СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНОГО ПЕКТИНА Российский патент 2012 года по МПК C08B37/06 

Изобретение относится к способам получения низкомолекулярного пектина и может быть использовано в различных отраслях промышленности и медицины, в частности в фармацевтической промышленности для создания новых лечебных и профилактических средств и низкомолекулярных сорбентов.

Пектины представляют собой высокомолекулярные природные полимеры. Они присутствуют во всех высших цветковых растениях, входят в состав первичных клеточных стенок и срединных пластинок. Основой пектиновых молекул является поли-D-галактуроновая кислота. Часть остатков D-галактуроновой кислоты в пектине находится в форме метиловых эфиров. Если доля таких остатков составляет менее 50%, то такой пектин считается низкоэтерифицированным. Полностью деэтерифицированный, то есть не содержащий метиловых эфиров или содержащий незначительное их количество, пектин называется также пектовой кислотой.

В ходе исследований биологической активности пектинов обнаружен ряд фармакологических эффектов у низкомолекулярных производных пектинов - олигогалактуронидов. В этом плане особенный интерес представляют олигогалактурониды со степенью полимеризации от 6 до 25-30 моносахаридных остатков, что соответствует их молекулярной массе от 1 до 4,5-5 кДа. У этой группы олигогалактуронидов обнаружена иммуномодулирующая, интерферон-индуцирующая, макрофаг-активирующая и противоопухолевая активность (Kumazawa Y., Mizunoe K., Otsuka Y. Immunostimulating polysaccharide separated fromhot water extract of Angelic acutiloba Kitagawa (Yamato tohki) // Immunology. 1982. Vol.47. P.75-83). Кроме этого, данные олигосахариды стимулировали апоптоз клеток аденокарциномы кишечника у людей (Olano-Martin Е., Rimbah G.H., Gibson G.R., Rastall R.A. Pectin and pectic-oligosaccharides induce apoptosis in in vitro human colonicadenocarcinoma cell // Anticancer Res. 2003. Vol.23. P.341-346).

Установлено, что олигогалактурониды со степенью полимеризации не менее 6-9 способны образовывать прочные комплексы с ионами многих тяжелых металлов, таких как свинец, ртуть, кадмий и рядом других (Kohn R. Binding of divalent cations to oligomeric fragments of pectin // Carbohydr. Res. 1987. Vol.160. P.343-353). Это открывает перспективу создания на основе олигогалактуронидов эффективных средств для выведения из организма человека и животных депонированных форм указанных токсичных элементов, т.к. благодаря небольшой молекулярной массе олигогалактурониды могут достаточно легко всасываться в желудочно-кишечном тракте, а затем выводиться из организма через почки.

Получение олигогалактуронидов обычно осуществляют путем деполимеризации природных высокомолекулярных пектинов. Для этого может применяться ряд методов. Наиболее известным является метод ферментативного гидролиза пектинов с помощью пектиназ. Так, еще в 1944 году был предложен способ получения D-галактуроновой кислоты путем ферментативного гидролиза пектина (Пат. США №2338534, опубл. 04.01.1944 г.).

Известен способ получения композиции олигогалактуронидов, обладающей антибактериальным действием, также путем ферментативного гидролиза пектина (JP 10226701 A, С08В 37/00, опубл. 25.08.2010 г.). Согласно этому способу пектин сначала подвергают предварительному гидролизу в водном растворе при 80-100°С, а затем проводят окончательный гидролиз смеси с помощью пектиназы. Полученный продукт содержит смесь насыщенных и ненасыщенных (имеющих двойные углерод-углеродные связи в молекулах в результате окислительной деградации) олигогалактуронидов со степенью полимеризации от 2 до 15 (0,4-2,7 кДа).

Недостатком данного способа является то, что для успешного осуществления ферментативного гидролиза требуется, как правило, определенная предварительная обработка пектина, например, как в данном случае, частичная деполимеризация и деэтерификация в ходе предварительного гидролиза. Другим существенным недостатком ферментативного гидролиза является то, что в силу специфики действия пектинолитических ферментов в полученных гидролизатах всегда преобладают моно-, ди- и трисахариды, а доля молекул с массой 1 кДа (что соответствует степени полимеризации 6) и более незначительна.

Другим известным способом является способ щелочной деполимеризации пектина (ЕР 0487340 А1, А23Р 1/08, опубл. 27.05.92). Согласно этому способу суспензию пектина в 60% об. изопропаноле обрабатываю трехкратным (по химическому эквиваленту галактуроновой кислоты) количеством гидроокиси натрия в течение 5 дней при 25°С или 2 дней при 40°С с последующим отделением продукта на фильтре, нейтрализацией и сушкой. Полученный продукт содержит пектины с молекулярной массой от 2 до 20 кДа и предназначен в качестве вспомогательного вещества в кулинарии.

