СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГЕПТАГАЛАКТУРОНИДА Российский патент 2015 года по МПК C08B37/06 

Изобретение относится к способам получения индивидуальных олигогалактуронидов - низкомолекулярных производных полигалактуроновой кислоты, и может быть использовано в различных отраслях промышленности, науки и медицины, в частности в фармацевтической промышленности для создания низкомолекулярных сорбентов, противоопухолевых препаратов и систем адресной доставки лекарственных веществ, а также для стандартизации образцов поли- и олигоуронидов.

Полигалактуроновая кислота является основой молекул пектинов - высокомолекулярных природных полимеров, входящих в состав первичных клеточных стенок и срединных пластинок всех высших цветковых растений. Часть остатков полигалактуроновой кислоты в пектине находится в форме метиловых эфиров. Если доля таких остатков составляет менее 50%, то такой пектин считается низкоэтерифицированным. Полностью деэтерифицированный, то есть не содержащий метиловых эфиров или содержащий незначительное их количество, пектин называется также пектовой кислотой.

Получение индивидуальных олигогалактуронидов включает два этапа. В начале получают смесь олигогалактуронидов путем деполимеризации пектинов или деполимеризацией чистой полигалактуроновой кислоты, предварительно выделенной из пектинов. Для этого может применяться ряд известных методов, из которых наиболее распространенными являются ферментативный и кислотный гидролиз пектиновых веществ. На втором этапе осуществляют сепарацию полученной смеси олигогалактуронидов с выделением индивидуальных олигомеров. В настоящее время практически единственным известным способом получения индивидуальных олигогалактуронидов является метод препаративной жидкостной хроматографии.

Так, известен метод получения олигогалактуронидов со степенью полимеризации от 2 до 7 с использованием автоматизированного комплекса препаративной высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЖЭХ) (Hotchkiss A., Hicks K., Doner L., Irwin P. Isolation of oligogalacturonic acids ingram quantities by preparative h.p.l.c. // Carbohydrate Research. 1991. Vol. 215. P. 81-90). Согласно этому методу полигалактуроновую кислоту в виде 1% раствора в начале гидролизуют до олигогалактуронидов с помощью пектинолитических ферментов - полигалактуроназы и пектат-лиазы - в 11,5 мМ Трис-буфере с рН 8,5 при 30°С и непрерывном перемешивании. Полученный гидролизат нейтрализуют, затем упаривают при 35°С под вакуумом до минимального объема и сушат в лиофильной сушилке. Затем полученную смесь олигогалактуронидов со степенью полимеризации от 2 до 12 разделяют на препаративной ионообменной колонке Dynamax - 60 A NH₂ (21,4*250 мм) в изократическом режиме: элюент - 0,85-0,9 М ацетатный буфер с рН 5, скорость мобильной фазы - 10 мл/мин. При работе хроматографического комплекса в непрерывном (повторно-циклическом) режиме его производительность составляла 10,9 мг/ч по высшему разделяемому олигомеру - гептагалактурониду (степень полимеризации - 7). Чистота получаемого гептагалактуронида составляла около 98%, выход - 1,9% от общего содержания олигогалактуронидов.

Недостатком данного метода является низкий выход высших олигогалактуронидов. Данный недостаток является общим для методов, использующих ферментативный способ гидролиза полигалактуроновой кислоты, так как в силу специфики действия большинства пектинолитических ферментных препаратов в продуктах гидролиза преобладают олигогалактурониды со степенью полимеризации меньше 7.

К недостаткам данного метода следует отнести также низкую производительность использованной хроматографической системы при получении высших олигогалактуронидов - 10,9 мг/ч по гептагалактурониду, притом что авторы позиционируют данный автоматизированный комплекс препаративной ВЖЭХ как один из самых высокопроизводительных. С учетом высокой стоимости данного комплекса и высоких затрат на его эксплуатацию такая низкая производительность по высшим олигогалактуронидам может сделать их производство на указанном комплексе нерентабельным.

Известен способ получения олигогалактуронидов путем кислотного гидролиза пектина (патент РФ № 2441025, МПК C08B 37/06, опубл. 27.01.2012 г.). Согласно этому способу в качестве исходного сырья используют низкоэтерифицированный пектин со степенью этерификации не более 30%, нерастворимый в кислой среде, что позволяет проводить процесс гидролиза пектина в гетерофазной системе (суспензии). Это позволяет повысить концентрацию пектина до 5-15% и, соответственно, увеличить содержание олигогалактуронидов в гидролизате. Гидролиз низкоэтерифицированного пектина ведут в 0,1-2,0 М растворе минеральной кислоты и при температуре 70-100°С, время процесса рассчитывается по специальной формуле. Жидкий гидролизат отделяют от остатка пектина (который затем может использоваться для следующего цикла гидролиза) фильтрацией или центрифугированием и нейтрализуют до рН не менее 4,0 М раствором гидроксида натрия. Олигогалактурониды осаждают из гидролизата добавлением органического растворителя (этанола, изопропанола или ацетона) до концентрации 70%, осадок олигогалактуронидов отделяют центрифугированием и сушат при 80°С.

