СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ КАЧЕСТВА ЭМБРИОНА ПРИ ПРОВЕДЕНИИ ЭКО У ЖЕНЩИН С БЕСПЛОДИЕМ Российский патент 2012 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится к медицине, а именно к гинекологии, и может быть использовано для прогнозирования качества эмбрионов перед проведением программы экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) у женщин с бесплодием, обусловленным трубно-перитонеальным фактором и наружным генитальным эндометриозом.

Актуальность предлагаемого способа определяется тем, что при лечении бесплодия у женщин с трубно-перитонеальным фактором и с наружным генитальным эндометриозом в последнее время широко используются новые методы вспомогательных репродуктивных технологий, в том числе экстракорпоральное оплодотворение (ЭКО). Несмотря на то, что оплодотворение in vitro и последующий перенос эмбрионов в полость матки становится рутинным методом лечения бесплодия, частота наступления беременности в программе ЭКО остается все еще низкой и по данным разных авторов колеблется в пределах от 20% до 40% (Гришенко В.И., Петрушко М.П., Пиняев В.И. Результативность программы ЭКО в зависимости от количества и качества перенесенных эмбрионов // Проблемы репродукции. - 2000 г. - №1. - С.44-47.). Известно, что успех проведения ЭКО во многом определяется качеством переносимых в полость матки эмбрионов. Многие специалисты считают, что главной причиной неудачных исходов ЭКО является недостаточно точная оценка качества эмбрионов, которая сегодня строится преимущественно на морфологических критериях (Ильина А.А., Калинина И.И., Трошина Т.Г., Ильин К.А., Болтовская М.Н., Степанова И.И., Аншина М.Б. Фолликулярная жидкость как среда, определяющая качество ооцита и исход программ ВРТ (обзор литературы) // Проблемы репродукции. - 2008. - №4. - С.27-38.). Существует мнение, что качество эмбрионов, получаемых при проведении ЭКО, зависит от аспирируемых фолликулов и от состава фолликулярной жидкости (Баркалина Н.В. Фолликулярная жидкость и прогноз исходов программ ВРТ // Проблемы репродукции. - 2006 г. - №6. - С.57-63.). Однако другие факторы, ассоциированные с качеством эмбриона, остаются пока еще мало изученными. В связи с этим, для повышения эффективности ЭКО особый интерес представляет разработка новых лабораторных критериев прогноза качества эмбрионов, использование которых позволило бы лечащему врачу еще до начала протокола овариальной стимуляции оптимизировать тактику ведения больной и своевременно назначить при необходимости комплекс дополнительных лечебных мероприятий.

Ранее было предложено использовать в качестве индикатора качества эмбриона показатель концентрации лактоферрина в фолликулярной жидкости, при этом высокие значения этого показателя (500,2±35,5 нг/мл) служат индикатором высокого качества эмбрионов, а низкие значения концентрации лактоферрина в фолликулярной жидкости (379,7±45,1 нг/мл) ассоциированы с получением эмбрионов низкого качества (Yanaihara A., Mitsukawa К., Iwasaki S., Otsuki K., Kawamura T., Okai T. High concentrations of lactoferrin in the follicular fluid correlate with embryo quality during in vitro fertilization cycles // Fertil. Steril - 2007. - Vol.87. - N.2. - P.279-282).

Однако способ прогнозирования качества эмбриона по этим параметрам имеет ряд следующих недостатков.

1. Способ имеет высокий риск возникновения осложнений, так как забор фолликулярной жидкости возможен только при проведении трансвагинальной пункции фолликулов под общим наркозом и может осложниться кровотечением.

2. Использование способа возможно после окончания протокола овариальной стимуляции и забора фолликулярной жидкости, т.е. на том этапе, когда уже невозможно скоррегировать тактику ведения пациентки.