Недостатком данного способа является большая длительность процесса и большой разброс молекулярных масс пектинов в продукте. А также то, что галактуроновая кислота малоустойчива в щелочной среде и легко распадается с образованием ненасыщенных, сильноокрашенных и сильнопахнущих соединений (Kertesz Z.I. The pectic substances. Interscience Publishers, Inc., N.Y., L., 1951, 576 p.). Известен также способ гидролиза пектина при высокой температуре (WO 2009/004153, С08В 37/06, опубл. 08.01.2009). Согласно этому способу 1% раствор пектина с рН 4-5 нагревают под давлением при 110°С в течение 30-60 минут, затем раствор охлаждают, осаждают олигогалактурониды изопропанолом и сушат. Полученный продукт на 95% состоит из олигогалактуронидов со степенью полимеризации 4-11 (0,7-2 кДа). Недостатком данного способа является то, что при температуре более 100°С резко ускоряются процессы термического разложения олигогалактуронидов - разрывы пиранозного цикла, окисление, декарбоксилирование, образование фурфурола и его производных. Это сопровождается снижением выхода олигогалактуронидов и загрязнением гидролизата продуктами их разложения (Kertesz Z.I. The pectic substances. Interscience Publishers, Inc., N.Y., L., 1951, 576 p.). С химической точки зрения олигогалактурониды, имеющие в составе молекул продукты термической деградации галактуроновой кислоты, не могут в полной мере считаться олигогалактуронидами. Известен способ деполимеризации полиуронидов - альгинатов и пектинов с помощью окислителя - перекиси водорода (Пат. США US 2002/0016453 А1, С08В 37/06, опубл. 07.02.2002). Согласно этому способу пектовая кислота в виде пектата лития окисляется перекисью водорода концентрацией около 2% в присутствии сульфата железа в течение 4 часов. Затем олигогалактурониды осаждают уксусной кислотой, промывают пропанолом и сушат. Средняя степень полимеризации олигогалактуронидов - 16 (2,8 кДа). Выход продукта составляет 38%. Недостатком данного способа является, во-первых, низкий выход продукта. Во-вторых, перекись водорода одновременно с деполимеризацией пектина вызывает значительную деструкцию остатков галактуроновой кислоты - декарбоксилирование, разрывы пиранозного цикла, окисление спиртовых групп и, как отмечалось в предыдущем примере, полученные продукты не могут в полной мере считаться олигогалактуронидами (Kertesz Z.I. The pectic substances. Interscience Publishers, Inc., N.Y., L., 1951, 576 p.).

Наиболее близким по технической сущности к заявляемому способу является способ получения олигогалактуронидов из пектинов льна путем кислотного гидролиза (Bedouet L., Courtois В., Courtois J. Methods for obtaining neutral and acid oligosaccharides from flax pectins // Biotechnol. Lett. 2005. Vol.27. P.33-40). Способ осуществляют следующим образом. Из образца пектина массой 50 мг, содержащего 22,9 мг (45,8%) уроновой (галактуроновой) кислоты, готовят водный раствор пектина концентрацией 5 мг/мл (0,5%). Затем добавляют 12 М раствор соляной кислоты до концентрации 100 мМ (0,1 г-экв/л) и проводят гидролиз при 80°С в течение 24 часов. Полученный гидролизат охлаждают до комнатной температуры. Жидкую фазу, содержащую низкомолекулярные продукты гидролиза, отделяют от высокомолекулярной полигалактуроновой кислоты центрифугированием при 4°С и относительном центробежном ускорении 20000 g в течение 30 минут. Затем низкомолекулярные продукты гидролиза - олигогалактурониды осаждают из жидкой фазы изопропанолом и отделяют центрифугированием. Выход олигогалактуронидов составляет 33,9% от первоначального содержания галактуроновой кислоты.

Существенным недостатком данного способа является низкая исходная концентрация пектина в растворе. Результатом этого является, во-первых, низкая скорость гидролиза, так как она при неизменной константе гидролиза пропорциональна концентрации пектина в растворе. Во-вторых, низкая исходная концентрация пектина приводит к соответствующей низкой концентрации конечного продукта в готовом гидролизате - содержание олигогалактуронидов в готовом гидролизате, полученном вышеописанным методом, составляет всего 0,78 мг/мл за 24 часа гидролиза (выход продукта рассчитывается умножением исходной концентрации пектина в растворе на относительное содержание галактуроновой кислоты в пектине и на относительный выход галактуронидов и составляет соответственно 5 мг/мл × 0,458 × 0,339=0,78 мг/мл). А это, в свою очередь, приводит к более высоким удельным затратам на производство единицы массы продукта. В данном случае это, например, затраты, связанные с термостатированием всего объема гидролизата при 80°С и расходом кислоты на гидролиз.

Препятствием для существенного повышения концентрации пектина в растворе является то обстоятельство, что высокомолекулярные пектины уже при концентрации около 1% образуют достаточно вязкие растворы и использование более концентрированных растворов пектинов может создать определенные технологические трудности. Высоковязкие растворы при низких концентрациях образуют практически все коммерческие пектины, так как именно с этой способностью связано одно из главных направлений их использования - в качестве загустителей и структурирующих агентов в пищевой промышленности. Так, например, вязкость 1,5% растворов наиболее распространенных коммерческих пектинов - яблочного и цитрусового (производитель - Herbstreith & Fox KG, Германия) в 25-30 раз превышает вязкость воды.

Другим недостатком является низкая технологическая эффективность метода, которая приводит к низкому выходу продукта. Выход продукта - олигогалактуронидов составляет около 34%, 33% составляет остаток высокомолекулярной полигалактуроновой кислоты и 33% - потери олигогалактуронидов вследствие их структурной деградации. Таким образом, потери продукта составляют практически такую же величину как и его выход. Технологическим недостатком метода является то, что для отделения жидкой фазы, содержащей готовый продукт, требуются слишком жесткие условия: величина относительного центробежного ускорения 20000 g для большинства промышленных центрифуг и сепараторов либо недостижима, либо близка к их предельному рабочему режиму, необходимость охлаждения системы до 4°С также создает дополнительные технические проблемы и приводит к удорожанию процесса.

Задачей, поставленной перед изобретением, является получение низкомолекулярного пектина, обогащенного фракцией олигогалактуронидов с молекулярной массой 1-5 кДа, увеличение выхода целевого продукта, упрощение и удешевление способа.

Поставленная цель достигается тем, что в известном способе получения низкомолекулярного пектина (олигогалактуронидов), включающем гидролиз пектина в водном растворе минеральной кислоты при нагревании с последующим отделением жидкой фазы от нерастворимого остатка пектина, выделением из нее низкомолекулярных продуктов гидролиза пектина путем их осаждения органическим растворителем, смешивающимся с водой, согласно изобретению, в качестве исходного сырья для гидролиза используют низкоэтерифицированный пектин со степенью этерификации не более 30%, гидролиз ведут циклично, при этом время проведения одного цикла рассчитывают по формуле:

где T - время проведения одного цикла, ч;

С - концентрация кислоты: 0,1-2,0 г-моль/л;

t - температура процесса: 70-100°С;

К - коэффициент пропорциональности, значения которого находятся в пределах 10-15,

жидкую фазу после отделения от остатка пектина подвергают дополнительному гидролизу, время которого рассчитывают по формуле:

где Т₁ - время дополнительного гидролиза жидкой фазы, ч;

С - концентрация кислоты: 0,1-2,0 г-моль/л;

t - температура процесса: 70-100°С;

К₁ - коэффициент пропорциональности для проведения дополнительного гидролиза жидкой фазы, значения которого находятся в пределах 1,7-2,5;

при этом перед осаждением низкомолекулярных продуктов гидролиза пектина органическим растворителем жидкую фазу нейтрализуют до рН не менее 4,0. После осаждения полученные низкомолекулярные продукты гидролиза пектина сушат.