Недостатком данного способа является то, что способ не позволяет выделить индивидуальный гептагалактуронид из получаемой смеси олигогалактуронидов.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату к заявляемому способу является способ получения олигогалактуронидов со степенью полимеризации от 6 до 16 путем кислотного гидролиза цитрусового пектина и последующего разделения олигогалактуронидов с использованием препаративной хроматографии низкого давления (Lo V.-M., Hahn M., Halbeek H. Preparation, purification, and structural characterization of linear oligogalacturonides. An FAB-mass spectrometric and NMR spectroscopic study // Carbohydrate Research. 1994. Vol. 255. P. 271-284). Согласно этому способу цитрусовый пектин общей массой 10 г гидролизуют в 2 М трифторуксусной кислоте при 85°С и концентрации пектина 1% в течение 4 часов при периодическом перемешивании, затем охлаждают и фильтруют. Полученный фильтрат сушат до пастообразного состояния под вакуумом при 35°С, промывают метанолом - 4 раза по 10 мл, сушат, затем суспендируют в 100 мл деионизированной воды и доводят рН смеси до 7 с помощью 5 М раствора имидазола. Смесь оставляют на ночь при 4°С и перемешивании, затем последовательно фильтруют через фильтры WhatmangF/A, Millipore HA 0,45 мкм, MilliporegS 0,22 мкм и конечный фильтрат лиофилизируют. В результате получают 3,5 грамма сухого гидролизата пектина, который по расчетам представляет собой смесь примерно равных количеств имидазола, нейтральных сахаров и олигогалактоуронидов. Полученный гидролизат пектина подвергают предварительному разделению на ионообменной хроматографической колонке (3*12 см) с QAE-Сефадексом. Для этого колонку уравновешивают 125 мМ имидазольным буфером с рН 7. 1 г сухого гидролизата пектина растворяют в 100 мл воды, доводят проводимость раствора до 6,7 мОм^-1 имидазольным буфером и загружают в колонку. Затем колонку последовательно элюируют имидазольным буфером (рН 7) с возрастающей концентрацией: 400 мл/125 мМ, 400 мл/550 мМ и 200 мл/750 мМ. Фракцию элюата, полученную с последней промывки (200 мл/750 мМ), концентрируют в роторном испарителе до объема 5 мл и обессоливают на колонке (3*18 см) с Сефадексом G-10. Затем обессоленную фракцию, содержащую олигогалактурониды со степенью полимеризации 6-16, разделяют на индивидуальные олигогалактурониды с помощью ионообменной хроматографии высокого разрешения на препаративной колонке (3,5*40 см) с Q-Сефарозой. Для этого на колонку, уравновешенную 450 мМ имидазольным буфером с рН 7, загружают 160 мг обессоленной фракции, растворенной в 40 мл того же буфера, и элюируют линейным градиентом имидазольного буфера концентрацией от 450 мМ (2,6 л) до 750 мМ (2,6 л). Собирают фракции по 10 мл, в которых определяют содержание уроновых кислот колориметрическим методом, и объединяют фракции, соответствующие выходу (пику) определенного олигогалактуронида. Объединенные фракции обессоливают на колонке с Сефадексом G-10 или диализом. Чистота полученного данным способом гептагалактуронида составляет около 90%. Количество гептагалактуронида, полученного за один цикл разделения исходной смеси олигогалактуронидов, составляет 11-14 мг, что соответствует расчетной величине выхода - 2,8-3,5% от общего содержания олигогалактуронидов в гидролизате.

Существенным недостатком данного способа является его сложность и многостадийность. Как видно из описания способа, перед осуществлением хроматографического разделения образцов требуется их длительная подготовка, связанная с проведением достаточно большого числа манипуляций с образцами и использование для этого различного, в том числе достаточно сложного и дорогостоящего, оборудования. При этом сам процесс хроматографического разделения при низком давлении является относительно долгим и трудоемким. Соотношение количества гептагалактуронида, получаемого за один цикл двухстадийной хроматографической очистки (11-14 мг), и стоимости задействованного хроматографического и вспомогательного оборудования вызывает так же, как и в предыдущем примере, определенные сомнения в рентабельности данного метода. При этом известным недостатком хроматографического метода фракционирования веществ является сложность его масштабирования, так как при увеличении размеров хроматографической колонки нарушается равномерность движения мобильной фазы и, соответственно, ухудшается разделение веществ, а увеличение количества колонок требует соответствующего увеличения дорогостоящего хроматографического оборудования. Причем стоимость самих колонок обычно составляет не более 5-10% от стоимости всей хроматографической установки.

Другим недостатком данного способа является низкая исходная концентрация пектина в растворе - 1%. Результатом этого является низкая скорость гидролиза (так как она при неизменной константе гидролиза пропорциональна концентрации пектина в растворе) и, соответственно, низкая концентрация олигогалактуронидов в готовом гидролизате (расчетная концентрация олигогалактуронидов 1-1,5 мг/мл, гептагалактуронида - 0,031-0,047 мг/мл). Это, в свою очередь, приводит к более высоким удельным затратам на производство единицы массы продукта. В данном случае это, например, затраты, связанные с термостатированием всего объема гидролизата при 85°С и расходом кислоты на гидролиз.