3. В литературе есть данные о том, что при трубном факторе бесплодия концентрация лактоферрина в фолликулярной жидкости не изменяется в зависимости от успеха или неуспеха ЭКО (Маркина Л.А., Зорина P.M., Зорина В.Н., Баженова Л.Г., Архипова С.В., Рябичева Т.Г., Полукаров А.Н. Профилактика репродуктивных потерь и плацентарной недостаточности. Белки, цитокины и антигенспецифические иммунокомплексы фолликулярной жидкости и сыворотки крови у женщин при экстракорпоральном оплодотворении // Вопросы гинекологии, акушерства и перинатологии. - 2008. - Т.7. - №5. - С.29-33.).

4. Отсутствуют данные о точности способа.

Известен также способ прогнозирования качества эмбрионов, отличающийся тем, что в фолликулярной жидкости определяют содержание ингибина Б и при его низких значениях (10,9-103,9 нг/мл) прогнозируют получение эмбрионов низкого качества. (Chang C.L., Wang Т.Н., Horng S.G., Wu Н.М., Wang H.S., Soong Y.K. The concentration of inhibin В in follicular fluid: relation to oocyte maturation and embryo development // Hum.Reprod. - 2002. - Vol.17. - N.7. - P.1724-1728.)

Однако этот способ имеет ряд недостатков.

1. Способ имеет высокий риск возникновения осложнений, так как забор фолликулярной жидкости возможен только при проведении трансвагинальной пункции фолликулов под общим наркозом и может осложниться кровотечением.

2. Известно, что продукция ингибина Б у женщин в течение жизни меняется, начиная уменьшаться после 40 лет, что связано с возрастным снижением овариального резерва (Gougeon A. The biological aspects of risks of infertility due to age: the female side // Rev Epidemiol. Sante. Publique. - 2005. - Vol.53. - No 2. - P.2S37-45.). ЭКО проводят у женщин достаточно широкого возрастного диапазона, поэтому изменение содержания ингибина Б в фолликулярной жидкости будет в значительной степени определяться возрастом пациентки.

3. Отсутствуют данные о точности способа.

Наиболее близким по техническому решению к заявляемому способу является способ прогнозирования качества эмбриона по определению в периферической крови уровня лептина у женщин, которым проводилась овариальная стимуляция по длинному протоколу, и при низких значениях сывороточного содержания лептина (50,05 ± 5,6 нг/мл) прогнозируют получение эмбрионов высокого качества, тогда как при более высоких показателях лептина в сыворотке крови (59,48 ± 7,6 нг/мл, P=0,047) прогнозируют получение эмбрионов низкого качества (Georgios A., Eleni K., Ioannis S., Vassilios L., Constantinos L., ThemisM., Nikolaos V. Serum and follicular fluid leptin levels are correlated with human embryo quality // Reproduction. - 2005. - Vol.130 - P.917-921.

Данный способ был выбран нами в качестве прототипа. Однако он имеет ряд недостатков.

1. Данный способ прогнозирования применим только для женщин, которые проходили стимуляцию суперовуляции по длинному протоколу.

2. В литературе имеются противоречивые данные о возможности использования данного показателя для прогнозирования качества эмбриона. Ряд исследователей указывает на отсутствие связи между сывороточным уровнем лептина и качеством эмбриона в IVF-ICSI циклах (Asimakopoulos B., Koster F., Felberbaum R., Tripsiannis G., Caglar G.S., Nikolettos N., Al-Hasani S., Diedrich K. Intrafollicular and circulating concentrations of leptin do not predict the outcome in IVF-ICSI cycles // Reprod Sci. - 2009. - Vol.l6. - N.1. - P.113-119.)

3. Известно, что лептин вырабатывается адипоцитами и его содержание коррелирует с показателями индекса массы тела, поэтому индивидуальный разброс этого показателя в зависимости от массы тела женщин может повлиять на точность прогноза в случае его использования для прогнозирования качества эмбриона (Alviggi C., Clarizia R., Castaldo G., Matarese G., Colucci C.C., Conforti S., Pagano T., Revelli A., De Placido G. Leptin concentrations in the peritoneal fluid of women with ovarian endometriosis are different according to the presence of a 'deep' or 'superficial' ovarian disease // Gynecol Endocrinol. - 2009. - Vol.25. - N.9. - P.610-615.).

