральной жидкости доводят до 8.6 при помощи 1 N раствора NaOH, асцитическую жидкость разводят 1:1 посадочным буфером (0.05 М трис, 0.15 М NaCl, 0.02% NаN₃, рН 8.6). Колонку уравновешивают посадочным буфером и проводят нанесение образцов со скоростью 10 мл/час при комнатной температуре. После нанесения образцов колонку отмывают от не связавшихся компонентов и проводят элюцию иммуноглобулинов 0.05 М глициновым буфером, 0.15 М NaCl, pH 2.3. Контроль выхода фракции иммуноглобулинов осуществляют при помощи УФ детектора ("Pharmacia LKB", Швеция).

Выделенные иммуноглобулины концентрируют осаждением при помощи сухого сульфата аммония (до 50% насыщения) и переводят в фосфатно-солевой буферный раствор методом гель-фильтрации на колонке с сефадексом G-25 (PD-10, "Pharmacia LKB", Швеция) емкостью 10 мл. Чистоту полученных иммуноглобулиновых фракций оценивают в SDS-PAGE-электрофорезе в денатурирующих условиях.

В результате были получены очищенные препараты иммуноглобулинов (фиг.3).

Пример 5. Определение подклассовой принадлежности МКА 11D6. Подклассы полученных МКА определяют с помощью набора для определения изотипов мышиных моноклональных антител (Roche Diagnostic Corporation, США). В культуральную жидкость объемом 500 мкл погружают иммунохроматографическую полоску для определения изотипов мышиных моноклональных антител не глубже чем на 1,5 см на 5 минут. После проявления контрольной полосы и полосы, соответствующей тестируемым Ig, определяют с помощью контрольной иммунохроматографической полоски (прилагается к набору для определения изотипов мышиных моноклональных антител) подкласс антител.

Определение подкласса МКА 11D6 показало, что гибридома продуцирует моноклональные антитела, относящиеся к IgG3 подклассу иммуноглобулинов мыши (фиг.4).

Пример 6. Иммуноблотинг МКА 11D6 с ЛПС F.tularensis 15/10.

Для проверки специфичности МКА 11D6 с ЛПС F.tularensis 15/10 проводят SDS-PAGE-электрофорез в 10% полиакриламидном геле (ПААГ) в течение 1 часа при 220 в, 20 мА. ЛПС из ПААГ переносят на нитроцеллюлозную мембрану (GE Water & Process Technologies, США) в течение 1 часа при силе тока 380 мА. После завершения переноса мембрану блокируют, погружая в 1% раствор БСА в ФСБ pH 7,4 на 1 час при комнатной температуре. Для промывок мембран используют ФСБ-Т рН 7,4. Блокированную и промытую мембрану инкубируют в растворе МКА гибридомы 11D6 в течение одного часа при температуре 37°С. Далее, после промывки буфером, мембрану инкубируют с пероксидазным конъюгатом к суммарной фракции Ig мыши (Sigma, США) в рабочем разведении при тех же условиях, промывают ФСБ-Т. Визуализацию реакции проводили раствором субстратной смеси на основе диаминобензидина (0.05% диаминобензидина (Sigma, США), 0.015% Н₂O₂,0.01 М фосфатно-солевой буфер - ФСБ, рН - 7.4). Реакцию останавливают промывкой дистиллированной водой.

В результате проведенного анализа было установлено, что МКА 11D6 взаимодействуют с ЛПС F.tularensis 15/10 (фиг.5).

Пример 7. Обнаружение клеток F.tularensis в реакции латекс-агглютинации.

Для постановки реакции латекс-агглютинации (РЛА) используют полиакролеиновые латексные частицы диаметром 1 и 1,2 мкм (Институт биоорганической химии им. акад. М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН, Москва) и МКА 11D6. Иммобилизацию МКА на латексных частицах проводят согласно протоколу производителя: к 50 мкл 10% латексной суспензии добавляют 100 мкл МКА 11D6 с концентрацией 1 мг/мл, доводят объем до 0,5 мл и инкубируют 2 часа при комнатной температуре и перемешивании. Для блокировки не прореагировавших групп добавляют 4 мл 1% раствора овальбумина (Sigma, США) в 0,1 М боратном буфере (ББ), рН 8,2. От не связавшихся МКА латексные частицы отмывают в ББ трехкратным 10-минутным центрифугированием при 1200 g. Осадок ресуспендируют в 5 мл ББ с 1% овальбумином.

