СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ШТАММА Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus C НИЗКОЙ СТЕПЕНЬЮ ПОСТПРОДУЦИРОВАНИЯ МОЛОЧНОЙ КИСЛОТЫ, ПОЛУЧЕННЫЕ ТЕКСТУРИРУЮЩИЕ ШТАММЫ (ВАРИАНТЫ), МОЛОЧНЫЙ ПРОДУКТ И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ТЕКСТУРИРУЮЩИХ ШТАММОВ Российский патент 2012 года по МПК C12N1/20 A23C9/123 C12R1/225 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Настоящее изобретение относится к молочно-кислым бактериям, обладающим низкой или пониженной способностью к постпродуцированию кислоты, и к способу получения таких бактерий. Также настоящее изобретение относится к применению таких бактерий для получения ферментированных молочных продуктов и молочных продуктов, содержащих бактерии.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Штаммы видов Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus являются существенными компонентами бактериальных культур, используемых, в частности, для получения ферментированного молока и йогурта. Как правило, такие штаммы продуцируют молочную кислоту в период хранения молочных продуктов, ферментированных бактериальными культурами, компонентами которых являются эти штаммы. Этот феномен часто называют как «постпродуцирование кислоты». Как правило, такие штаммы не улучшают текстуру молочных продуктов, полученных ферментацией бактериальными культурами, компонентом которых являются эти штаммы.

Согласно законодательству большинства стран ЕС, закваски, используемые для производства йогуртов, должны включать штаммы типа Lactobacillus bulgaricus и штаммы типа Streptococcus thermophilus. Кроме того, сквашивание молока происходит быстрее, когда закваска включает оба типа штаммов по сравнению с использованием одного типа штамма.

Тенденция рынка ферментированного молока демонстрирует востребованность продуктов с пониженным продуцированием кислоты или отсутствием продуцирования кислоты в период хранения (низкое постпродуцирование кислоты) с хорошей текстурирующей способностью (или приданию вязкости). При выборе штаммов типа Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus по отдельности или в качестве компонентов культуры для получения ферментированного молока или йогурта разработчики продукции выбирают из известных штаммов, обладающих следующей комбинацией свойств:

- низкое постпродуцирование кислоты и слабые текстурирующие свойства; или

- высокое постпродуцирование кислоты и слабые текстурирующие свойства;

- высокое постпродуцирование кислоты и высокие текстурирующие свойства; или из штаммов, не являющихся штаммами Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus , но доступных для удовлетворительной комбинации низкого профиля постпродуцирования кислоты с высоким текстурирующим профилем.

При использовании любого из указанных выше известных штаммов, ферментированный молочный продукт будет иметь в результате или высокую степень постпродуцирования кислоты, или слабые текстурирующие свойства, как результат использования бактериальной культуры. Производители молочных продуктов часто выбирают для работы культуры, штаммы которых Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus комбинируют низкое постпродуцирование кислоты и слабые текстурирующие свойства. Для улучшения текстуры ферментированных молочных продуктов вводят загущающий агент(ы) в молочную основу перед ферментацией.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Проблема, возникшая перед специалистом в области техники, к которой относится настоящее изобретение, состоит в обеспечении альтернативных штаммов Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, комбинация которых обладает комбинацией низкого профиля постпродуцирования кислоты и высокого текстурирующего профиля, следовательно, отпадает необходимость добавления загущающих агентов. Некоторые ученые пытались получить такие штаммы, но безуспешно. В Möller et al. (2001) описывается химический мутагенез (мутагеном MNNG (N-метил-N-нитрозо-N-нитрогуанидин)) штамма Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus (штамм Visby 231) с целью получения мутантов с пониженным постпродуцированием кислоты. Мутантный штамм вручную высевали на чашку Петри, и колонии вручную переносили на чашку микротитратора, содержащую молоко. После инкубации в каждой лунке измеряли уровень pH для приблизительно 2000 изолятов, используя микроэлектрод. Затем выделили четыре мутанта с самым высоким конечным pH по сравнению с материнским штаммом. Описанный мутагенез и скрининг не привели к получению мутантов с низким постпродуцированием кислоты, позволяющих получить плотную текстуру.

Авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что можно получить такие штаммы и разработать способ получения таких штаммов, указанный способ отличается от способа, описанного в Möller et al. (2001), в котором авторы настоящего изобретения используют в качестве материнских штаммов штаммы, позволяющие получить хорошую текстуру при использовании слабого мутагена. Осуществляя способ по настоящему изобретению, авторы настоящего изобретения неожиданно выделили штаммы с улучшенными текстурирующими свойствами по отношению к материнским штаммам. Следовательно, авторы настоящего изобретения разработали способ получения штаммов Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, которые по существу вносят вклад в улучшение текстуры молочных продуктов, полученных ферментацией штаммом по настоящему изобретению, или бактериальными культурами, компонентом которых является штамм по настоящему изобретению, по существу без постпродуцирования кислоты в молочных продуктах.

Полученные в результате молочные продукты отличаются приятным мягким, менее кислым вкусом по сравнению с известными продуктами.

ДЕТАЛЬНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В первом аспекте настоящее изобретение относится к штамму Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, который:

a) продуцирует меньше кислоты, когда присутствует в ферментированном молочном продукте (например, во время хранения), по сравнению с другими штаммами того же вида, позволяющими получить хорошую текстуру; и/или

b) улучшает текстуру молочного ферментированного продукта при низком постпродуцировании кислоты по сравнению со штаммами того же вида с более высоким уровнем постпродуцирования кислоты.