4. Отсутствуют данные о точности, чувствительности и специфичности способа.

Указанные недостатки предлагается устранить в заявляемом способе.

Техническим результатом является повышение точности, чувствительности и специфичности способа прогнозирования качества эмбриона у женщин, готовящихся к программе ЭКО.

Новизна заявляемого способа заключается в том, что впервые предлагается прогнозировать качество эмбрионов, получаемых при проведении ЭКО у женщин с бесплодием, обусловленным трубно-перитонеальным фактором и наружным генитальным эндометриозом, по определению относительного содержания в периферической крови HLA-DR + моноцитов. Ранее этот показатель использовали для прогнозирования развития вторичного септического шока у пациентов с обширными термическими ожогами (> 30% поверхности тела) (Venet F., Tissot S., Debard A.L., Faudot C., Crampé C., Pachot A., Ayala A., Monneret G. Decreased monocyte human leukocyte antigen-DR expression after severe burn injury: Correlation with severity and secondary septic shock // Crit Care Med. 2007 Aug; 35(8):1910-7.) Также было установлено, что прогрессивное снижение циркулирующего пула HLA-DR + моноцитов ассоциируется с развитием инфекционных осложнений у пациентов с инсультом (Zhang D.P., Yan F.L., Xu H.Q., Zhu Y.X., Yin Y., Lu H.Q. A decrease of human leucocyte antigen-DR expression on monocytes in peripheral blood predicts stroke-associated infection in critically-ill patients with acute stroke // Eur. J. Neurol. - 2009. - Vol.l6. - N.4. - P.498-505). Низкую экспрессию HLA-DR молекул на персистирующих моноцитах крови было также предложено использовать в качестве прогноза риска развития пневмонии у детей, перенесших трансплантацию легких (Hoffman J.A., Weinberg K.I., Azen C.G., Horn M.V., Dukes L., Starnes V.A., Woo M.S. Human leukocyte antigen-DR expression on peripheral blood monocytes and the risk of pneumonia in pediatric lung transplant recipients // Transpl Infect Dis. 2004 Dec; 6(4):147-55.). Для прогнозирования качества эмбрионов, получаемых при проведении ЭКО у женщин с бесплодием, обусловленным трубно-перитонеальным фактором и наружным генитальным эндометриозом, этот показатель не использовался.

Известно, что HLA-DR молекулы, относящиеся к антигенам главного комплекса гистосовместимости II класса, непосредственно участвуют в процессе презентации антигенов фагоцитарными клетками (Ярилин А.А. Основы иммунологии: Учебник. - М.: Медицина, 1999. - 608 с.). Низкий уровень экспрессии HLA-DR молекул может вести к угнетению взаимодействия фагоцитов с антигенами и нарушению развития адекватного иммунного ответа на антигенные стимулы различной природы. Снижение в периферической крови женщин с бесплодием циркулирующего пула функционально активных моноцитов свидетельствует о значительном нарушении реакций врожденного иммунитета у данных пациенток, что может негативно влиять на регуляцию различных репродуктивных процессов, в том числе и на оогенез. Показано, что HLA-DR - позитивные макрофаги присутствуют в яичниках и активно участвуют в регуляции роста фолликулов и в процессе овуляции (Wu R., Van der Hoek K.H., Ryan N.K., Norman R.J., Robker R.L. Macrophages contributions to ovarian function // Hu. Reprod. Update. - 2004. - Vol.10. - N.2. - P.119-133).

Способ осуществляется по стандартной методике следующим образом.