Препятствием для существенного повышения концентрации пектина в растворе является то обстоятельство, что высокомолекулярные пектины уже при концентрации около 1% образуют достаточно вязкие растворы и использование более концентрированных растворов пектинов может создать определенные технологические трудности. Высоковязкие растворы при низких концентрациях образуют практически все коммерческие пектины, так как именно с этой способностью связано одно из главных направлений их использования - в качестве загустителей и структурирующих агентов в пищевой промышленности. Так, например, вязкость 1,5% раствора коммерческого цитрусового пектина (производитель - Herbstreith & Fox KG, Германия) в 25-30 раз превышает вязкость воды.

Еще одним недостатком данного способа является использование для гидролиза пектина дорогостоящего и токсичного реагента - трифторуксусной кислоты.

Задачей, поставленной перед изобретением, является упрощение и удешевление способа получения гептагалактуронида и повышение чистоты целевого продукта.

Поставленная цель достигается тем, что в известном способе получения гептагалактуронида, включающем кислотный гидролиз пектина с последующим отделением жидкой фазы от нерастворившегося остатка пектина и выделением целевого продукта, согласно изобретению в качестве исходного сырья для гидролиза используют низкоэтерифицированный пектин со степенью этерификации не более 30%. Кислотный гидролиз ведут в 0,1-2,0 М растворе минеральной кислоты при температуре 70-100°С до достижения концентрации олигогалактуронидов в жидкой фазе не менее 0,25 мг/мл. Жидкую фазу после отделения от нерастворившегося остатка пектина нейтрализуют до рН не менее 4,0 и при постоянном перемешивании добавляют этанол до концентрации 12-19% об., удаляют выпавший осадок, а к жидкой фазе при постоянном перемешивании добавляют этанол до концентрации 21-28% об., затем выпавший осадок гептагалактуронида отделяют от жидкой фазы и сушат.

Получаемый продукт содержит примерно от 50% до 95% гептагалактуронида и от 5% до 50% соли, состав и количество которой зависят от состава и концентрации кислоты, используемой для гидролиза. Чистота гептагалактуронида как индивидуального олигогалактуронида по данным эксклюзионной ВЭЖХ составляет 94,0-97,3% - то есть содержание примеси других олигогалактуронидов по отношению к гептагалактурониду не превышает 3-6%. Данный показатель чистоты гептагалактуронида уже является достаточным для использования полученного продукта в качестве индивидуального вещества в большинстве прикладных исследовательских работ. При этом присутствие в образце соли в указанных количествах, как правило, не является серьезной помехой в работе.

Для получения обессоленного гептагалактуронида чистотой более 98% осадок гептагалактуронида перед сушкой дополнительно промывают раствором, содержащим 0,1-0,5 М хлорида натрия и 21-28% об. этанола, затем промывают 70-85% об. раствором этанола и сушат.

Использование в качестве исходного сырья для гидролиза низкоэтерифицированного пектина со степенью этерификации не более 30%, имеющего ограниченную набухаемость в кислой среде, позволяет проводить процесс кислотного гидролиза в гетерофазной системе − суспензии: гель низкоэтерифицированного пектина (твердая фаза) - раствор минеральной кислоты (жидкая фаза), что позволяет на практике повысить концентрацию пектина в суспензии до 5-15%. Использование таких высоких, по сравнению с прототипом, концентраций пектина при прочих равных условиях (при одинаковой степени гидролиза пектина) позволяет получать гидролизаты с соответственно большим процентным содержанием конечного продукта - гептагалактуронида, что значительно уменьшает удельные затраты на производство единицы массы продукта и, таким образом, ведет к упрощению и удешевлению процесса. С другой стороны, использование высоких концентраций пектина позволяет достигать желаемой концентрации гептагалактуронида за более короткое время гидролиза. При этом, как установлено авторами в ходе экспериментов, с уменьшением времени гидролиза происходит увеличение выхода целевого продукта - то есть увеличение доли гептагалактуронида в продуктах гидролиза - олигогалактуронидах. Это, возможно, связано с уменьшением гидролиза гептагалактуронида в жидкой фазе при сокращении общего времени гидролиза.

При увеличении степени этерификации более 30% происходит резкое увеличение объема набухшего геля пектина и значительное снижение его механической прочности, что существенно осложняет последующее отделение геля пектина от жидкой фазы, также возможен частичный переход высокомолекулярного пектина в жидкую фазу.

Для осуществления заявленного способа может быть использован практически любой коммерческий пектин. Для этого предварительно проводят снижение его степени этерификации до необходимой величины в пределах 0-30%, используя любой из известных методов деэтерификации: щелочной, кислотный или ферментативный. Наиболее удобным и экономичным, по мнению авторов, может считаться метод щелочной деэтерификации пектина в среде органического растворителя, например этанола или изопропанола. Данный метод приводится ниже, в описании осуществления заявляемого способа.