Вариантом воплощения настоящего изобретения является штамм, который:

a) имеет pH, измеренный стандартным способом (анализы для определения постпродуцирования кислоты), в пределах 4,25-4,55 (такой, как в пределах 4,30-4,55; или в пределах 4,35-4,55) после 14 дней и/или 21 дня и/или после 28 дней хранения; и

b) имеет текстурирующие свойства, измеренные в Па при использовании анализа определения вязкости, не менее чем 25 (такой, как не менее чем 30; не менее чем 35; не менее чем 39; не менее чем 42; не менее чем 44; не менее чем 45; не менее чем 46; не менее чем 47; не менее чем 48 или не менее чем 50);

или штамм, который

a) снижает pH, измеренный стандартным способом (анализы для определения постпродуцирования кислоты), на менее чем 0,30 единиц pH (такой, как на менее 0,20 единиц pH) после 14 дней хранения; и

b) имеет текстурирующие свойства, измеренные в Па при использовании анализа определения вязкости, не менее чем 25 (такой, как не менее чем 30; не менее чем 35; не менее чем 39; не менее чем 42; не менее чем 44; не менее чем 45; не менее чем 46; не менее чем 47; не менее чем 48 или не менее чем 50);

или штамм, который

a) снижает pH, измеренный стандартным способом (анализы для определения постпродуцирования кислоты), на менее чем 0,20 pH единиц (такой, как на менее 0,15; менее чем 0,11; менее чем 0,08; менее чем 0,07; менее чем 0,06; менее чем 0,05; менее чем 0,04; менее чем 0,03 или даже менее чем 0,02 единиц pH) после 7 дней хранения при температуре 8°С; и

b) имеет текстурирующие свойства, измеренные в Па при использовании анализа определения вязкости, не менее чем 25 (такой, как не менее чем 30; не менее чем 35; не менее чем 39; не менее чем 42; не менее чем 44; не менее чем 45; не менее чем 46; не менее чем 47; не менее чем 48 или не менее чем 50).

Под термином «снижение pH» следует понимать снижение pH относительно начальной точки, то есть pH 4,55. Снижение, например, на 0,30 единиц pH означает, что полученный в результате pH составляет 4,25.

В другом варианте воплощения настоящего изобретения снижение продуцирования кислоты происходит не из-за существенной или полной инактивации бета-галактозидазной активности; и/или не из-за существенной или полной инактивации лактат-дегидрогеназной актитвности. Под термином «не из-за существенной инактивации» следует понимать снижение активности менее чем на 30% (такое, как менее чем на 20% или даже менее чем на10%).

В настоящий момент предпочтительным является штамм Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, который вибирают из группы, состоящей из: CHCC10019; CHCC8535; и CHCC7159; и мутанты любого из них, такие как функциональные эквиваленты мутантов, например мутанты, которые по существу имеют такое же постпродуцирование кислоты и текстурирующие свойства, и наиболее предпочтительным является штамм CHCC7159 или его мутанты, такие как функциональные эквиваленты мутантов, например мутанты, которые по существу имеют такое же постпродуцирование кислоты и текстурирующие свойства.

В контексте настоящего изобретения термин «его мутант» следует понимать как штамм по настоящему изобретению, полученный, например, генной инженерией, обработкой радиационным излучением и/или химической обработкой. Предпочтительно, чтобы мутант представлял собой функциональный эквивалент мутанта, например мутант, который по существу обладает теми же свойствами постпродуцирования кислоты и текстурирующими свойствами, как материнский штамм. Такой мутант является частью настоящего изобретения. В частности, термин «его мутант» относится к штамму, полученному воздействием на штамм по настоящему изобретению Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus (такой как CHCC10019; CHCC8535; CHCC7159; CHCC3984; CHCC3606 или CHCC5713) любой подходящей используемой мутагенной обработки, включая обработку химическим мутагеном, таким как сульфонат этана метана (EMS) или N-метил-N'-нитро-N-нитрогуанидин (NTG), УФ света для спонтанного возникновения мутации. Штамм-мутант предпочтительно должен выполнять, по меньшей мере, одну из a) и b) указанных выше комбинаций. Хотя на настоящий момент предпочтительно получать штамм случайной мутацией или селекцией случайно полученных мутантов, то есть без использования технологии рекомбинантной ДНК, предусмотрена возможность получения мутантов Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus при использовании такой технологии, включая сайт направленный мутагенез и PCR технологии и другие модификации последовательностей ДНК in vitro или in vivo. Под термином «по существу с таким же постпродуцированием кислоты» предпочтительно следует понимать, что показатель pH может варьировать на +/- 0,1 единиц pH (например, на 0,05; 0,01 или 0,00 единиц) относительно материнского штамма, и под термином «по существу с такими же текстурирующими свойствами» предпочтительно следует понимать, что показатель Па может варьировать вплоть до 20% (например, вплоть до 10% или вплоть до 5%) и/или +10/-2 единиц (такой как +5, +3, +/-2, +/-1,0; +/-0,5 или 0,0 единиц) относительно материнского штамма.