Реакцию латекс-агглютинации проводят в круглодонных 96-луночных планшетах с U-образным профилем лунок (фирма Пан Эко, Россия). В качестве контрольных штаммов используют клетки штаммов: F.tularensis 15/10, F.tularensis Schu, F.tularensis 503, F.tularensis miura, F.tularensis 120. Для контроля специфичности используют штаммы F.novicida 112, Y.pestis EV НИИЭГ, Y.enterocolitica 287, Y.pseudotuberculosis III, S.typhi 65, S.typhimurium 79, E.coli ATCC 25922, E.coli O157:H7 Т 3691 и ЛПС В.abortus. В качестве отрицательного контроля используют 0,1 М боратный буфер, рН 8,2.

Разведения клеток штаммов микроорганизмов с шагом 2 готовят в объеме 25 мкл в круглодонных 96-луночных планшетах в боратном буфере. После добавления во все лунки по 25 мкл латексных частиц с иммобилизованными МКА 11D6, планшет встряхивают и инкубируют 1,5-2,0 часа при комнатной температуре.

Учет результатов проводят визуально по четырехкрестной системе на светлом фоне при хорошем освещении.

4+ - все частицы латекса агглютинированы, равномерно покрывают дно лунки, образуя «зонтик».

3+ - агглютинированы почти все частицы латекса, что выражается в уменьшении диаметра «зонтика».

2+ - агглютинирована половина латексных частиц.

1+ - большинство частиц не агглютинировано и осело на дно лунки, но диаметр «пуговицы» пока еще отличается от «точки».

«-» - признаков агглютинации нет, латексные частицы осели на дно лунки в виде «точки» ярко синего цвета в центре лунки.

Положительной считается реакция, оцениваемая не менее чем на 3+.

В результате проведенной реакции латекс-агглютинации было установлено, что латексные частицы с иммобилизованными МКА 11D6 выявляют клетки штаммов туляремии в концентрации 9×10⁴-7,5×10⁵ клеток/мл и не выявляют гетерологичные культуры микроорганизмов в концентрации 2×10⁸ клеток/мл и ниже (фиг.6, фиг.7, таблица 1, таблица 2).

Пример 8. Выявление клеток F.tularensis методом ИФА с использованием магнитных частиц с иммобилизованными МКА 11D6.

Для постановки ИФА с использованием магнитных частиц используют магноиммуносорбенты (МИС), разработанные по методике, описанной в изобретении (Пат. РФ. №2138813, G-01, №33/543, от 27.09.99. Бюл. №27) (7). Активацию магнитных частиц проводят методом окисления с использованием натрия перхлората (ХимМед, РФ) следующим образом: к 0,5 г магнитных частиц приливают 3 мл дистиллированной воды, содержащей 0,20 г натрия перхлората. Инкубируют при температуре (22±4)°С в течение 1 часа в темноте. Затем магнитные частицы отмывают забуференным физиологическим раствором (ЗФР) до отсутствия величины экстинции на спектрофотометре при длине волны 280 нм. Иммобилизацию МКА 11D6 на магнитных частицах проводят следующим образом: к 0,4 г активированных магнитных частиц добавляют 2 мл МКА 11D6 с концентрацией 2 мг/мл. Инкубируют в течение 2 ч при температуре (22±4)°C. Для постановки ИФА иммунопероксидазные конъюгаты получают методом перйодатного окисления по P.K.Nakane, A.Kawaoi [8]: к 5 мг пероксидазы хрена (Sigma, США) добавляют 1 мл 0,3 М раствора гидрокарбоната натрия и 0,025 мл 32% формалина, инкубируют полученную смесь на шейкере в течение 30 минут. Далее в реакционную смесь вносят 1 мл переодата натрия и инкубируют на шейкере 30 минут. После к реакционной смеси добавляют 1 мл 0,16 М этиленгликоля и инкубируют 1 час на шейкере. Далее реакционную смесь диализуют ночь при +4°С против 0,01 М карбонат-бикарбонатного буфера, рН 9,6. После диализа к активированной пероксидазе хрена добавляют 1 мл МКА 11D6 в концентрации 5 мг/мл и инкубируют на шейкере 2 часа, вносят 5 мг боргидрида натрия и инкубируют в темноте 2 часа при +4°С. После чего диализуют ночь против 0,1 М PBS. После диализа добавляют БСА (10 мг БСА на 1 мл конъюгата).