Указанные ограничения температуры и концентрации кислоты связаны, в первую очередь, с экономическими и технологическими причинами. Так, при температуре среды ниже 70°С и концентрации кислоты ниже 0,1 моль/л происходит существенное снижение скорости гидролиза пектина и значительное увеличение времени процесса, это ведет к повышению затрат на производство целевого продукта. При температуре более 100°С резко ускоряются процессы термического разложения олигогалактуронидов - разрывы пиранозного цикла, окисление, декарбоксилирование, образование фурфурола и его производных. Это сопровождается снижением выхода олигогалактуронидов и загрязнением гидролизата продуктами их разложения. Увеличение концентрации кислоты более 2,0 моль/л не дает значительного увеличения скорости гидролиза, но приводит к существенному перерасходу кислоты и дополнительным затратам на ее последующую нейтрализацию и освобождение продукта от образовавшихся солей, что, в конечном результате, ведет к усложнению процесса получения целевого продукта. Кроме того, при концентрации кислоты более 2,0 моль/л может происходить снижение растворимости гептагалактуронида и уменьшение его содержания в жидкой фазе.

Нижнее ограничение концентрации олигогалактуронидов в жидкой фазе величиной 0,25 мг/мл связано с тем, что при более низких концентрациях олигогалактуронидов не удается осуществить в дальнейшем выделение (осаждение) из жидкой фазы индивидуального гептагалактуронида с помощью этанола.

Для определения содержания олигогалактуронидов в жидкой фазе может быть использован любой из известных методов, например фотометрический (Blumenkrantz N., Asboe-Hanseng. New method for quantitative determination of uronic acids // Anal. Biochem. 1973. Vol. 54. P. 484-489).

В процессе первого спиртового осаждения при концентрации этанола 12-19% об. образуется осадок высших олигогалактуронидов (октагалактуронида), затем в процессе второго спиртового осаждения при концентрации этанола 21-28% об. образуется осадок целевого продукта - гептагалактуронида. Нейтрализация жидкой среды до рН не менее 4,0 перед добавлением этанола обеспечивает необходимые условия для нормального формирования обоих указанных осадков олигогалактуронидов. При рН ниже 4,0 осадок высших олигогалактуронидов и осадок гептагалактуронида не образуются совсем или происходит их частичное образование в виде не осаждающейся коллоидной взвеси.

Верхняя и нижняя границы концентрации этанола при первом и втором осаждении олигогалактуронидов также обеспечивают необходимые условия формирования осадка. Так, если при проведении первого осаждения концентрация этанола составляет менее 12% об., осадок высших олигогалактуронидов не образуется совсем или происходит его частичное образование в виде не осаждающейся коллоидной взвеси. При концентрации этанола более 19% об. может начаться осаждение гептагалактуронида, то есть произойдет потеря целевого продукта. Точно так же, если при проведении второго осаждения концентрация этанола составляет менее 21% об., осадок гептагалактуронида не образуется совсем или происходит его частичное образование в виде не осаждающейся коллоидной взвеси. При концентрации этанола более 28% об. может начаться осаждение других (низших) олигогалактуронидов и, соответственно, загрязнение осадка гептагалактуронида.

Аналогичные причины обуславливают верхнюю и нижнюю границы концентрации этанола в растворе для промывки (очистки) осадка гептагалактуронида. При концентрации этанола менее 21% может начаться растворение осадка гептагалактуронида, то есть произойдет потеря целевого продукта. При концентрации этанола более 28% происходит не полное удаление низших олигогалактуронидов из-за снижения их растворимости и, таким образом, не достигается необходимая степень очистки гептагалактуронида.

Присутствие определенного количества хлорида натрия в вышеуказанном промывочном растворе так же, как присутствие в нем этанола, является необходимым условием для предотвращения растворения осадка гептагалактуронида и сохранения, таким образом, целевого продукта. При концентрации хлорида натрия в промывочном растворе менее 0,1 М может начаться растворение осадка гептагалактуронида вне зависимости от наличия в растворе этанола. При повышении концентрации хлорида натрия от 0,1 М до 0,5 М происходит определенное повышение плотности осадка гептагалактуронида, что облегчает его отделение от жидкой фазы (например, за счет сокращения времени на центрифугирование). При дальнейшем повышении концентрации хлористого натрия - выше 0,5 М, - плотность осадка гептагалактуронида и условия его отделения от жидкой фазы не меняются, но возрастают затраты на последующую отмывку осадка гептагалактуронида от хлористого натрия.

Для отмывки осадка гептгалактуронида от остатка хлорида натрия используют 70-85% об. раствор этанола, так как он хорошо растворяет данную соль, а осадок гептагалактуронида остается в нем нерастворимым даже при полном отсутствии хлорида натрия. При использовании раствора этанола концентрацией ниже 70% об. по мере удаления хлорида натрия из осадка гептагалактуронида может происходить частичное или полное растворение осадка. При увеличении концентрации этанола более 85% об. существенно ухудшается растворимость в нем хлорида натрия и для полного удаления соли из осадка требуется проведение нескольких промывок, что приводит к удлинению и удорожанию процесса.

При осаждении гептагалактуронида процесс добавления этанола к жидкой фазе ведут при постоянном перемешивании, для того чтобы избежать локального превышения концентрации этанола, при котором может произойти осаждение низших олигогалактуронидов и, соответственно, загрязнение ими осадка гептагалактуронида.

В качестве минеральной кислоты могут быть использованы, в частности, соляная, серная, азотная кислоты.

Способ осуществляется следующим образом.