Во втором аспекте настоящее изобретение относится к способу получения штамма Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, продуцирующему меньше кислоты в ферментированном молочном продукте (например, во время хранения готового продукта) по сравнению с материнским штаммом, способ включает обработку штамма Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus (материнский штамм) мутагеном (предпочтительно мягким или слабым мутагеном), таким как мутаген, выбранный из группы, состоящей из: сульфонат этил метана (например, 1%); азотистой кислоты (например, 0,05 M); сульфонат метил метана (например, 20 мМ); нитрозогуанидин (например, 25 µМ); и акридин-иприта ICR-170 (например, 5 µг/мл), или радиационным излучением, таким как рентгеновские лучи (например, 2000 рентген в минуту); или УФ лучи (например, 600 эрг/мм² в минуту).

В настоящий момент предпочтительным является мутаген EMS (сульфонат этил метан). В настоящий момент предпочтительным является, чтобы материнский штамм представлял собой штамм Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, который обладает хорошими текстурирующими свойствами при росте в молоке, но также высоким постпродуцированием кислоты, такой штамм выбирают из штаммов, обладающих следующими свойствами:

a) сильное текструрирующее свойство, такое как у штамма, вязкость которого при определении с использованием анализа составляет Па не менее чем 25 (такая, как не менее чем 30; не менее чем 35; не менее чем 39; не менее чем 42; не менее чем 44; не менее чем 45; не менее чем 46; не менее чем 47; не менее чем 48 или не менее чем 50); и

b) сильное свойство постпродуцирования кислоты, такое как у штамма, который снижает pH, измеренный стандартным способом (анализы для определения свойств постпродуцирования кислоты), более чем 0,20 pH единиц (такой, как более 0,30 или 0,40, или даже более чем 0,50) после 7 дней хранения.

Примерами таких штаммов являются CHCC3984, CHCC3606 и CHCC5713, и мутанты любого из них (такие как функциональные эквиваленты мутантов, например мутанты, которые по существу имеют такие же свойства постпродуцирования кислоты и текстурирования). Эти штаммы наряду со штаммами Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, полученные способом по настоящему изобретению, все являются частью настоящего изобретения.

В одном варианте воплощения настоящего изобретения способ по настоящему изобретению дополнительно включает:

- инкубирование отдельных мутантов в среде (такой как в pH индикаторных чашках; в чашках микротитратора, содержащих среду, например, с добавленным pH индикатором; или в пробирках, содержащих среду, например, с добавленным pH индикатором); и

- селекцию мутанта с существенно более высоким конечным pH среды после инкубации по сравнению с материнским штаммом.

Удобно измерять pH при использовании pH электрода, или при использовании pH индикатора, такого как бромфенол пурпурный/бромфенол зеленый, где средой является молоко, например стандартная среда.

В дополнительном аспекте настоящее изобретение относится к использованию штамма Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus по настоящему изобретению для получения ферментированного молочного продукта, такого как йогурт.

Также настоящее изобретение относится к способу получения молочного продукта, включающему смешивание штамма по настоящему изобретению с молоком, также как и к молочному продукту, полученному этим способом. Полученные в результате молочные продукты отличаются приятным мягким и менее кислым вкусом по сравнению с ранее известными продуктами.

В другом варианте воплощения настоящее изобретение относится к способу размножения бактерий Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, включающему смешивание штамма по настоящему изобретению, или композиции, включающей указанный штамм со средой роста, такой как молоко (например, стандартной средой).

В последнем аспекте настоящее изобретение относится к композиции, используемой для ферментирования молока, включающей штамм Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus по настоящему изобретению. Примером такой композиции является закваска, которая содержит штамм по настоящему изобретению наряду с дополнительными штаммами или консервирующими добавками. Композиция может быть высушена, подвергнута лиофилизации, заморожена или находиться в жидкой форме.

ОПРЕДЕЛЕНИЯ

В контексте настоящего изобретения термин «молоко» включает обезжиренное молоко, молоко с низким содержанием жира, полножирное молоко, молоко, свободное от лактозы (полученное гидролизом лактозы ферментом лактаза до глюкозы и галактозы или другим способом), концентрированное молоко или сухое молоко. Обезжиренное молоко представляет собой молоко, из которого удален жир. Молоко с низким содержанием жира представляет собой молоко с содержанием жира от около 1% до около 2%. Полножирное молоко представляет собой молоко с содержанием жира около 2% или более. Используемый здесь термин «молоко» также включает в объем понятия молоко, полученное из животного или растительного источника. Молоко из животного источника включает без ограничения женское, коровье, овечье, козье, буйволиное, верблюжье, ламы, кобылье и оленье. Молоко из растительного источника включает без ограничения молоко, экстрагированное из соевых бобов или овса. Кроме того, термин «молоко» относится не только к цельному молоку, но также и к обезжиренному молоку или любому жидкому компоненту, полученному из него.

Под термином «штамм с высокими текстурирующими свойствами» следует понимать штамм, который при инокуляции в среде при соотношении 1×10⁵ - 1×10⁶ КОЕ/г при температуре инкубации 43°C при pH 4,55 имеет напряжение сдвига ферментированного молока, превосходящее 25 Па, при оценке с использованием прибора через 20 часов после окончания ферментации/коагуляции, как описано в «Анализах по определению вязкости». В противоположность под термином «штамм с низкими текстурирующими свойствами» следует понимать штамм, который при инокуляции в среде при соотношении 1×10⁵ - 1×10⁶ КОЕ/г при температуре инкубации 43°C при pH 4,55 имеет напряжение сдвига ферментированного молока менее 25 Па, при оценке с использованием прибора через 20 часов после окончания ферментации/коагуляции, как описано в способе определения вязкости.