Использование в качестве исходного сырья для гидролиза низкоэтерифицированного пектина со степенью этерификации не более 30%, имеющего ограниченную набухаемость в кислой среде, позволяет проводить процесс кислотного гидролиза в гетерофазной системе - суспензии: гель низкоэтерифицированного пектина (твердая фаза) - раствор минеральной кислоты (жидкая фаза), что, во-первых, позволяет на практике повысить концентрацию пектина в суспензии до 5-15% (в пересчете на сухое вещество пектина). Использование таких высоких, по сравнению с прототипом, концентраций исходного сырья при прочих равных условиях (при одинаковой степени гидролиза пектина) позволяет получать гидролизаты с соответственно большим процентным содержанием конечного продукта - олигогалактуронидов, что значительно уменьшает удельные затраты на производство единицы массы продукта и, как следствие, ведет к упрощению и удешевлению процесса получения целевого продукта.

Во-вторых, гидролиз пектина в гетерофазной системе позволяет вести процесс циклично, за счет чего удается полностью использовать исходное сырье и предупредить деградацию олигогалактуронидов в жидкой фазе, обеспечивая тем самым повышение выхода целевого продукта и понижение удельных затрат на его получение.

При увеличении степени этерификации более 30% происходит резкое увеличение объема набухшего геля пектина и значительное снижение его механической прочности, что существенно осложняет последующее отделение геля пектина от жидкой фазы, также возможен частичный переход высокомолекулярного пектина в жидкую фазу.

Для осуществления заявленного способа может быть использован практически любой коммерческий пектин. Для этого предварительно проводят снижение его степени этерификации до необходимой величины в пределах 0-30%, используя любой из известных методов деэтерификации: щелочной, кислотный или ферментативный. Наиболее удобным и экономичным, по мнению авторов, может считаться метод щелочной деэтерификации пектина в среде органического растворителя, например этанола или изопропанола. Данный метод приводится ниже в описании осуществления заявляемого способа.

Использование формул (I) и (II), разработанных авторами, позволяет в указанном диапазоне температур (70-100°С) и концентрации кислоты (0,1-2,0 г-моль/л) с помощью коэффициента пропорциональности К=10-15 с удовлетворительной точностью рассчитать время одного цикла гидролиза пектина, а с помощью коэффициента пропорциональности К₁=1,7-2,5 с удовлетворительной точностью рассчитать время дополнительного гидролиза жидкой фазы, необходимые для получения продукта с максимальным относительным содержанием фракции олигогалактуронидов 1-5 кДа.

Проведение дополнительного гидролиза жидкой фазы позволяет увеличить содержание в конечном продукте целевой фракции олигогалактуронидов 1-5 кДа за счет гидролиза высокомолекулярной фракции олигогалактуронидов (более 5 к Да). При этом время гидролиза, рассчитанное по формуле (II) при коэффициенте пропорциональности К₁=1,7-2,5, позволяет проводить дополнительный гидролиз жидкой фазы таким образом, что прирост целевой фракции олигогалактуронидов за счет гидролиза высокомолекулярной фракции олигогалактуронидов существенно превышает убыль данной целевой фракции, происходящую вследствие ее частичного гидролиза и перехода в низкомолекулярную фракцию олигогалактуронидов (менее 1 кДа).

В ходе исследования авторами гетерофазного кислотного гидролиза низкоэтерифицированного пектина было установлено, что олигогалактурониды с молекулярной массой 1-5 кДа, образовавшиеся в ходе гидролиза пектина, практически полностью переходят в раствор - жидкую фазу, в то время как доля таких молекул, оставшихся в пектиновом геле - твердой фазе, не превышает 1-2% от их общего количества. Таким образом, важным преимуществом предлагаемого метода гетерофазного кислотного гидролиза низкоэтерифицированного пектина является наличие эффективной и постоянной молекулярной сепарации, происходящей естественным путем непосредственно в процессе самого гидролиза.

Сочетание в данном способе эффекта межфазной молекулярной сепарации и технологической простоты разделения фаз позволяет останавливать процесс гидролиза в нужный момент времени, быстро отделять жидкую фазу, содержащую готовый продукт, и затем проводить следующий цикл гидролиза оставшегося высокомолекулярного пектина.

Указанные ограничения температуры и концентрации кислоты связаны, в первую очередь, с экономическими и технологическими причинами. Так, при температуре среды ниже 70°С и концентрации кислоты ниже 0,1 г-моль/л происходит существенное снижение скорости гидролиза пектина и значительное увеличение времени процесса, это ведет к повышению затрат на производство целевого продукта.

При температуре более 100°С резко ускоряются процессы термического разложения олигогалактуронидов - разрывы пиранозного цикла, окисление, декарбоксилирование, образование фурфурола и его производных. Это сопровождается снижением выхода олигогалактуронидов и загрязнением гидролизата продуктами их разложения. Увеличение концентрации кислоты более 2,0 г-моль/л не дает значительного увеличения скорости гидролиза, но приводит к существенному перерасходу кислоты и дополнительным затратам на ее последующую нейтрализацию и освобождение продукта от образовавшихся солей, что, в конечном результате, ведет к усложнению процесса получения целевого продукта.