Пример 1

30,0 г пектовой кислоты (Serva, № 31680) с содержанием галактуроновой кислоты 82,2% и степенью этерификации менее 1% смешивают с 200 мл раствора соляной кислоты концентрацией 0,1 моль/л. Полученную 15% суспензию нагревают до 100°С на кипящей водяной бане и выдерживают при этой температуре и постоянном перемешивании в течение 2,5 часов. Затем суспензию охлаждают и фильтруют, для фильтрации суспензии используют полипропиленовую фильтрткань PL-30 (LOSMA, Италия) или бумажный фильтр марки Sartorius 390 (артикул №3.103.150). Остаток пектина на фильтре промывают 150 мл соляной кислоты концентрацией 0,1 моль/л для более полного отделения олигогалактуронидов. Объем полученного фильтрата составляет 230 мл, содержание олигогалактуронидов - 15,45 мг/мл.

Фильтрат нейтрализуют до рН 6,0 5,0 М раствором гидроокиси натрия. Объем фильтрата после нейтрализации составляет 234 мл. К фильтрату при постоянном перемешивании добавляют 47,0 мл 96% об. этанола. Конечная концентрация этанола в смеси составляет 16% об. Выпавший осадок отделяют центрифугированием при относительном центробежном ускорении (ОЦУ) - 1500-2000g в течение 15-20 минут, а к оставшейся жидкой фазе при постоянном перемешивании добавляют 34,5 мл 96% об. этанола. Конечная концентрация этанола в смеси составляет 25% об. Выпавший осадок гептагалактуронида отделяют центрифугированием при ОЦУ - 1500-2000g в течение 15-20 минут и сушат при 80-100°С. Выход сухого продукта составляет 276 мг. Содержание в продукте гептагалактуронида, установленное спектрофотометрическим методом, составляет 95,5%, что соответствует выходу гептагалактуронида 7,4% от общего содержания олигогалактуронидов в гидролизате.

Хроматографическая чистота полученного гептагалактуронида составляет 97,3%. Оценку хроматографической чистоты продукта проводили методом эксклюзионной ВЖЭХ на колонке Shim Pack SCR-101P (Shimadzu) с использованием в качестве стандарта сравнения образца гептагалактуронида, чистота которого была подтверждена методами масс-спектрометрии.

Пример 2

Проводят получение осадка гептагалактуронида, как описано в предыдущем примере. Полученный осадок гептагалактуронида после центрифугирования и удаления жидкой фазы суспендируют в течение 5-10 минут в 250 мл раствора, содержащего 0,1 моль/л хлорида натрия и 28% об. этанола, затем центрифугируют при ОЦУ 2000g в течение 20 минут и удаляют жидкую фазу. Оставшийся осадок суспендируют в течение 5-10 минут в 250 мл 85% об. раствора этанола, затем центрифугируют, как было описано выше. Промытый осадок гептагалактуронида сушат при 80ºС.

Выход сухого продукта составляет 255 мг, содержание гептагалактуронида - не менее 99,5% (более точное определение ограничено возможностями спектрофотометрического метода), что соответствует выходу гептагалактуронида 7,1% от общего содержания олигогалактуронидов в гидролизате. Хроматографическая чистота гептагалактуронида - 98,8%.

Пример 3

Получают низкоэтерифицированный пектин путем контролируемой щелочной деэтерификации высокоэтерифицированного пектина. Для этого в 0,5 л 50% этанола растворяют 20,0 г гидроокиси натрия, затем при перемешивании добавляют 100,0 г высокоэтерифицированного цитрусового пектина (Herbstreith & Fox KG, Германия). Смесь перемешивают 50 мин, затем постепенно небольшими порциями добавляют 40,0 мл концентрированной соляной кислоты, пектин отделяют фильтрованием, промывают 300 мл 50% этанола и сушат при 80°С. Выход низкоэтерифицированного пектина - 93,3 г, содержание галактуроновой кислоты - 76,5%, степень этерификации - 0%.

30,0 г полученного низкоэтерифицированного пектина смешивают с 200 мл раствора соляной кислоты концентрацией 2,0 моль/л. Полученную 15% суспензию нагревают до 90°С на водяной бане и выдерживают при этой температуре и постоянном перемешивании в течение 2,5 часов. Затем суспензию охлаждают и фильтруют, для фильтрации суспензии используют полипропиленовую фильтрткань PL-30 (LOSMA, Италия) или бумажный фильтр марки Sartorius 390. Остаток пектина на фильтре промывают 150 мл соляной кислоты концентрацией 0,1 моль/л для более полного отделения олигогалактуронидов. Объем полученного фильтрата составляет 242 мл, содержание олигогалактуронидов - 17,6 мг/мл.

Фильтрат нейтрализуют: вначале - сухой гидроокисью натрия до рН 1-2, затем - 5,0 М раствором гидроокиси натрия до рН 4,0. Объем фильтрата после нейтрализации составляет 260 мл. К фильтрату при постоянном перемешивании добавляют 37,0 мл 96% об. этанола. Конечная концентрация этанола в смеси составляет 12% об. Выпавший осадок отделяют центрифугированием при ОЦУ - 1500-2000g в течение 15-20 минут, а к оставшейся жидкой фазе при постоянном перемешивании добавляют 36,0 мл 96% об. этанола. Конечная концентрация этанола в смеси составляет 21% об. Выпавший осадок гептагалактуронида отделяют центрифугированием при ОЦУ - 1500-2000g в течение 15-20 минут и сушат при 80-100°С. Выход сухого продукта составляет 812 мг. Содержание в продукте гептагалактуронида составляет 48,8%, что соответствует выходу гептагалактуронида 9,3% от общего содержания олигогалактуронидов в гидролизате. Хроматографическая чистота полученного гептагалактуронида составляет 94,0%.