1) К 3 мл гепаринизированной крови из кубитальной вены добавляют 3 мл Среды 199 и выделяют обогащенную популяцию мононуклеарных клеток стандартным методом центрифугирования при 1500 об/мин в градиенте плотности фиколл-урографина (d=1,078) в течение 45 мин (Boum A. Isolation of mononuclear cells and granulocytes from human blood and bone marrow // Scand. J. Clin. Invest. - 1968. - V.21. - N97. - P.77.

2) Суспензию мононуклеарных клеток дважды отмывают физраствором, доводят концентрацию клеток до 1×10⁶ кл/мл. K 0,1 мл полученной суспензии одновременно добавляют 20 мкл моноклональных антител анти-HLA-DR, конъюгированных с флюоресцеинизотионатом (ООО «Сорбент», Москва). Клетки инкубируют в течение 30 мин при комнатной температуре в темноте, отмывают в 1 мл физраствора.

3) Определяют относительное (процентное) количество HLA-DR+клеток в моноцитарном гейте на проточном цитометре.

Использование предлагаемого способа позволяет с высокой точностью, 80,0% прогнозировать качество эмбриона при проведении ЭКО.

Отличительными признаками способа являются: установлен прогностический параметр относительного содержания HLA-DR + моноцитов, при значении которого 68% или более прогнозируют получение эмбриона высокого качества.

Сущность заявляемого способа поясняется следующими примерами.

Пример 1. Больная Ч., 29 лет, поступила для проведения программы ЭКО и переноса эмбриона (ПЭ). Наблюдалась и лечилась по поводу вторичного бесплодия в течение 4 лет. Причина бесплодия - трубно-перитонеальный фактор, в браке II, у мужа есть ребенок. В анамнезе 2 эктопические беременности, своевременные роды в 2000 г., без осложнений. Оперативные вмешательства: в 1998 г. внематочная беременность - лапаротомия - туботомия слева; в 2007 г. диагностическая лапароскопия - пластика маточных труб, сальпингоовариолизис; в 2008 г. внематочная беременность - лапароскопия-тубэктомия слева.

При обследовании гормонального статуса: ФСГ - 4,0 мЕд/мл; ЛГ - 6,4 мЕд/мл; ПРЛ - 386,2 мЕд/мл; кортизол - 494,1 нмоль/л; Ингибин Б - 68,44 пг/мл; АМГ - 4,420 нг/мл.

По данным УЗС на 3 день менструального цикла (м.ц.): тело матки однородной структуры, размерами 51×35×40 мм. М-эхо 4 мм. Правый яичник 34×23×25 мм, с антральными фолликулами до 6 в п/зр, max d - 9 мм. Объем яичника 9,8 см³. Левый яичник 35×25×2 мм, с антральными фолликулами до 6 в п/зр, max d - 7 мм. Объем яичника 10,5 см³. Оба яичника обычной структуры.

Заключение гистеросальпингографии (ГСГ): левая маточная труба отсутствует, правая маточная труба непроходима в ампулярном отделе.

Анализ крови: Нb - 138 г/л, эритроциты 4,0 т/л, цветной показатель 0,9, лейкоциты - 5,9 г/л, палочкоядерные нейтрофилы - 0, сегмен-тоядерные нейтрофилы - 64, моноциты - 2, лимфоциты - 34, СОЭ - 3 мм/ч.

Заключение спермограммы мужа: астенозооспермия.

Клинический диагноз: Бесплодие II. Трубно-перитонеальный фактор. Состояние после тубэктомии слева. Дистальная окклюзия правой маточной трубы. Спаечный процесс малого таза.

По данным иммунологического обследования по заявляемому способу установлено, что содержание в периферической крови HLA-DR + моноцитов составило 85%, что выше заявляемого параметра (68%).

Заключение: прогнозируется высокое качество эмбриона.