Нейтрализация жидкой среды до рН не менее 4,0 перед осаждением низкомолекулярных продуктов гидролиза пектина органическим растворителем обеспечивает получение осадка пектина олигогалактуронидов с оптимальной консистенцией - плотного, хорошо отделяющегося от жидкой фазы. При рН ниже 4,0 происходит увеличение удельного объема осадка и ослабление его структуры, и, как следствие, затрудняется отделение осадка от жидкой фазы.

В качестве минеральной кислоты могут быть использованы, в частности, соляная, серная, азотная кислоты.

В качестве органического растворителя могут быть использованы известные органические растворители, смешивающиеся с водой, в частности ацетон, пропанол, изопропанол, этанол, метанол.

Отделение жидкой фазы от нерастворимого осадка можно вести либо фильтрацией, либо центрифугированием при сравнительно небольших величинах центробежного ускорения 500-1000 g. Это значительно снижает затраты и упрощает процесс получения целевого продукта по сравнению с прототипом, поскольку в прототипе центрифугирование ведут при ускорении 20000 g и температуре 4°С.

Еще одним преимуществом предлагаемого способа является возможность поддержания постоянного количества низкоэтерифицированного пектина в реакционной среде путем добавления новых порций сырья к остатку пектина после отделения жидкой фазы для компенсации его расхода в ходе гидролиза. Это позволяет проводить подряд любое количество однотипных циклов гидролиза и получать любое требуемое количество целевого продукта с нужной молекулярной массой, 1-5 кДа.

Сырье может добавляться к остатку пектина после каждого или после нескольких циклов гидролиза, а его количество может быть рассчитано либо по изменению объема геля пектина, либо по количеству пектина, оставшегося после отделения жидкой фазы.

В первом случае для определения количества добавляемого сырья по изменению объема геля пектина перед проведением гидролиза суспензию пектина в минеральной кислоте центрифугируют при относительном центробежном ускорении 500-1000 g в течение 5-15 минут и фиксируют первоначальный объем геля - пектина, V₁, мл. Перед проведением последующих циклов гидролиза остаток пектина после гидролиза центрифугируют в тех же условиях - при той же величине относительного центробежного ускорения и времени, фиксируя V₂ - объем остатка пектина после гидролиза, мл.

Для определения количества добавляемого сырья по объему остатка пектина после центрифугирования его рассчитывают по формуле:

где m - масса добавляемого сырья, г;

m₁ - масса исходного сырья, г;

V₁ - первоначальный объем набухшего сырья - геля низкоэтерифицированного пектина, мл;

V₂ - объем остатка пектина после гидролиза, мл.

Использование для расчета формулы (III), предлагаемой авторами, позволяет с достаточной точностью определить массу добавляемого сырья, обеспечивающего восстановление содержания пектина до исходной концентрации. В конечном результате это обеспечивает максимально полное использование остатка пектина, повышение выхода целевого продукта и возможность получения его в необходимом количестве.

Во втором случае для определения количества добавляемого сырья по количеству пектина, оставшегося после отделения жидкой фазы, перед началом процесса гидролиза фиксируют массу исходного сырья, m₁, также определяют в нем содержание галактуроновой кислоты, С₁. По окончании времени гидролиза, рассчитанного по формуле (I), отделяют остаток пектина от жидкой фазы, фиксируют его массу m₂ и определяют содержание в нем галактуроновой кислоты С₂.

Количество добавляемого сырья рассчитывают по формуле:

где m - масса добавляемого сырья, г;

m₁ - масса исходного сырья, г;

m₂ - масса остатка пектина после отделения жидкой фазы, г;

С₁ - содержание галактуроновой кислоты в исходном сырье, %;

С₂ - содержание галактуроновой кислоты в остатке пектина, %.

Формула (IV), предлагаемая авторами, так же, как и формула (III), позволяет с необходимой точностью определять количество добавляемого сырья.

Для определения содержания галактуроновой кислоты в исходном сырье и остатке пектина может быть использован любой из известных методов, например титриметрический (Афанасьев С.П., Чирва В.Ю., Кацева Г.Н. и др. Модификация титриметрических методов анализа пектиновых веществ // Химия природ. соединений. 1984. №4. С.428-431) или фотометрический (Blumenkrantz N., Asboe-Hansen G. New method for quantitative determination of uronic acids // Anal. Biochem. 1973. Vol.54. P.484-489). Учитывая, что в ходе каждого цикла гидролиза расходуется примерно одинаковое количество сырья, то нет необходимости проводить расчеты количества добавляемого сырья после каждого цикла гидролиза - достаточно проводить их через каждые 5-10 циклов.

Способ осуществляется следующим образом.

Пример 1.

Берут 30,0 г пектовой кислоты (Serva, №31680) с содержанием галактуроновой кислоты 82,2% и степенью этерификации менее 1% и смешивают с 200 мл раствора соляной кислоты концентрацией 0,1 г-моль/л (С). Полученную 15% суспензию нагревают до 100°С (t) на кипящей водяной бане и выдерживают при этой температуре и постоянном перемешивании в течение времени (Т), рассчитанного по формуле (I) при коэффициенте пропорциональности К=15:

Затем суспензию охлаждают и фильтруют, для фильтрации суспензии используют полипропиленовую фильтр-ткань PL-30 (LOSMA, Италия). Остаток пектина на фильтре промывают 200 мл соляной кислоты концентрацией 0,1 г-моль/л (С) для более полного отделения олигогалактуронидов. К остатку пектина добавляют раствор соляной кислоты концентрацией 0,1 г-моль/л до восстановления первоначального объема суспензии. Остаток пектина ресуспендируют в жидкой фазе и проводят следующий цикл гидролиза в прежних условиях - Т=3,4 часа при t=100°C. Всего проводят 5 циклов гидролиза, каждый раз отделяя и промывая остаток пектина, как было описано выше. Общий объем полученного фильтрата составляет 1440 мл, содержание олигогалактуронидов - 7,02 мг/мл.