Пример 4

Проводят получение осадка гептагалактуронида, как описано в предыдущем примере. Полученный осадок гептагалактуронида после центрифугирования и удаления жидкой фазы суспендируют в течение 5-10 минут в 400 мл раствора, содержащего 0,25 моль/л хлорида натрия и 25% об. этанола, затем центрифугируют при ОЦУ 2000g в течение 20 минут и удаляют жидкую фазу. Оставшийся осадок суспендируют в течение 5-10 минут в 400 мл 70% об. раствора этанола, затем центрифугируют как было описано выше. Промытый осадок гептагалактуронида сушат при 80ºС.

Выход сухого продукта составляет 366 мг, содержание гептагалактуронида - не менее 99,5%, что соответствует выходу гептагалактуронида - 8,6% от общего содержания олигогалактуронидов в гидролизате. Хроматографическая чистота гептагалактуронида - 98,3%.

Пример 5

Получают низкоэтерифицированный пектин следующим образом.

В 0,4 л 50% об. изопропанола растворяют 20 г гидроокиси натрия, затем при перемешивании добавляют 100 г высокоэтерифицированного яблочного пектина (Herbstreith & Fox KG, Германия). Смесь перемешивают 10 мин, затем постепенно небольшими порциями добавляют 40 мл концентрированной соляной кислоты, пектин отделяют фильтрованием, промывают 300 мл 50% изопропанола и сушат при 80-100°С. Выход низкоэтерифицированного пектина - 94,5 г, содержание галактуроновой кислоты - 78,4%, степень этерификации - 13,8%.

20,0 г полученного низкоэтерифицированного пектина смешивают с 200 мл раствора азотной кислоты концентрацией 1,0 моль/л. Полученную 10% суспензию нагревают до 70°С на водяной бане и выдерживают при этой температуре и постоянном перемешивании в течение 1 часа. Затем суспензию охлаждают и центрифугируют 30 минут при ОЦУ 3000g. Объем полученного фугата - жидкой фазы - составляет 122 мл, содержание олигогалактуронидов - 3,48 мг/мл.

Жидкую фазу нейтрализуют: вначале - сухой гидроокисью натрия до рН 1-2, затем - 5,0 М раствором гидроокиси натрия до рН 6,0. Объем жидкой фазы после нейтрализации составляет 127 мл. К фильтрату при постоянном перемешивании добавляют 31,5 мл 96% об. этанола. Конечная концентрация этанола в смеси составляет 19% об. Выпавший осадок отделяют центрифугированием при ОЦУ - 1500-2000g в течение 15-20 минут, а к оставшейся жидкой фазе при постоянном перемешивании добавляют 20,5 мл 96% об. этанола. Конечная концентрация этанола в смеси составляет 28% об. Выпавший осадок гептагалактуронида отделяют центрифугированием при ОЦУ - 1500-2000g в течение 15-20 минут. Полученный осадок гептагалактуронида после центрифугирования и удаления жидкой фазы суспендируют в течение 5-10 минут в 100 мл раствора, содержащего 0,5 моль/л хлорида натрия и 21% об. этанола, затем центрифугируют при ОЦУ 2000g в течение 20 минут и удаляют жидкую фазу. Оставшийся осадок дважды промывают путем суспендирования в течение 5-10 минут в 100 мл 70% об. раствора этанола и последующего центрифугирования, как было описано выше. Промытый осадок гептагалактуронида сушат при 80ºС.

Выход сухого продукта составляет 54,0 мг, содержание гептагалактуронида - 99,5%, что соответствует выходу гептагалактуронида 12,7% от общего содержания олигогалактуронидов в гидролизате. Хроматографическая чистота полученного гептагалактуронида составляет 99,5%.

Пример 6

Получают низкоэтерифицированный пектин со степенью этерификации 30% путем контролируемой щелочной деэтерификации высокоэтерифицированного пектина следующим образом.

Берут 50 г высокоэтерифицированного цитрусового пектина (Herbstreith & Fox KG, Германия), суспендируют в 0,5 л 60% об. этанола и постепенно, порциями добавляют 5,0 М раствор гидроокиси натрия, контролируя величину степени этерификации пектина в пробах, взятых после добавления каждой порции гидроокиси натрия. После достижения величины степени этерификации 30% к суспензии добавляют 20 мл концентрированной соляной кислоты (плотность - d=1,19 г/см³), пектин отделяют фильтрованием, промывают 150 мл 50% этанола и сушат при 80°С. Выход низкоэтерифицированного пектина - 47 г, содержание галактуроновой кислоты - 74,8%, степень этерификации - 30,0%.

10,0 г полученного низкоэтерифицированного пектина смешивают с 200 мл раствора соляной кислоты концентрацией 0,5 моль/л. Полученную 5% суспензию нагревают до 80°С на водяной бане и выдерживают при этой температуре и постоянном перемешивании в течение 1,5 часа. Затем суспензию охлаждают и центрифугируют 30 минут при ОЦУ 3000g. Объем полученного фугата - жидкой фазы - составляет 115 мл, содержание олигогалактуронидов - 5,22 мг/мл.