Постановка ИФА с использованием магнитных частиц с иммобилизованными МКА 11D6 (МИС). В эппендорфы вносят по 50 мкл 10% взвеси МИС. Далее в эппендорф с отрицательным контролем вносят по 200 мкл ФСБ с альбумин-твином (USB, США) (ФСБ-АТ), в другие эппендорфы вносят по 200 мкл взвесей убитых культур туляремийного микроба и штаммов гетерологичных микроорганизмов. Все эппендорфы со взвесями инкубируют при температуре (37+1)°С в течение 40 мин. После инкубации жидкость удаляют, придерживая эппендорфы постоянным магнитом (Invitrogen, Норвегия), а МИС два раза промывают фосфатно-солевым буфером с твином (ФСБ-Т). Далее в каждый эппендорф вносят по 200 мкл рабочего разведения конъюгата. Эппендорфы с конъюгатом инкубируют при температуре (37+1)°С в течение 15 мин и промывают ФСБ-Т 6 раз. После этого в эппендорфы вносят по 200 мкл субстрат-индикаторного раствора. Учитывают изменение окраски растворов в эппендорфах в течение 1-3 мин. Надосадочную жидкость переносят по 100 мкл в лунки планшета полистиролового для иммуноферментного анализа (табл.1), придерживая эппендорф постоянным магнитом, и останавливают реакцию внесением 50 мкл 4 N раствора серной кислоты (ХимМед, РФ). Учет результатов проводят на фотометре (фотометр Пикон, РФ) для ИФА при длине волны 492 нм. Положительными считают результаты, если оптическая плотность образцов в два и в более раз превышала оптическую плотность отрицательного контроля.

В качестве контрольных штаммов используют клетки штаммов: F.tularensis 15/10, F.tularensis Schu, F.tularensis 503, F.tularensis miura, F.tularensis 120, F.tularensis 250, F.tularensis 385, F.tularensis 356, F.tularensis 358, F.tularensis 355. Для контроля специфичности используют штаммы F.novicida 112, F.novicida 383, Y.pestis EV НИИЭГ, Y.pestis И 2638, Y.enterocolitica 287, Y.enterocolitica 8, Y.pseudotuberculosis III, Y.pseudotuberculosis И 748, S.typhi 65, S.typhi 33221, S.typhimurium 79, S.typhimurium 441, E.coli ATCC 25922, E.coli 0157:H7 Т 3691, E.coli 157.

В результате проведенных испытаний установлено, что магнитные частицы с иммобилизованными МКА 11D6 выявляют клетки штаммов туляремии в концентрациях - 1×10²-1×10³ спор/мл и не выявляют контрольные гетерологичные культуры микроорганизмов в концентрации 1,0×10⁵ м.к./мл и ниже при использовании конъюгата в рабочем разведении 1:600 (табл.3).

Источники информации

1. МУ 3.1.2007-05 «Эпидемиологический надзор за туляремией».

2. Олсуфьев Н.Г., Дунаева Т.Н. Природная очаговость, эпидемиология и профилактика туляремии. - М.: Медицина, 1970 г. - 261 с.

3. А.П.Суслов, В.Г.Лунин с соавторами. Системы иммунодетекции особо опасных инфекций, в том числе с использования технологий фагового дисплея.