Под термином «штамм с высоким постпродуцированием кислоты» следует понимать штамм, который при выращивании в соответствии с «Анализами по определению постпродуцирования кислоты» снижает pH более чем на 0,20 единиц pH после 7 дней хранения (pH снижен от 4,55 до 4,35 или ниже). В противоположность под термином «штамм с низким постпродуцированием кислоты» следует понимать штамм, который при выращивании в соответствии с «Анализами по определению постпродуцирования кислоты» снижает pH не более чем на 0,20 единиц pH после 7 дней хранения (pH снижен от 4,55 до 4,35 или показатель pH находится в пределах от 4,55 до 4,35, включая обе конечные точки).

Под термином «стандартная среда» следует понимать восстановленное молоко из обезжиренного сухого молока с содержанием сухих веществ 9,5%, прошедшее тепловую обработку при 99°C в течение 15 минут при периодическом способе производства.

Использованная здесь терминология приведена только в качестве описания конкретных вариантов воплощения настоящего изобретения и не ограничивает объем притязаний по настоящему изобретению (если явно не указано иное). Использованные здесь и в приложенной формуле изобретения формы единственного числа включают и множественное число, если в контексте ясно не просматривается иное. Слова «включают», «включает» и «включающий» следует интерпретировать в открытом, а не закрытом значении. Все приведенные здесь показатели в виде интервалов включают каждый отдельный показатель, входящий в этот интервал, если явно не указано иное. Все описанные здесь способы могут быть осуществлены подходящим образом, если здесь не указано иное, или если они явно не противоречат контексту. Все примеры или любой пример или вводные слова, используемые для конкретизации (например, «такой как»), используют только для облегчения понимания настоящего изобретения и они не ограничивают объем его притязаний, изложенный в формуле изобретения.

ОПИСАНИЕ ФИГУР

Фиг.1 представляет собой кривую зависимости рН от времени при температуре 43°С для штамма-мутанта CHCC8535 и материнского штамма CHCC5713. Пример 1.

Фиг.2 представляет собой кривую зависимости рН от времени при температуре 43°С для штамма-мутанта CHCC7159 и материнского штамма CHCC3606. Пример 1.

Фиг.3 представляет собой среднее напряжение сдвига, измеренное на трех независимых образцах, полученных с использованием различных штаммов типа Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgahcus. Интервал значения погрешности составляет в среднем около 2 стандартных отклонений от среднего.

Фиг.4 представляет собой кривую зависимости рН от времени при температуре 43°С штамма-мутанта CHCC10019 и материнского штамма CHCC3984. Пример 2.

Фиг.5 представляет собой среднее напряжение сдвига, измеренное на трех независимых образцах, полученных с использованием штамма-мутанта CHCC10019 и материнского штамма CHCC3984. Интервал значения погрешности составляет в среднем около 2 стандартных отклонений от среднего. Пример 2.

ПРИМЕРЫ

Основные способы

Согласно способу по настоящему изобретению материнский штамм Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus с высокими текстурирующими свойствами и высоким постпродуцированием кислоты обрабатывают химическим мутагеном. Среди полученных в результате штаммов проводят скрининг мутантов с низким постпродуцированием кислоты и мутантов с высокими текстурирующими свойствами. Ниже способ описан подробно.

Анализ определения вязкости (текстурирующих свойств)

Для инокуляции в 200 мл молока, восстановленного из сухого обезжиренного молока (стандартная среда), использовали замороженные концентраты штаммов. Молоко с содержанием сухих веществ 9,5% подвергали обработке при температуре 99°C в течение 15 минут при атмосферном давлении при периодическом способе получения. Замороженные концентраты Lactobacillus bulgaricus, как правило, включают от 1×10⁹ до 1×10¹⁰ КОЕ/г. Показатель инокуляции составляет 1 г концентрата на 10 л молока, следовательно, от 1×10⁵ до 1×10⁶ КОЕ/мл молока. Инкубацию проводят при температуре 43°C до достижения pH 4,55, при котором молоко коагулирует. Затем ферментированное молоко охлаждают до температуры 5°C при периодическом перемешивании (с размещением на ледяной бане в течение 20 минут с последующим помещением в холодильное устройство).

Через 20 часов после достижения pH 4,55 ферментированное молоко нагревают до 13°C и осторожно перемешивают с использованием стержня, снабженного перфорированным диском (диаметр=3 см), до достижения гомогенности образца. Перемешивание состоит из 20 движений стержня вверх и вниз в образце. Реологические свойства образца оценивали при температуре 13°C на реометре (StressTech, Reologica Instruments, Sweden), снабженном коаксиальной измерительной системой с грузом/чашей (CC25).

Тест на вискозиметре проводили с показателями усилия сдвига в пределах от 0,27 до 300 1/с в 21 стадию. Показатели усилия сдвига увеличивали и затем уменьшали, строили кривую напряжения сдвига и записывали явное повышение и понижение вязкости. Время задержки, интеграции и равновесия составило 5 с, 10 с и 5 минут, соответственно. Для дополнительного анализа выбрали напряжение сдвига, равное 300 1/с.

Напряжение сдвига измеряли в Па. Для определения вязкость равна напряжению сдвига, деленному на показатель сдвига. Следовательно, вязкость и напряжение сдвига прямо пропорциональны и выражают те же самые свойства, которые соответствуют показателям напряжения сдвига, определенным при фиксированном показателе сдвига 300 1/с.