Жидкую фазу нейтрализуют: вначале - сухой гидроокисью натрия до рН 1-2, затем - 5,0 М раствором гидроокиси натрия до рН 7,0. Объем жидкой фазы после нейтрализации составляет 118 мл. К фильтрату при постоянном перемешивании добавляют 29,0 мл 96% об. этанола. Конечная концентрация этанола в смеси составляет 19% об. Выпавший осадок отделяют центрифугированием при ОЦУ - 1500-2000g в течение 15-20 минут, а к оставшейся жидкой фазе при постоянном перемешивании добавляют 19,5 мл 96% об. этанола. Конечная концентрация этанола в смеси составляет 28% об. Выпавший осадок гептагалактуронида отделяют центрифугированием при ОЦУ - 1500-2000g в течение 15-20 минут. Полученный осадок гептагалактуронида после центрифугирования и удаления жидкой фазы суспендируют в течение 5-10 минут в 100 мл раствора, содержащего 0,5 моль/л хлорида натрия и 21% об. этанола, затем центрифугируют при ОЦУ 2000g в течение 20 минут и удаляют жидкую фазу. Оставшийся осадок дважды промывают путем суспендирования в течение 5-10 минут в 100 мл 85% об. раствора этанола и последующего центрифугирования, как было описано выше. Промытый осадок гептагалактуронида сушат при 80ºС.

Выход сухого продукта составляет 65,4 мг, содержание гептагалактуронида - не менее 99,5%, что соответствует выходу гептагалактуронида 10,9% от общего содержания олигогалактуронидов в гидролизате. Хроматографическая чистота гептагалактуронида - 99,5%.

Пример 7

Проводят гидролиз низкоэтерифицированного цитрусового пектина и отделение жидкого гидролизата от остатка пектина, как было описано в предыдущем примере. Полученный жидкий гидролизат - жидкую фазу - после центрифугирования разводят 0,5 М соляной кислотой до конечной концентрации олигогалактуронидов - 0,25 мг/мл и нейтрализуют: вначале - сухой гидроокисью натрия до рН 1-2, затем - 5,0 М раствором гидроокиси натрия до рН 8,0. К 800 мл полученной жидкой фазы при постоянном перемешивании добавляют 198 мл 96% об. этанола. Конечная концентрация этанола в смеси составляет 19% об. Выпавший осадок отделяют центрифугированием при ОЦУ - 1500-2000g в течение 15-20 минут, а к оставшейся жидкой фазе при постоянном перемешивании добавляют 132 мл 96% об. этанола. Конечная концентрация этанола в смеси составляет 28% об. Выпавший осадок гептагалактуронида отделяют центрифугированием при ОЦУ - 1500-2000g в течение 15-20 минут. Полученный осадок гептагалактуронида после центрифугирования и удаления жидкой фазы суспендируют в течение 5-10 минут в 25 мл раствора, содержащего 0,5 моль/л хлорида натрия и 28% об. этанола, затем центрифугируют при ОЦУ 2000g в течение 20 минут и удаляют жидкую фазу. Оставшийся осадок дважды промывают путем суспендирования в течение 5-10 минут в 25 мл 70% об. раствора этанола и последующего центрифугирования, как было описано выше. Промытый осадок гептагалактуронида сушат при 80ºС.

Выход сухого продукта составляет 16,8 мг, содержание гептагалактуронида - не менее 99,5%, что соответствует выходу гептагалактуронида - 8,4% от общего содержания олигогалактуронидов в гидролизате. Хроматографическая чистота гептагалактуронида - 98,5%.

Пример 8

20,0 г пектовой кислоты (Serva, № 31680) с содержанием галактуроновой кислоты 82,2% и степенью этерификации менее 1% смешивают с 200 мл раствора серной кислоты концентрацией 0,5 моль/л. Полученную 10% суспензию нагревают до 90°С на водяной бане и выдерживают при этой температуре и постоянном перемешивании в течение 2,0 часов. Затем суспензию охлаждают и фильтруют, для фильтрации суспензии используют полипропиленовую фильтрткань PL-30 (LOSMA, Италия) или бумажный фильтр марки Sartorius 390. Остаток пектина на фильтре промывают 100 мл серной кислоты концентрацией 0,5 моль/л для более полного отделения олигогалактуронидов. К остатку пектина добавляют раствор серной кислоты концентрацией 0,5 моль/л - до восстановления первоначального объема суспензии. Остаток пектина ресуспендируют в жидкой фазе и проводят следующий цикл гидролиза в прежних условиях - 2 часа при 90°С. Всего проводят 5 циклов гидролиза, каждый раз отделяя и промывая остаток пектина, как было описано выше. Общий объем полученного фильтрата составляет 1190 мл, содержание олигогалактуронидов - 12,4 мг/мл.