Стимуляция суперовуляции проведена по короткому протоколу (цетротид + гонал-f). Произведена операция (на 13 день м.ц) - трансвагинальная пункция. Пунктировано 14 фолликулов, получено 14 ооцитов, из них оплодотворилось 9 - получено 9 эмбрионов высокого качества на основании морфологических признаков, перенос эмбриона (ПЭ) на 3 день (2 эмбриона на 8 бластомерах) и 5 день (1 эмбрион на стадии бластоцисты) культивирования.

Таким образом, прогноз получения высокого качества эмбриона подтвердился.

Пример 2. Больная К., 37 лет. Поступила для проведения программы ЭКО и ПЭ. Наблюдалась и лечилась по поводу вторичного бесплодия в течение 13 лет. Причина бесплодия - трубно-перитонеальный фактор, наружный эндометриоз, в браке 1, у мужа детей нет. В анамнезе 1 погибшая беременность (после ЭКО), родов не было. Оперативные вмешательства: в 2000 г. диагностическая лапароскопия - сальпингоовариолизис. В 2003 г. лапароскопия по поводу наружного эндометриоза -деструкция очагов эндометриоза, сальпингоовариолизис.

При обследовании гормонального статуса: ФСГ - 6,29 мЕд/мл; ЛГ - 1,99 мЕд/мл; ПРЛ - 671,8 мЕд/мл; кортизол - 261 нмоль/л; Ингибин Б - 36,96 пг/мл; АМГ - 0,534 нг/мл.

По данным УЗС (на 3 день м.ц): тело матки однородной структуры, размерами 61×36×52 мм. М-эхо 3 мм. Правый яичник 23×33×20 мм, с антральным фолликулом до 1 в п/зр, max d - 11 мм. Объем яичника 7,6 см. Левый яичник 24×13×16 мм, с антральным фолликулом до 1 в п/зр, max d - 8 мм. Объем яичника 2,5 см³. Оба яичника обычной структуры.

Заключение ГСГ: маточные трубы непроходимы.

Анализ крови: Нb - 140 г/л, эритроциты 4,4 т/л, цветной показатель 0,9, лейкоциты - 5,9 г/л, палочкоядерные нейтрофилы - 0, сегментоядерные нейтрофилы - 57, моноциты - 6, лимфоциты - 35, СОЭ - 5 мм/ч.

Заключение спермограммы мужа: астенозооспермия.

Клинический диагноз: Бесплодие II. Трубно-перитонеальный фактор. Дистальная окклюзия обеих маточных труб. Наружный эндометриоз.

По данным иммунологического обследования по заявляемому способу установлено, что содержание в периферической крови HLA-DR+моноцитов составило 68,4%, что выше заявляемого параметра (68%).

Заключение: прогнозируется высокое качество эмбриона. Стимуляция суперовуляции проведена по короткому протоколу (цетротид + гонал-f). Произведена операция (на 12 день м.ц) - трансвагинальная пункция. Пунктировано 2 фолликула, получен 1 ооцит, который оплодотворился - получен 1 эмбрион высокого качества на основании морфологических признаков, ПЭ на 3 день культивирования (1 эмбрион на стадии морулы).

Таким образом, прогноз получения эмбриона высокого качества подтвердился.

Пример 3. Больная М., 37 лет. Поступила для проведения программы ЭКО и ПЭ. Наблюдалась и лечилась по поводу первичного бесплодия в течение 16 лет. Причина бесплодия - наружный эндометриоз, в браке I, у мужа есть ребенок. Оперативные вмешательства: в 2006 г. диагностическая лапароскопия - произведено: диатермопунктура яичников; в 2008 г. лапароскопия по поводу хронического сальпингита, наружного эндометриоза, миомы матки - произведено: фимбриолизис, консервативная миомэктомия, деструкция очагов эндометриоза.

При обследовании гормонального статуса: ФСГ - 3,7 мЕд/мл; ЛГ - 15,1 мЕд/мл; ПРЛ - 85 мЕд/мл; кортизол - 540 нмоль/л.