Полученную жидкую фазу подвергают дополнительному гидролизу при 100°С (t) в течение времени (Т₁), рассчитанного по формуле (II) при коэффициенте пропорциональности К₁=2,5:

Затем жидкую фазу охлаждают до комнатной температуры, нейтрализуют до рН 4,0 5,0 М раствором гидроокиси натрия и осаждают олигогалактурониды добавлением 4,3 л этанола. Смесь интенсивно перемешивают в течение минуты, затем спустя 12 часов выпавший осадок олигогалактуронидов отделяют центрифугированием при ОЦУ 1000-1500 g в течение 15 минут и сушат при 80°С. Выход продукта - сухого порошка олигогалактуроната натрия - 11,41 г (содержание в олигогалактуронате натрия чистой галактуроновой кислоты составляет 88,5%). Для определения относительного (по сырью) выхода продукта, в пересчете на галактуроновую кислоту, устанавливают расход сырья по разнице между общим количеством пектовой кислоты, использованной для гидролиза (30,0 г), и количеством пектина, оставшимся после гидролиза. Для этого количество пектовой кислоты пересчитывают на содержание в ней галактуроновой кислоты, а в остатке пектина определяют общее содержание галактуроновой кислоты фотометрическим методом. Установленный расход сырья составляет по галактуроновой кислоте 11,28 г. Относительный выход продукта по галактуроновой кислоте составляет соответственно 89,5%. По данным эксклюзионной хроматографии полученного продукта в 0,05 М ацетатном буфере с рН 3,0 на колонке с сефадексом G-50 superfine, откалиброванной с помощью стандартного набора пуллуланов, относительное содержание фракции олигогалактуронидов 1-5 кДа в полученном низкомолекулярном пектине составляет 72,5%.

Пример 2.

Берут 10,0 г пектовой кислоты (Serva, №31680) (m₁) с содержанием галактуроновой кислоты 82,2% и степенью этерификации менее 1% и смешивают с 200 мл раствора соляной кислоты концентрацией 0,1 г-моль/л (С), фиксируют объем полученной 5% суспензии - он составляет 210 мл, затем суспензию центрифугируют 15 минут при относительном центробежном ускорении (ОЦУ) 500 g и фиксируют первоначальный объем геля пектина - он составляет 48 мл (V₁). Затем осадок геля пектина ресуспендируют в жидкой фазе, нагревают до 100°С (t) на кипящей водяной бане и выдерживают при этой температуре и постоянном перемешивании в течение времени (Т), рассчитанного по формуле (I) при коэффициенте пропорциональности К=15:

Затем суспензию охлаждают до комнатной температуры и центрифугируют 15 минут при ОЦУ 500 g. Жидкую фазу отделяют от осадка геля пектина, замеряют объем осадка - он составляет 41,2 мл (V2). Подставляя полученные данные по первоначальному объему низкоэтерифицированного геля пектина (V₁) и объему остатка геля пектина после гидролиза (V₂) в формулу (III), рассчитывают необходимую добавку сырья (m) для восстановления первоначального количества пектовой кислоты:

К осадку добавляют указанное количество пектовой кислоты и раствор соляной кислоты концентрацией 0,1 г-моль/л (С) до восстановления первоначального объема суспензии. Осадок ресуспендируют в жидкой фазе и проводят следующий цикл гидролиза в прежних условиях - 3,4 часа при 100°С. Всего проводят 5 циклов гидролиза. При этом каждый раз после отделения жидкой фазы замеряют объем осадка пектина: если он остается постоянным (равным 41,2 мл (V₂)), то количество сырья, добавляемое к остатку пектина, также остается постоянным - 1,42 г (m), если объем осадка изменяется, то по формуле (II) заново рассчитывают необходимую добавку сырья. Объем полученного фугата - жидкой фазы - составляет 810 мл, содержание олигогалактуронидов - 6,10 мг/мл. Полученную жидкую фазу подвергают дополнительному гидролизу при 100°С (t) в течение времени (Т₁), рассчитанного по формуле (II) при коэффициенте пропорциональности К₁=2,5:

Затем жидкую фазу охлаждают до комнатной температуры, нейтрализуют до рН 4,0 5,0 М раствором гидроокиси натрия и осаждают олигогалактурониды добавлением 2,4 л ацетона. Смесь интенсивно перемешивают в течение минуты, затем спустя 12 часов выпавший осадок олигогалактуронидов отделяют центрифугированием при ОЦУ 1000-1500 g в течение 15 минут и сушат при 80°С. Выход продукта - сухого порошка олигогалактуроната натрия - 5,55 г. Относительный выход продукта по галактуроновой кислоте, определенный как описано в предыдущем примере, составляет соответственно 89,1%. Относительное содержание фракции олигогалактуронидов 1-5 кДа в полученном низкомолекулярном пектине составляет 72,0%.

Пример 3.

Получают низкоэтерифицированный пектин со степенью этерификации 30% путем контролируемой щелочной деэтерификации высокоэтерифицированного пектина.

Берут 50 г высокоэтерифицированного цитрусового пектина (Herbstreith & Fox KG, Германия), суспендируют в 0,5 л 60% об. этанола и постепенно порциями добавляют 5,0 М раствор гидроокиси натрия, контролируя величину степени этерификации пектина в пробах, взятых после добавления каждой порции гидроокиси натрия. После достижения величины степени этерификации 30% к суспензии добавляют 20 мл концентрированной соляной кислоты (плотность - d=1,19 г/см³), пектин отделяют фильтрованием, промывают 150 мл 50% этанола и сушат при 80°С. Выход низкоэтерифицированного пектина - 47 г, содержание галактуроновой кислоты - 74,8%, степень этерификации - 30,0%.