Анализ определения постпродуцирования кислоты

Для инокуляции в 200 мл молока, восстановленного из сухого обезжиренного молока (стандартная среда), использовали замороженные концентраты штаммов. Молоко с содержанием сухих веществ 9,5% подвергали обработке при температуре 99°C в течение 15 минут при периодическом способе.

Замороженные концентраты Lactobacillus bulgaricus, как правило, включают от 1×10⁹ до 1×10¹⁰ КОЕ/г. Показатель инокуляции составляет 1 г концентрата на 10 л молока, следовательно, от 1×10⁵ до 3×10⁶ КОЕ/мл молока. Инкубацию проводят при температуре 43°C до достижения pH 4,55, при котором молоко коагулирует. Затем ферментированное молоко охлаждают до температуры 5°C при периодическом перемешивании (при размещении на ледяной бане в течение 20 минут с последующим помещением в холодильное устройство). pH охлажденного ферментированного молока измеряли при использовании pH электрода, соответственно, после 1; 7; 14; 21 и 28 дней хранения.

Способ получения стандартной среды

Растворяют сухое обезжиренное молоко (ArIa Ingredients, Denmark - Milex 240 medium heat milk powder) в воде в течение не более 30 минут. Получают молоко с содержанием сухих веществ 9,5% (вес/вес).

Молоко должно быть стерилизовано при следующем температурном режиме:

  Температура(°C) Время (мин) Нагревание ->99±1 <20 Стерилизация 99±1 15±1 Охлаждение 99±1->40±5 <40

Затем молоко хранят при температуре <7°C. Молоко не должно быть использовано ранее следующего дня.

Размножение бактерий.

Хорошо известны штаммы видов Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, которые улучшают текстуру ферментированного молока и постпродуцируют кислоту. Такие штаммы предпочтительно используют в качестве материнских штаммов. Бактериальные штаммы, продуцирующие молочную кислоту, добавляют в виде жидкого раствора, лиофилизованного порошка или замороженных гранул в молоко для ферментирования. Число бактерий в жидкости, порошке и гранулах может варьировать от 1E⁶ до 1E¹² колоний образующих единиц на грамм (1×10⁶ до 1×10¹² КОЕ/г), используя стандартную технологию подсчета клеток. Жидкость, порошок или гранулы, как правило, добавляют в молоко в количестве от около 0,0005 до около 1%.

Мутагенез.

Бактерии, такие как штамм Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, которые позволяют получить прочную текстуру при росте в молоке, но также обладают высоким постпродуцированием кислоты, подвергают химическому мутагенезу, предпочтительно слабым мутагеном, например EMS (сульфонат этил метан). EMS дает рост случайных замещений пар оснований в генетическом материале (хромосомы и плазмиды) мутированных бактерий. После мутагенеза мутированные культуры высевают на среду в чашки Петри.

Предпочтительный протокол проведения процедуры: материнские штаммы инокулируют из хранившегося при низкой температуре бульона MRS (Difco) в течение 24 часов при температуре 37°C, анаэробно. Для мутагенеза в течение ночи культуры перемешивали в течение 1 минуты с образованием воронки на максимальной скорости для разделения предполагаемых цепей клеток и обрабатывали EMS (10 мл/мл) в течение 2 часов при температуре 37°C. В результате обработки EMS более чем 99% клеток гибли. EMS обработанные культуры замораживали при температуре -80°C в 20% глицерине и хранили для последующего скрининга.

Скрининг

Несколько тысяч колоний случайно выбирают с использованием роботизированного устройства, выбирающего колонии в чашках микротитратора, содержащих 200 мкл молока, например, с добавлением pH индикатора (такого как бромфенол пурпурный/бромфенол зеленый). Каждая лунка в чашке микротитратора соответствует модели ферментации молока. pH молока в лунках, содержащих мутанты, сравнивали с соответствующим штаммом дикого типа (штамм Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, который позволяет получить прочную текстуру во время роста в молоке, но также имеет высокое постпродуцирование кислоты, такие как штаммы Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus CHCC3984, CHCC3606 и CHCC5713). Определяли мутанты с существенно более высоким конечным pH молока после сквашивания при температуре 43°C по сравнению со штаммами дикого типа, например, при использовании колорометрической оценки (используя pH индикатор) или при использовании pH электрода. Сквашивание проводят в большом масштабе (200 мл), записывая pH в системном регистрирующем устройстве со стандартными pH электродами для подтверждения, что мутанты вызывают меньшее постпродуцирование кислоты.

Для контроля того, что полученные мутанты имеют тот же текстурирующий потенциал, как материнские штаммы, образцы молока ферментировали мутантами и материнскими штаммами до того же самого конечного показателя pH, оценивали и сравнивали реологические свойства полученного ферментированного молока с использованием стандартных технологий.

Пример 1: Получение и свойства штаммов LB CHCC7159 и CHCC8535

CHCC7159 и CHCC8535 представляют собой бактерии, продуцирующие молочную кислоту, типа Lactobacillus bulgaricus. Эти штаммы способны сквашивать молоко в условиях промышленного производства и отличаются, тем, что обладают низким постпродуцированием кислоты. Штамм CHCC7159 представляет собой мутант, полученный из CHCC3606, с которым его сравнивали. CHCC8535 представляет собой мутант CHCC5713, с которым его сравнивали. Мутагенез (по предпочтительному протоколу проведения процедуры) и скрининг проводили, как описано выше.