Фильтрат нейтрализуют: вначале - сухой гидроокисью натрия до рН 1-2, затем - 5,0 М раствором гидроокиси натрия до рН 8,0. Объем фильтрата после нейтрализации составляет 1235 мл. К фильтрату при постоянном перемешивании добавляют 210 мл 96% об. этанола. Конечная концентрация этанола в смеси составляет 14% об. Выпавший осадок отделяют центрифугированием при ОЦУ - 1500-2000g в течение 15-20 минут, а к оставшейся жидкой фазе при постоянном перемешивании добавляют 225 мл 96% об. этанола. Конечная концентрация этанола в смеси составляет 25% об. Выпавший осадок гептагалактуронида отделяют центрифугированием при ОЦУ - 1500-2000g в течение 15-20 минут. Полученный осадок гептагалактуронида после центрифугирования и удаления жидкой фазы суспендируют в течение 5-10 минут в 1500 мл раствора, содержащего 0,25 моль/л хлорида натрия и 25% об. этанола, затем центрифугируют при ОЦУ 2000g в течение 20 минут и удаляют жидкую фазу. Оставшийся осадок суспендируют в течение 5-10 минут в 1500 мл 70% об. раствора этанола, затем центрифугируют, как было описано выше. Промытый осадок гептагалактуронида сушат при 80ºС.

Выход сухого продукта составляет 1447 мг, содержание гептагалактуронида - не менее 99,5%, что соответствует выходу гептагалактуронида 9,8% от общего содержания олигогалактуронидов в гидролизате. Хроматографическая чистота гептагалактуронида - 99,0%.

Как видно из приведенных примеров, использование в заявляемом способе низкоэтерифицированного пектина в качестве исходного сырья для гидролиза позволяет повысить скорость процесса и, соответственно, концентрацию олигогалактуронидов в гидролизате в 2,32-11,7 раз, а концентрацию целевого продукта - гептагалактуронида в гидролизате - в 9,4-34,8 раза по сравнению с прототипом и благодаря этому добиться соответствующего снижения удельных производственных затрат и времени на выпуск продукта. При этом в заявляемом способе выход гептагалактуронида (в процентах от общего содержания олигогалактуронидов в гидролизате) повышен в 2,0-3,6 раз по сравнению с прототипом.

Кроме того, в заявляемом способе, в отличие от известного способа, перед выделением гептагалактуронида не требуется проведение сложной и длительной обработки жидкого гидролизата пектина - вся предварительная обработка сводится к нейтрализации гидролизата до рН не ниже 4,0.

Одним из главных преимуществ заявляемого способа, по сравнению с известным способом, является то, что он позволяет заменить сложный и трудоемкий метод хроматографического выделения гептагалактуронида на простой и дешевый метод спиртового осаждения. При этом для выделения гептагалактуронида по заявляемому способу вместо дорогостоящего хроматографического и вспомогательного оборудования требуется только мешалка и центрифуга.

Более того, процесс получения гептагалактуронида по заявляемому способу, в отличие от прототипа, легко поддается масштабированию, так как в нем для выделения гептагалактуронида используются две простые технологические операции - осаждение этанолом и центрифугирование, которые в отличие от методов колоночной хроматографии не имеют принципиальных ограничений для масштабирования.

Способ получения гептагалактуронида включает кислотный гидролиз пектина с последующим отделением жидкой фазы от нерастворимого остатка пектина и выделением из нее гептагалактуронида. Причем в качестве пектина используют низкоэтерифицированный пектин со степенью этерификации не более 30%. Кислотный гидролиз ведут в 0,1-2,0 моль/л растворе минеральной кислоты при температуре 70-100°C до достижения концентрации олигогалактуронидов в жидкой фазе не менее 0,25 мг/мл. Для выделения гептагалактуронида из жидкой фазы ее нейтрализуют до pH не ниже 4,0. Затем при постоянном перемешивании добавляют этанол до концентрации 12-19% об., удаляют выпавший осадок, а к жидкой фазе при постоянном перемешивании добавляют этанол до концентрации 21-28% об. После чего осадок гептагалактуронида отделяют от жидкой фазы и сушат. Для получения продукта более высокой чистоты перед сушкой осадок гептагалактуронида промывают раствором, содержащим 0,1-0,5 моль/л хлорида натрия и 21-28% об. этанола, а затем промывают 70-85% об. раствором этанола. Изобретение позволяет выделить из пектина гептагалактуронид с высокой степенью чистоты. 1 з.п. ф-лы, 8 пр.

1. Способ получения гептагалактуронида, включающий кислотный гидролиз пектина с последующим отделением жидкой фазы от нерастворимого остатка пектина и выделением из нее гептагалактуронида, отличающийся тем, что в качестве пектина используют низкоэтерифицированный пектин со степенью этерификации не более 30%, кислотный гидролиз ведут в 0,1-2,0 моль/л растворе минеральной кислоты при температуре 70-100°C до достижения концентрации олигогалактуронидов в жидкой фазе не менее 0,25 мг/мл, для выделения гептагалактуронида из жидкой фазы ее нейтрализуют до pH не ниже 4,0, затем при постоянном перемешивании добавляют этанол до концентрации 12-19% об., удаляют выпавший осадок, а к жидкой фазе при постоянном перемешивании добавляют этанол до концентрации 21-28% об., после чего осадок гептагалактуронида отделяют от жидкой фазы и сушат.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что перед сушкой осадок гептагалактуронида промывают раствором, содержащим 0,1-0,5 моль/л хлорида натрия и 21-28% об. этанола, а затем промывают 70-85% об. раствором этанола.