Берут 10,0 г полученного низкоэтерифицированного пектина (m₁), смешивают с 200 мл раствора соляной кислоты концентрацией 0,5 г-моль/л (С) и фиксируют объем полученной 5% суспензии - он составляет 210 мл, затем суспензию центрифугируют 5 минут при ОЦУ 1000 g и фиксируют первоначальный объем геля пектина - он составляет 112 мл (V₁). Затем осадок геля пектина ресуспендируют в жидкой фазе и термостатируют при 80°С (t) и постоянном перемешивании в течение времени (Т), рассчитанного по формуле (I) при коэффициенте пропорциональности К=10:

Затем суспензию охлаждают до комнатной температуры и центрифугируют 5 минут при ОЦУ 1000 g. Жидкую фазу отделяют от осадка геля пектина, а осадок дважды промывают раствором кислоты для более полного отделения олигогалактуронидов: осадок суспендируют в 100 мл соляной кислоты концентрацией 0,5 г-моль/л (С), затем центрифугируют 5 минут при ОЦУ 1000 g, жидкую фазу сливают и повторяют промывку осадка. После промывки замеряют объем осадка пектина после гидролиза - он составляет 98,5 мл (V₂). Подставляя полученные значения V₁, V₂ и m₁ в формулу (III), рассчитывают необходимую добавку сырья (m) для восстановления первоначального количества пектина:

К осадку добавляют указанное количество низкоэтерифицированного пектина (1,43 г) и раствор соляной кислоты концентрацией 0,5 г-моль/л (С) до восстановления первоначального объема суспензии. Осадок ресуспендируют в жидкой фазе и проводят следующий цикл гидролиза в прежних условиях - Т=5,8 часа при t=80°C. Всего проводят 5 циклов гидролиза. При этом каждый раз после отделения жидкой фазы замеряют объем осадка: если он остается постоянным (равным 98,5 мл), то количество сырья, добавляемое к остатку пектина, также остается постоянным - 1,21 г, если объем осадка изменяется, то по формуле (II) заново рассчитывают необходимую добавку сырья. Объем полученного фугата - жидкой фазы - составляет 1450 мл, содержание олигогалактуронидов - 2,94 мг/мл. Полученную жидкую фазу подвергают дополнительному гидролизу при 80°С (t) в течение времени (Т₁), рассчитанного по формуле (II) при коэффициенте пропорциональности К₁=1,7:

Затем жидкую фазу охлаждают до комнатной температуры и нейтрализуют: в начале сухой гидроокисью натрия до рН 1-2, затем 5,0 М раствором гидроокиси натрия до рН 6,0. Олигогалактурониды осаждают добавлением 4,5 л этанола. Выпавший осадок олигогалактуронидов отделяют центрифугированием 15 минут при ОЦУ 1000-1500 g, затем очищают от солей: ресуспендируют в 0,6 л 70% этанола и повторно центрифугируют. Влажный осадок сушат при 80°С. Выход продукта - сухого порошка олигогалактуроната натрия - 4,81 г. Относительный выход продукта по галактуроновой кислоте, определенный как описано в предыдущем примере, составляет 94,5%. Относительное содержание фракции олигогалактуронидов 1-5 кДа в полученном низкомолекулярном пектине составляет 78,0%.

Пример 4.

Берут 30 г пектовой кислоты (см. пример 1) (m₁) с содержанием галактуроновой кислоты 82,2% (С₁), смешивают с 200 мл раствора серной кислоты концентрацией 2,0 моль/л (С) и фиксируют объем полученной 15% суспензии - он составляет 230 мл. Суспензию термостатируют при 70°С (t) и постоянном перемешивании в течение времени (Т), рассчитанного по формуле (I) при коэффициенте К=10:

Затем горячую суспензию фильтруют, для фильтрации суспензии используют полипропиленовую фильтр-ткань PL-30 (LOSMA, Италия). Остаток пектина на фильтре промывают 200 мл серной кислоты концентрацией 2,0 моль/л (С) для более полного отделения олигогалактуронидов. Полученный фильтрат охлаждают до комнатной температуры. Остаток пектина взвешивают и определяют в нем процентное содержание галактуроновой кислоты титриметрическим методом. По полученным значениям массы остатка пектовой кислоты - 127,5 г (m₂), содержания в нем галактуроновой кислоты - 16,4% (С₂) и содержания галактуроновой кислоты в исходном сырье (пектовой кислоте) - 82,2% (С₁) рассчитывают по формуле (IV) необходимую добавку сырья (m) для восстановления первоначального количества пектовой кислоты:

К остатку пектина добавляют рассчитанное количество пектовой кислоты (m) и раствор серной кислоты концентрацией 2,0 моль/л (С) до восстановления первоначального объема суспензии. Остаток пектина ресуспендируют в жидкой фазе и проводят следующий цикл гидролиза в прежних условиях - Т=6,25 часа при t=70°C. Всего проводят 5 циклов гидролиза. При этом каждый раз после отделения жидкой фазы остаток пектина снова взвешивают, определяют в нем процентное содержание галактуроновой кислоты и по формуле (IV) рассчитывают необходимую добавку сырья. Общий объем полученного фильтрата составляет 1285 мл, содержание олигогалактуронидов - 14,0 мг/мл. Полученную жидкую фазу подвергают дополнительному гидролизу при 70°С (t) в течение времени (T₁), рассчитанного по формуле (II) при коэффициенте пропорциональности К₁=1,7:

Затем жидкую фазу охлаждают до комнатной температуры и нейтрализуют: в начале сухой гидроокисью натрия до рН 1-2, затем 5,0 М раствором гидроокиси натрия до рН 8. Олигогалактурониды осаждают добавлением 4,0 л изопропанола. Выпавший осадок олигогалактуронидов отделяют центрифугированием 15 минут при ОЦУ 1000-1500 g, затем очищают от солей: ресуспендируют в 2,0 л 70% изопропанола и повторно центрифугируют. Влажный осадок сушат при 80-100°С. Выход продукта - сухого порошка олигогалактуроната натрия - 20,26 г. Относительный выход продукта по галактуроновой кислоте составляет 96,0%. Относительное содержание фракции олигогалактуронидов 1-5 кДа в полученном низкомолекулярном пектине составляет 81%.

Пример 5.