Для инокуляции в 200 мл молока, восстановленного из сухого обезжиренного молока (стандартная среда), использовали замороженные концентраты штаммов CHCC7159, CHCC8535, CHCC3606 и CHCC5713. Молоко с содержанием сухих веществ 9,5% подвергали обработке при температуре 99°C в течение 15 минут при периодическом способе. Замороженные концентраты Lactobacillus bulgaricus, как правило, включают от 1×10⁹ до 3×10¹⁰ КОЕ/г. Показателем инокуляции является 1 г концентрата на 10 л молока, следовательно, от 1×10⁵ до 3×10⁶ КОЕ/мл молока. Инкубацию проводили при температуре 43°C до достижения pH 4,55, при котором молоко коагулирует. Затем ферментированное молоко охлаждали до температуры 5°C.

Кривая зависимости pH от времени показывает, что CHCC8535 достигает pH 4,60 менее чем за 20 часов, получены штаммы, способные сквашивать молоко при условиях инокуляции и инкубации, что является промышленно применимым (фиг.1).

Кривая зависимости pH от времени показывает, что CHCC7159 достигает pH 4,60 в течение около 21 часа, получены штаммы, способные сквашивать молоко при условиях инокуляции и инкубации, что является промышленно применимым (фиг.2).

CHCC7159 и CHCC8535 при ферментации продуцировали меньшее количество кислоты по сравнению с соответствующими материнскими штаммами. CHCC8535 имеет pH 4,17 после 20 часов; что составляет на 0,32 единицы выше по сравнению с материнским штаммом. CHCC7159 имеет pH 4,64 после 20 часов; что составляет на 0,50 единицы pH выше по сравнению с материнским штаммом.

CHCC7159 и CHCC8535 позволяют получить улучшенную структуру ферментированного молока

На следующий день после инкубации ферментированное молоко нагревали до 13°C и осторожно перемешивали при использовании стержня, снабженного перфорированным диском, до достижения гомогенности образца. Реологические свойства образца оценивали на реометре (StressTech, Reologica Instruments, Sweden), снабженном C25 коаксиальной измерительной системой. Тест на вискозиметре проводили с показателями усилия сдвига в пределах от 0,27 до 300 1/с в 21 стадию. Показатели усилия сдвига увеличивали и затем уменьшали, строили кривую напряжения сдвига и записывали явное повышение и понижение вязкости. Время задержки, интеграции и равновесия составило 5 с, 10 с и 5 минут, соответственно. Для дополнительного анализа выбрали напряжение сдвига, равное 300 1/с.

Ферментированное молоко, инкубированное с концентратами CHCC7159 и CHCC8535, имело более выраженную текстуру по сравнению с ферментированным молоком, полученным при использовании соответствующих им материнских штаммов (Фиг.3). Для двух мутантных штаммов средние записанные показатели напряжения сдвига составили от 45 до 55 Па, в то время как для материнских штаммов показатели составили около 40 Па или менее.

Заключение

Штаммы CHCC7159 и CHCC8535 комбинируют следующие свойства:

- позволяют получить прочную текстуру ферментированного молока, превосходящую 40 Па в экспериментальных условиях тестирования,

- способны подкислять молоко до pH 4,60 менее чем за 24 часа,

- достигают pH выше 4,15 после 20 часов в условиях тестирования.

Пример 2: Получение и свойства штамма LB CHCC10019

CHCC10019 представляет собой молочно-кислую бактерию типа Lactobacillus bulgaricus. CHCC10019 способен сквашивать молоко в промышленных условиях и отличается низким постпродуцированием кислоты. Штамм CHCC10019 представляет собой мутант, полученный CHCC3984, с которым его сравнивали. Мутагенез (предпочтительный протокол проведения процедуры) и скрининг проводили, как описано выше. Использованный мутаген представлял собой EMS.

В течение ночи культуры CHCC10019 и CHCC3984 получали инокулированием в 10 мл восстановленного сухого обезжиренного молока. Молоко имело содержание сухих веществ 9,5% и прошло тепловую обработку при температуре 99°C в течение 15 минут при периодическом способе. Биологический материал получали из замороженных ампул с соответствующими штаммами. Инкубацию проводили при 37°C в течение 24 часов.

В течение ночи культуры CHCC10019 и CHCC3984 использовали для инокуляции 200 мл восстановленного сухого обезжиренного молока (стандартная среда). Использованное молоко представляло собой такое же, как описано выше. Количество вносимой закваски составило 1%. Каждый штамм инкубировали в двух бутылях молока. Одну бутыль использовали для получения кривой продуцирования кислоты; вторую бутыль использовали для получения продукта для определения реологических свойств.

В течение ночи число клеток Lactobacillus bulgaricus, как правило, достигает от 1×10⁶ до 1×10⁸ КОЕ/г. Показатель инокуляции в течение ночи составил 1 г культуры на 100 г молока, следовательно, составил от 1×10⁴ до 1×10⁶ КОЕ/мл молоко.

Инкубацию проводили при температуре 43°C в течение 20 минут. Вторую бутыль обрабатывали при тех же самых условиях, инкубировали при температуре 43°C до достижения pH 4,55; при котором молоко коагулирует. Эту бутыль охлаждали до температуры 5°C до проведения анализа на реологические свойства на следующий день.

Кривая зависимости pH от времени показывает, что CHCC10019 достигает pH 4,50 в течение около 7 часов 30 минут, полученный штамм способен сквашивать молоко в условиях инокуляции и инкубации, что является промышленно применимым, см. фиг.4.