4. М.Pohanka, О.Pavlis, М.Kroca ELISA detection of Francisela tularensis using polyclonal and monoclonal antibodies. Defence science J., vol.58, №5, p.608-702. 2008

5. Жарикова Т.В. Усовершенствование методов индикации Francisella tularensis и Leptospira interrogans с применением иммобилизованных систем, автореферат, Саратов, 2007 г.

6. Егоров A.M., Осипов А.П., Дзантиев Б.Б., Гаврилова Е.М. Теория и практика иммуноферментного анализа. / Т 33 - М.: Высш. Шк., 1991. - С.174-175.

7. Жарникова И.В., Тюменцева И.С., Ефременко В.И., Афанасьев Е.Н., Бинатова В.В. Способ получения иммуносорбента (варианты) / Патент на изобретение №2138813 ⁶ G01N 33/543, A61K 39/385, С12N 11/14. Зарегистр. в Гос. реестре изобретений РФ 27.09.99 г. Бюл. №27.

8. Nakane P.K., Kawaoi A. Peroxidase-labelled antibody-a new method of conjugation // J.Histochem. Cytochem. - 1974. - V. 22, N 4. - P.506-508; 1084-1091.

Таблица 1. Результаты учета реакции латекс-агглютинации   1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 А 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 3+ 1+ - - В 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 3+ 1+ - - С 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 3+ 1+ - - - - - D 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 3+ 1+ - - - - Е 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 3+ 1+ - - - F 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ G - - - - - - - - - - - - Н -                      

Таблица 2. Результаты учета реакции латекс-агглютинации   1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 А - 1+ 1+ - - 1+ - - -       В - - - - - - - - -      

Таблица 4. Результаты спектрометрической обработки ИФА   1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 А 0,000 - - - - - - - - - В 0,607 0,458 0,509 0,413 0,510 0,578 0,389 0,618 0,483 0,571 С 0,702 0,509 0,589 0,489 0,621 0,642 0,453 0,689 0,538 0,649 D 0,771 0,545 0,648 0,587 0,687 0,749 0,581 0,741 0,597 0,734 Е 0,798 0,674 0,699 0,658 0,734 0,823 0,653 0,812 0,648 0,801 F 0,815 0,725 0,748 0,729 0,867 0,937 0,789 0,889 0,793 0,876 G 1,014 0,967 0,984 0,899 1,018 1,026 0,879 0,981 0,873 0,982 Н 0,150 0,132 - - - - - - - -

Таблица 6. Результаты спектрометрической обработки ИФА   1 2 3 4 5 А 0,000 - - - - В 0,211 0,158 0,201 0,189 0,191 С 0,187 0,187 0,168 0,197 0,124 D 0,156 0,143 0,111 0,165 0,136 Е 0,147 0,147 0,141 0,142 0,145 F 0,201 0,136 0,132 0,182 0,174 G 0,178 0,154 0,123 0,163 0,179 Н 0,161 0,147 - - -

Штамм гибридомы получают путем иммунизации мышей линии BALB/c. Мышей иммунизируют по общепринятой методике путем двукратного подкожного введения ЛПС Francisella tularensis 15/10. На третьи сутки после последней бустер-инъекции проводят гибридизацию спленоцитов иммунных мышей (1×10⁸ клеток) с клетками мышиной миеломы Р3-Х63 Ag/8-653 (1×10⁷ клеток). В качестве агента для слияния применяют полиэтиленгликоль (Sigma, США). После гибридизации проводят селекцию, скрининг, клонирование и криоконсервацию гибридомы. Гибридома 11D6 по изобретению продуцирует моноклональные антитела (МКА) к ЛПС F.tularensis, титр которых составляет в культуральной жидкости 1:1000, в иммуноасцитической жидкости 1:100000. Продуцируемые гибридомой МКА высокоспецифичны к ЛПС F.tularensis и пригодны для конструирования тест-систем для выявления возбудителя туляремии. 7 ил., 6 табл., 7 пр.

Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus 11D6 - продуцент моноклональных антител, специфичных к ЛПС Francisella tularensis, депонирован в коллекции микроорганизмов Федерального государственного учреждения науки Государственного научного центра прикладной микробиологии и биотехнологии (ФГУН ГНЦ ПМБ), коллекционный номер Н-11.