САХАРОЗООТРИЦАТЕЛЬНЫЙ ШТАММ STREPTOCOCCUS THERMOPHILUS ДЛЯ ПРИМЕНЕНИЯ ПРИ ПРИГОТОВЛЕНИИ ФЕРМЕНТИРОВАННЫХ ПРОДУКТОВ Российский патент 2025 года по МПК C12N1/20 A23C9/123 

Область техники

Настоящее изобретение относится к новым сахарозоотрицательным (Suc-) штаммам Streptococcus thermophilus, композициям, содержащим указанные штаммы, их применению, способам получения таких штаммов и способам приготовления ферментированных пищевых продуктов.

Уровень техники

Streptococcus thermophilus (также обозначаемый как Streptococcus salivarius subsp. thermophilus (также обозначаемый S. thermophilus) представляет собой грамположительную молочнокислую бактерию, широко используемую при приготовлении кисломолочных продуктов. S. thermophilus обычно используется вместе с Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus (также обозначаемый L. bulgaricus) в качестве закваски для приготовления йогурта и других видов кисломолочных продуктов.

Йогурты и другие кисломолочные продукты повсеместно потребляются и способствуют здоровому питанию, обеспечивая человека необходимыми питательными веществами. Однако неароматизированные кисломолочные продукты имеют характерный терпкий или кислый вкус, поэтому популярны ароматизированные и подслащенные кисломолочные продукты. Повышение осведомленности потребителей о преимуществах диеты с низким содержанием сахара вместе с тенденцией к тому, что потребитель воспринимает как «натуральные» продукты, привело к необходимости разработки кисломолочных продуктов с пониженным содержанием сахара, в которых используются натуральные подсластители (например, стевия). Использование штаммов S. thermophilus и L. Bulgaricus с высоким содержанием сахара также было предложено в качестве средства повышения сладости кисломолочных продуктов.

В WO 2013/160413 описаны мутантные штаммы S. thermophilus, обладающие подслащивающими свойствами благодаря секреции ими глюкозы. Эти штаммы характеризуются мутацией в гене глюкокиназы (glcK) и описаны как пригодные для использования в приготовлении кисломолочных продуктов. Однако также сообщается, что для таких штаммов процесс ферментации задерживается на 2-5 часов, что требует по меньшей мере 20 часов ферментации. Sorensen et al. (Appl Environ Microbiol. 2016 Apr 22) также раскрывают секретирующие глюкозу штаммы S. thermophilus St1-GS-1; St1-GS-2; St2-GS-1; St2-GS-2. Штаммы St1-GS-2 и St2-GS-2 не могли подкислять молоко, а мутантные по глюкокиназе штаммы (например, St1-GS-1 и St2-GS-1) проявляли отставание в начале подкисления на 2-3 часа по сравнению с исходными штаммами.

В WO 2011/026863 описаны высокотекстурированные штаммы S. thermophilus с мутациями в гене galK, которые продуцируют ферментированное молоко с высокой вязкостью. В WO 2017/103051 описаны штаммы S. thermophilus с улучшенными свойствами для подслащивания пищевых продуктов в комбинации с улучшенными структурообразующими свойствами.

Тем не менее, по-прежнему сложно снизить количество сахара, необходимого для приготовления ферментированных продуктов, при этом обеспечивая продукт с хорошими органолептическими свойствами, низким содержанием добавленного сахара и так называемой «чистой этикеткой» (краткий список ингредиентов с использованием как можно большего количества узнаваемых ингредиентов). Кроме того, кислотность ферментированных продуктов также может быть повышена после молочнокислого брожения за счет постподкисления из-за потребления бактериями других сахаров. Следовательно, иногда необходимо использовать повышенное количество сахара в исходном рецепте или добавлять сахар после ферментации.

Таким образом, остается потребность в средствах для приготовления ферментированных продуктов, обладающих хорошими органолептическими качествами, с использованием уменьшенного количества ингредиентов сахарозы.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение следует из гипотезы, сформулированной авторами изобретения, о том, что штаммы S. thermophilus с дефицитом метаболизма сахарозы, могут снизить количество сахара, необходимого для приготовления ферментированных пищевых продуктов, таких как кисломолочные продукты, и ограничить нежелательное подкисление, сохраняя при этом свойства указанных штаммов, необходимые для приготовления ферментированных пищевых продуктов, т. е. способность метаболизировать лактозу для эффективного ферментирования молочного молока и способность производить экзополисахариды (EPS) для придания текстуры ферментированному продукту. Однако оказалось, что отбор таких штаммов затруднен, и серьезные попытки, предпринятые авторами изобретения с использованием стратегии скрининга, не привели к выделению сахарозоотрицательных (Suc-) вариантов высокоэффективных штаммов S. thermophilus.