CHCC10019 при ферментации продуцировал меньшее количество кислоты по сравнению с соответствующим материнским штаммом. CHCC10019 имеет pH после 20 часов 4,22; который на 0,64 единицы pH выше по сравнению с материнским штаммом.

CHCC10019 позволяет получить улучшенную структуру ферментированного молока.

На следующий день после инкубации ферментированное молоко нагревали до 13°C и осторожно перемешивали при использовании стержня, снабженного перфорированным диском до достижения гомогенности образца. Реологические свойства образца оценивали по Примеру 1. Результаты см. на фиг.5. Ферментированное молоко, инкубированное с CHCC10019, имело более выраженную текстуру по сравнению с CHCC3984. Для мутантного штамма средние записанные показатели напряжения сдвига составили 45 Па, в то время как для материнского штамма показатели составили около 35 Па.

CHCC7159 депонирован 8 февраля 2006 в Немецкой коллекции микроорганизмов и культур клеток GmbH (DSM) и ему был присвоен инвентарный номер DSM 17959. CHCC3606, CHCC5713 и CHCC8535 депонированы 30 марта 2006 в DSM с присвоением им инвентарных номеров DSM 18142, DSM 18143, и DSM 18144, соответственно. CHCC10019 и CHCC3984 депонированы 3 апреля 2007 с присвоением инвентарных номеров DSM 19252 и DSM 19251, соответственно. Депонирование проводилось в соответствии с Будапештским договором о международном признании депонирования микроорганизмов для патентования.

Предпочтительные варианты воплощения настоящего изобретения, описанные здесь, представляют собой наилучшие варианты воплощения настоящего изобретения. Специалисту в области техники, к которой относится настоящее изобретение, следует понимать, что предпочтительные варианты воплощения настоящего изобретения могут иметь подварианты. Настоящее изобретение не ограничивается описанными здесь вариантами и может быть осуществлено на практике иными способами, чем описанные здесь, понятными специалисту из предшествующего уровня техники. Следовательно, настоящее изобретение включает все модификации и эквиваленты объектов по настоящему изобретению, заявленных в приложенной формуле изобретения, в соответствии с законом. Кроме того, все комбинации описанных элементов в любых возможных вариантах входят в объем настоящего изобретения, если они входят в контекст настоящего изобретения и явно не противоречат ему.

ССЫЛКИ

Möller, C., Bockelmann, W., and K. J. Heller, 2001. Isolierung von Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus mutanten zur herstellung eines joghurts mit milder geschmackscharakteristik. Kieler Milchwirtchaftliche forchungsberichte 53, 167-185.

WO 2006/063142

EP518096A1

EP638642A

US5545554A

Guide To Short -Term Tests For Detecting Mutagenic And Carcinogenic Chemicals. Prepared for the IPCS by the International Commission for Protection Against Environmental Mutagens and Carcinogens. WHO, 1985. http://www.inchem.org/documents/ehc/ehc/ehc51.htm

Все ссылки, цитированные в этом патентном документе, введены в полном объеме.

0-1 Из PCT/RO/134 (SAFE) Указания относительно депонированного микроорганизма(ов)
или другого биологического материала (PCT Rule 13bis) Опубликованная он-лайн версия РСТ3.
50 (Build 0001.164) 0-1-1 Готовый для использования   0-2 № международной публикации   0-3 Регистрационный номер заявителя или патентного поверенного P2253PC00

1 Приведенные ниже указания относятся к депонированному микроорганизму(ам) или другому биологическому материалу со ссылкой  

1-1 на описание в:
параграф номер страница 13, строка 7 1-3 Идентификация депозита   1-3-1 Наименование депозитария DSMZ DSMZ- Немецкая коллекция микроорганизмов и культур клеток GmbH 1-3-2 Адрес депозитария Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig, Germany 1-3-3 Дата депонирования 8 февраля 2006 года (08.02.2006) 1-3-4 Инвентарный номер DSMZ 17959 1-5 Государства, для которых сделаны указания все названные 2 Приведенные ниже указания относятся к депонированному микроорганизму(ам) или другому биологическому материалу со ссылкой на описание в:   2-1 параграф номер страница 13, строка 9 2-3 Идентификация депозита   2-3-1 Наименование депозитария DSMZ DSMZ- Немецкая коллекция микроорганизмов и культур клеток GmbH 2-3-2 Адрес депозитария Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig, Germany 2-3-3 Дата депонирования 30 марта 2006 года (30.03.2006) 2-3-4 Инвентарный номер DSMZ 18142 2-5 Государства, для которых сделаны указания все названные 3 Приведенные ниже указания относятся к депонированному микроорганизму(ам) или другому биологическому материалу со ссылкой на описание в:   3-1 параграф номер страница 13, строка 9 3-3 Идентификация депозита   3-3-1 Наименование депозитария DSMZ DSMZ- Немецкая коллекция микроорганизмов и культур клеток GmbH 3-3-2 Адрес депозитария Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig, Germany 3-3-3 Дата депонирования 30 марта 2007 года (30.03.2007) 3-3-4 Инвентарный номер DSMZ 18143 3-5 Государства, для которых сделаны указания все названные