Получают низкоэтерифицированный пектин. Для этого в 0,5 л 50% этанола растворяют 20,0 г гидроокиси натрия, затем при перемешивании добавляют 100,0 г высокоэтерифицированного цитрусового пектина (Herbstreith & Fox KG, Германия). Смесь перемешивают 50 мин, затем постепенно небольшими порциями добавляют 40,0 мл концентрированной соляной кислоты, пектин отделяют фильтрованием, промывают 300 мл 50% этанола и сушат при 80°С. Выход низкоэтерифицированного пектина - 93,3 г, содержание галактуроновой кислоты - 76,5% (C₁), степень этерификации - 0%.

Берут 20,0 г (m₁) полученного низкоэтерифицированного пектина, смешивают с 200 мл раствора азотной кислоты концентрацией 0,5 г-моль/л (С) и фиксируют объем полученной 10% суспензии - он составляет 220 мл. Суспензию термостатируют при t=90°C и постоянном перемешивании в течение времени (Т), рассчитанного по формуле (I) при коэффициенте К=12:

По окончании гидролиза суспензию охлаждают и фильтруют, для фильтрации суспензии используют полипропиленовую фильтр-ткань PL-30. Остаток пектина на фильтре промывают 150 мл азотной кислоты концентрацией 0,5 г-моль/л (С) для более полного отделения олигогалактуронидов. К остатку пектина добавляют раствор азотной кислоты концентрацией 0,5 г-моль/л (С) до восстановления первоначального объема суспензии. Остаток пектина ресуспендируют в жидкой фазе и проводят следующий цикл гидролиза в прежних условиях - 3,0 часа (Т) при 90°С (t). Всего проводят 3 цикла гидролиза. Промытый остаток пектина после последнего цикла гидролиза взвешивают и определяют в нем процентное содержание галактуроновой кислоты титриметрическим методом. По полученным значениям массы остатка пектина - 59,2 г (m₂) и содержания в нем галактуроновой кислоты - 17,1% (С2) рассчитывают по формуле (IV) необходимую добавку сырья (m) для восстановления первоначального количества пектина:

К остатку пектина добавляют указанное количество низкоэтерифицированного пектина и проводят следующие 3 цикла гидролиза в прежних условиях. Общий объем полученного фильтрата составляет 1660 мл, содержание олигогалактуронидов - 5,79 мг/мл. Полученную жидкую фазу подвергают дополнительному гидролизу при 80°С (t) в течение времени (Т₁), рассчитанного по формуле (II) при коэффициенте пропорциональности К₁=2,0:

Затем жидкую фазу охлаждают до комнатной температуры и нейтрализуют: в начале сухой гидроокисью натрия до рН 1-2, затем 5,0 М раствором гидроокиси натрия до рН 5. Олигогалактурониды осаждают добавлением 5,0 л этанола. Выпавший осадок олигогалактуронидов отделяют центрифугированием 15 минут при ОЦУ 1000-1500 g, затем очищают от солей: ресуспендируют в 1,3 л 70% об. этанола и повторно центрифугируют. Влажный осадок сушат при 80°С. Выход продукта - сухого порошка олигогалактуроната натрия - 10,85 г. Относительный выход продукта по галактуроновой кислоте составляет 93,7%. Относительное содержание фракции олигогалактуронидов 1-5 к Да в полученном низкомолекулярном пектине составляет 76,5%.

Пример 6.

Получают низкоэтерифицированный пектин.

В 0,4 л 50% об. изопропанола растворяют 20 г гидроокиси натрия, затем при перемешивании добавляют 100 г высокоэтерифицированного яблочного пектина (Herbstreith & Fox KG, Германия). Смесь перемешивают 10 мин, затем постепенно небольшими порциями добавляют 40 мл концентрированной соляной кислоты, пектин отделяют фильтрованием, промывают 300 мл 50% изопропанола и сушат при 80-100°С. Выход низкоэтерифицированного пектина - 94,5 г, содержание галактуроновой кислоты - 78,4% (С₁), степень этерификации - 13,8%.

Берут 20 г полученного низкоэтерифицированного пектина (m₁), смешивают с 200 мл раствора серной кислоты концентрацией 1,0 моль/л (С) и фиксируют объем полученной 10% суспензии - он составляет 220 мл. Суспензию термостатируют при t=90°C и постоянном перемешивании в течение времени (Т), рассчитанного по формуле (I) при коэффициенте К=13:

Затем суспензию охлаждают и фильтруют, для фильтрации суспензии используют полипропиленовую фильтр-ткань PL-30. Остаток пектина на фильтре промывают 150 мл серной кислоты концентрацией 1,0 моль/л (С) для более полного отделения олигогалактуронидов. Остаток пектина взвешивают и определяют в нем процентное содержание галактуроновой кислоты титриметрическим методом. По полученным значениям массы остатка пектина - 79,2 г (m₂) и содержания в нем галактуроновой кислоты - 16,2% (С₂) рассчитывают по формуле (IV) необходимую добавку сырья (m) для восстановления первоначального количества пектина:

К остатку пектина добавляют указанное количество низкоэтерифицированного пектина и раствор серной кислоты концентрацией 1,0 моль/л (С) до восстановления первоначального объема суспензии. Остаток пектина ресуспендируют в жидкой фазе и проводят следующий цикл гидролиза в прежних условиях Т=2,0 часа при t=90°C. Всего проводят 5 циклов гидролиза. При этом каждый раз после отделения жидкой фазы к остатку пектина добавляют 3,63 г низкоэтерифицированного пектина (m). Так как в ходе проведенного гидролиза пектина может возникнуть некоторое допустимое расхождение между количеством добавленного сырья и реальной величиной расхода сырья, то для устранения такого возможного расхождения после 5 циклов гидролиза снова проводят расчет необходимой добавки сырья. Для этого промытый остаток пектина после последнего цикла гидролиза снова взвешивают и определяют в нем процентное содержание галактуроновой кислоты титриметрическим методом. По полученным значениям массы остатка пектина - 85,7 г (m₂) и содержания в нем галактуроновой кислоты - 15,5% (С₂) рассчитывают по формуле (IV) необходимую разовую корректирующую добавку сырья (m) для восстановления первоначального количества пектина:

К остатку пектина добавляют указанное количество низкоэтерифицированного пектина. Затем проводят следующие 5 циклов гидролиза в прежних условиях. При этом каждый раз после отделения жидкой фазы к остатку пектина по-прежнему добавляют 3,63 г низкоэтерифицированного пектина. Общий объем полученного фильтрата составляет 2810 мл, содержание олигогалактуронидов - 9,10 мг/мл. Полученную жидкую фазу подвергают дополнительному гидролизу при 90°С (t) в течение времени (Т₁), рассчитанного по формуле (II) при коэффициенте пропорциональности К₁=2,2:

Затем жидкую фазу охлаждают до комнатной температуры и нейтрализуют: в начале сухой гидроокисью натрия до рН 1-2, затем 5,0 М раствором гидроокиси натрия до рН 5. Олигогалактурониды осаждают добавлением 8,0 л изопропанола. Выпавший осадок олигогалактуронидов отделяют центрифугированием 15 минут при ОЦУ 1000-1500 g, затем очищают от солей: ресуспендируют в 2,6 л 70% об. изопропанола и повторно центрифугируют. Влажный осадок сушат при 80-100°С. Выход продукта - сухого порошка олигогалактуроната натрия - 28,81 г. Относительный выход продукта по галактуроновой кислоте составляет 91,1%. Относительное содержание фракции олигогалактуронидов 1-5 кДа в полученном низкомолекулярном пектине составляет 73,8%.

Как видно из приведенных примеров, заявляемый способ гетерофазного гидролиза позволяет за счет нерастворимости исходного пектина в кислоте проводить гидролиз целенаправленно до получения продукта с необходимой молекулярной массой и при этом использовать исходный пектин практически полностью, т.е. позволяет избегать каких-либо значительных технологических потерь сырья и повысить конечный выход продукта (по галактуроновой кислоте) по сравнению с прототипом в 2,6-2,8 раза до 89-96% от исходного сырья.

Кроме того, в заявляемом способе в отличие от известного способа гидролиз сырья ведется отдельными, сравнительно короткими циклами, что позволяет существенно ограничить деструкцию олигогалактуронидов в процессе гидролиза и, как следствие, дополнительно повысить выход целевого продукта.

Более того, предлагаемое авторами техническое решение обеспечивает по сравнению с прототипом более высокую скорость процесса и соответственно снижение удельных производственных затрат и времени на выпуск одного килограмма продукта при значительной экономии сырья, также позволяет отказаться от использования сложного и дорогостоящего технологического оборудования для отделения жидкой фазы от остатка пектина.

Изобретение относится к способам получения низкомолекулярного пектина. Способ предусматривает гидролиз пектина в водном растворе минеральной кислоты при нагревании. Далее жидкую фазу отделяют от нерастворимого остатка пектина и нейтрализуют до рН не менее 4,0. Выделение низкомолекулярных продуктов гидролиза пектина проводят путем их осаждения органическим растворителем, смешивающимся с водой. После осаждения полученные низкомолекулярные продукты гидролиза пектина сушат. При этом в качестве исходного сырья для гидролиза используют низкоэтерифицированный пектин со степенью этерификации не более 30%. Гидролиз ведут циклично. При этом время проведения одного цикла рассчитывают по определенной формуле. Жидкую фазу после отделения от остатка пектина подвергают дополнительному гидролизу. При этом время проведения одного цикла дополнительного гидролиза рассчитывают по формуле. Изобретение позволяет получать низкомолекулярный пектин без технологических потерь сырья, а также существенно обеспечить деструкцию олигогалактуронидов, тем самым повышая конечный выход продукта. 1 з.п. ф-лы.

1. Способ получения низкомолекулярного пектина, включающий гидролиз пектина в водном растворе минеральной кислоты при нагревании с последующим отделением жидкой фазы от нерастворимого остатка пектина, выделением из нее низкомолекулярных продуктов гидролиза пектина путем их осаждения органическим растворителем, смешивающимся с водой, отличающийся тем, что в качестве исходного сырья для гидролиза используют низкоэтерифицированный пектин со степенью этерификации не более 30%, гидролиз ведут циклично, при этом время проведения одного цикла рассчитывают по формуле:

где Т - время проведения одного цикла, ч;
С - концентрация кислоты 0,1-2,0 г-моль/л;
t - температура процесса 70-100°С;
К - коэффициент пропорциональности, значения которого находятся в пределах 10-15;
жидкую фазу после отделения от остатка пектина подвергают дополнительному гидролизу, время которого рассчитывают по формуле:

где Т₁ - время дополнительного гидролиза жидкой фазы, ч;
С - концентрация кислоты 0,1-2,0 г-моль/л;
t - температура процесса 70-100°С;
К₁ - коэффициент пропорциональности для проведения дополнительного гидролиза жидкой фазы, значения которого находятся в пределах 1,7-2,5;
перед осаждением низкомолекулярных продуктов гидролиза пектина органическим растворителем жидкую фазу нейтрализуют до рН не менее 4,0, а после осаждения низкомолекулярные продукты гидролиза пектина сушат.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что после каждого или нескольких циклов гидролиза к остатку пектина добавляют новую порцию сырья, количество которого рассчитывают по формуле:

где m - масса добавляемого сырья, г;
m₁ - масса исходного сырья, г;
V₁ - объем геля пектина до гидролиза, мл;
V₂ - объем остатка геля пектина после гидролиза, мл,
при этом V₁ и V₂ определяют после центрифугирования геля пектина, или по формуле:

где m - масса добавляемого сырья, г;
m₁ - масса исходного сырья, г;
m₂ - масса остатка пектина после отделения жидкой фазы, г;
C₁ - содержание галактуроновой кислоты в исходном сырье, %;
С₂ - содержание галактуроновой кислоты в остатке пектина, %.