По данным УЗС: (на 3 день м.ц): тело матки однородной структуры, размерами 41×32×41,5 мм. М-эхо 3 мм. Правый яичник 25×18×20 мм, с антральными фолликулами до 3 в п/зр, max d - 5 мм. Объем яичника 4,5 см³. Левый яичник 27×17×19 мм, с антральными фолликулами до 5 в п/зр, max d - 5 мм. Объем яичника 4,4 см. Оба яичника обычной структуры.

Анализ крови: Нb - 136 г/л, эритроциты - 4,7 т/л, цветной показатель - 0,9, лейкоциты - 4,2 г/л, палочкоядерные нейтрофилы - 0, сегментоядерные нейтрофилы - 58, моноциты - 7,5, лимфоциты - 34,5, СОЭ - 3 мм/ч.

Заключение спермограммы мужа: астенозооспермия.

Клинический диагноз: Бесплодие I. Наружный эндометриоз. Хронический сальпингит. Состояние после консервативной миомэктомии.

По данным иммунологического обследования по заявляемому способу установлено, что содержание в периферической крови HLA-DR + моноцитов составило 32,7%, что ниже заявляемого параметра (68%).

Заключение: прогнозируется низкое качество эмбриона. Стимуляция суперовуляции проведена по длинному протоколу (диферелин + гонал-f + менопур). Произведена операция (на 16 день м.ц) - трансвагинальная пункция. Пунктировано 3 фолликула, получено 3 ооцита, из них оплодотворился 1 - получен 1 эмбрион низкого качества на основании морфологических признаков, ПЭ на 3 день культивирования (1 эмбрион на 6 бластомерах).

Таким образом, прогноз получения низкого качества эмбриона подтвердился.

Указанным способом обследовано 35 женщин с бесплодием, обусловленным трубно-перитонеальным бесплодием и наружным генитальным эндометриозом. Данные исследований приведены в таблице 1.

Таблица 1 Показатель Количество обследованных Всего женщин 35 истинно-положительный результат 10 ложно-положительный результат 3 истинно-отрицательный результат 18 ложно-отрицательный результат 4 Итого: точность заявляемого способа 80,0%, чувствительность заявляемого способа 71,4%, специфичность заявляемого способа 85,7%

Преимущества заявляемого способа:

1) способ применим для прогнозирования качества эмбриона при использовании различных протоколов овариальной стимуляции у женщин с бесплодием, обусловленным трубно-перитонеальным бесплодием и наружным генитальным эндометриозом;

2) высокая точность - 80,0%, чувствительность - 71,4%, специфичность - 85,7%;

3) простота и доступность выполнения методики;

4) применение способа позволит до начала проведения процедуры ЭКО прогнозировать качество эмбриона и своевременно назначить при необходимости проведение дополнительных лечебных мероприятий.

Изобретение относится к медицине, а именно к гинекологии, и может быть использовано для прогнозирования качества эмбрионов перед проведением программы экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) у женщин с бесплодием, обусловленным трубно-перитонеальным фактором и наружным генитальным эндометриозом. Сущность изобретения состоит в том, что в периферической венозной крови женщины с бесплодием определяют показатель относительного содержания HLA-DR+ моноцитов и при его значениях, равных или больших 68%, прогнозируют получение эмбриона высокого качества, а при значении менее 68% - получение эмбриона низкого качества. Проведение обследования женщин с трубно-перитонеальным фактором бесплодия и наружным генитальным эндометриозом по заявленному способу позволит до начала проведения процедуры ЭКО прогнозировать качество эмбриона и своевременно назначить при необходимости проведение дополнительных лечебных мероприятий. 1 табл.

Способ прогнозирования качества эмбриона перед проведением программы экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) у женщин с бесплодием, обусловленным трубно-перитонеальным фактором и наружным генитальным эндометриозом, путем иммунологического исследования периферической венозной крови, отличающийся тем, что определяют относительное содержание HLA-DR + моноцитов и при его значении, равном 68% или более, прогнозируют получение эмбриона высокого качества.