4 Приведенные ниже указания относятся к депонированному микроорганизму(ам) или другому биологическому материалу со ссылкой на описание в:   4-1 параграф номер страница 13, строка 9 4-3 Идентификация депозита   4-3-1 Наименование депозитария DSMZ DSMZ- Немецкая коллекция микроорганизмов и культур клеток GmbH 4-3-2 Адрес депозитария Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig, Germany 4-3-3 Дата депонирования 30 марта 2007 года (30.03.2007) 4-3-4 Инвентарный номер DSMZ 18144 4-5 Государства, для которых сделаны указания все названные 5 Приведенные ниже указания относятся к депонированному микроорганизму(ам) или другому биологическому материалу со ссылкой на описание в:   5-1 параграф номер страница 13, строка 9 5-3 Идентификация депозита   5-3-1 Наименование депозитария DSMZ DSMZ- Немецкая коллекция микроорганизмов и культур клеток GmbH 5-3-2 Адрес депозитария Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig, Germany 5-3-3 Дата депонирования 3 апреля 2007 года (03.04.2007) 5-3-4 Инвентарный номер DSMZ 19252 5-5 Государства, для которых сделаны указания все названные 6 Приведенные ниже указания относятся к депонированному микроорганизму(ам) или другому биологическому материалу со ссылкой на описание в:   6-1 параграф номер страница 13, строка 10 6-3 Идентификация депозита   6-3-1 Наименование депозитария DSMZ DSMZ- Немецкая коллекция микроорганизмов и культур клеток GmbH 6-3-2 Адрес депозитария Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig, Germany

6-3-3 Дата депонирования 3 апреля 2007 года (03.04.2007) 6-3-4 Инвентарный номер DSMZ 19251 6-5 Государства, для которых сделаны указания все названные

Только для принимающего ведомства

0-4 Эта форма была получена для международной публикации (да или нет)   0-4-1 Уполномоченное лицо  

Только для международного бюро

0-5 Эта форма была получена Международным бюро   0-5-1 Уполномоченное лицо  

Изобретение касается способа получения штамма Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus с пониженным постпродуцированием молочной кислоты. Способ предусматривает воздействие на материнский штамм Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, обладающий высокими текстурирующими свойствами и высоким постпродуцированием кислоты, слабым мутагеном - сульфонат этил метаном (EMS) и последующий отбор штаммов заданных характеристик. Отобранные текстурирующие штаммы Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus (варианты), характеризуются следующим: а) имеют рН, измеренный стандартным способом в пределах 4,25-4,55 после 14 дней хранения; b) имеют текстурирующие свойства, измеренные с использованием анализа определения вязкости, не менее чем 25 Па или а) снижают рН на менее чем 0,20 или 0,30 единиц рН после 14 дней хранения при температуре 8°С; b) имеют текстурирующие свойства, измеренные с использованием анализа определения вязкости, не менее чем 25 Па. Изобретение относится к применению отобранных штаммов для получения ферментированных молочных продуктов и молочных продуктов, содержащих штаммы Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus с выше обозначенными характеристиками. Изобретение обеспечивает получение молочного продукта, имеющего более выраженные текструрирующие свойства и меньшее постпродуцирование кислоты. 8 н. и 4 з.п. ф-лы, 5 ил., 2 пр.

1. Способ получения штамма Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, который продуцирует меньше кислоты, когда присутствует в ферментированном молочном продукте, по сравнению с материнским штаммом, где способ включает обработку штамма Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus слабым мутагеном, где материнский штамм выбирают из штаммов со следующими свойствами:
a) высокие текстурирующие свойства и
b) высокое постпродуцирование кислоты.

2. Способ по п.1, где материнский штамм выбирают из штаммов со следующими свойствами:
a) высокие текстурирующие свойства, то есть штамм имеет текстурирующие свойства, измеренные с использованием анализа определения вязкости, не менее чем 25 Па; и
b) высокое постпродуцирование кислоты, то есть штамм, который снижает рН более чем на 0,20 единиц рН после 7 дней хранения.

3. Способ по п.1 или 2, где полученный штамм Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, характеризуется следующим:
а) имеет рН, измеренный стандартным способом, в пределах 4,25-4,55 после 14 дней хранения и
b) имеет текстурирующие свойства, измеренные с использованием анализа определения вязкости, не менее чем 25 Па.

4. Способ по п.1 или 2, где полученный штамм Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, характеризуется следующим:
a) снижает рН, измеренный стандартным способом, на менее чем 0,30 единиц рН после 14 дней хранения и
b) имеет текстурирующие свойства, измеренные с использованием анализа определения вязкости, не менее чем 25 Па.

5. Способ по п.1 или 2, где полученный штамм Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus, характеризуется следующим:
а) снижает рН, измеренный стандартным способом, на менее чем на 0,20 единиц рН после 7 дней хранения при температуре 8°С; и
b) имеет текстурирующие свойства, измеренные с использованием анализа определения вязкости, не менее чем 25 Па.

6. Текстурирующий штамм Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus CHCC 10019 (DSM 19252), полученный способом по любому из пп.1-5.

7. Текстурирующий штамм Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus CHCC8535 (DSM 18144), полученный способом по любому из пп.1-5.

8. Текстурирующий штамм Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus CHCC7159 (DSM 17959), полученный способом по любому из пп.1-5.

9. Молочный продукт, полученный способом, включающим смешивание штамма по любому из пп.6-8 с молоком.

10. Молочный продукт, полученный способом, включающим смешивание штамма Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus, который получен способом по любому из пп.1-5 с молоком.

11. Способ получения молочного продукта, который включает смешивание штамма по любому из пп.6-8 с молоком.

12. Способ получения молочного продукта, который включает смешивание штамма Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus, который получен способом по любому из пп.1-5 с молоком.