Неожиданно авторы изобретения обнаружили, что такие варианты могут быть получены путем отбора галактозоположительных (Gal+) вариантов перед отбором вариантов Suc-. Соответственно, настоящее изобретение относится к штаммам Suc-Gal+ Streptococcus thermophilus. Настоящее изобретение также относится к композициям, содержащим указанные штаммы, их применению, способам получения таких штаммов и способам приготовления ферментированных пищевых продуктов с использованием таких композиций.

Подробное описание изобретения

Используемый в настоящем описании термин «сахарозоотрицательный» (или Suc-) означает неспособность бактерии метаболизировать сахарозу. Согласно настоящему изобретению штамм Suc- S. thermophilus не способен расти в среде, содержащей сахарозу в качестве единственного источника углерода. И наоборот, термин «сахарозоположительный» (или Suc+) означает способность бактерии метаболизировать сахарозу или расти в среде, содержащей сахарозу в качестве единственного источника углерода. Эти фенотипы могут быть определены с использованием методов, хорошо известных специалистам в данной области. Например, эти фенотипы можно оценить, инокулируя в бульон М17, содержащий 2% сахарозы, ночную культуру тестируемого штамма S. thermophilus с концентрацией 1% и инкубируя в течение 20 часов при 37°С, при этом pH 6 или выше в конце инкубации указывает на Suc- фенотип, а pH 5,5 или ниже в конце инкубации указывает на Suc+ фенотип. В качестве альтернативы метаболический профиль бактериального штамма можно определить с использованием имеющихся в продаже наборов, таких как галерея API (bioMerieux).

Приведенное выше определение также применимо к фенотипам, относящимся к другим углеводам, ферментируемым молочнокислыми бактериями, в частности, к лактозе, галактозе, глюкозе или фруктозе.

Соответственно, термины «лактозоотрицательный» (или Lac-), «галактозоотрицательный» (или Gal-), «глюкозотрицательный» (или Glu-) или «фруктозоотрицательный» (или Fru-) относятся к неспособности бактерии метаболизировать лактозу, галактозу, глюкозу или фруктозу, соответственно. И наоборот, термины «лактозоположительный» (или Lac+), «галактозоположительный» (или Gal+), «глюкозоположительный» (или Glu+) или «фруктозоположительный» (или Fru+) относятся к способности бактерии метаболизировать лактозу, галактозу, глюкозу или фруктозу, соответственно. Как подробно описано выше, эти фенотипы можно легко оценить путем тестирования роста S. thermophilus в среде, содержащей интересующий сахар в качестве единственного источника углерода.

Используемый в настоящем описании термин «ферментация» означает метаболизм вещества микроорганизмами, т.е. бактериями, дрожжами или другими микроорганизмами. Используемый в настоящем описании термин «высокоферментативный», используемый в отношении молочнокислых бактерий, означает их штамм, способный значительно снижать pH подходящей среды при подходящей температуре культивирования. Что касается штамма S. thermophilus, то указанный штамм должен быть способен снижать рН среды, содержащей полуобезжиренное коровье молоко с добавлением дрожжевого экстракта (2 г/л), при инокуляции 1% инокулята по объему по меньшей мере на 1,8 рН-единиц (например, от 6,5 до 4,7) менее чем за 10 часов, более предпочтительно менее чем за 9, 8, 7, 6, 5 или за 4 часа при культивировании при температуре от примерно 37°С до примерно 43°С, более предпочтительно от 37°С до 43°С. Указанный инокулят содержит от примерно 10⁵ КОЕ до примерно 10⁷ КОЕ указанного S. thermophilus на грамм композиции инокулята, более предпочтительно от примерно 10⁶ КОЕ до примерно 10⁷ КОЕ.

Используемый в настоящем описании термин «текстурирование» означает, что штамм S. thermophilus способен значительно повышать вязкость ферментированного продукта за счет продукции экзополисахаридов (EPS). Способы определения текстуры молока включают измерение напряжения сдвига (вязкости) ферментированного молока и хорошо известны специалистам, а также описаны в приведенных ниже примерах.

Используемый в настоящем описании термин «стабильная композиция» означает композицию, которая демонстрирует отсутствие седиментации и/или отделение сыворотки.

Используемый в настоящем описании термин «x% (масс./масс.)» эквивалентен «x г на 100 г».

Используемые в настоящем описании термины «молочная композиция», «композиция на молочной основе» или «молочный продукт» означают продукт или композицию, по существу состоящую из молока или молочных компонентов и необязательно дополнительных ингредиентов.

Используемый в настоящем описании термин «кисломолочные продукты» означает продукт или композицию, которая является продуктом подкисляющей ферментации композиции на основе молока заквасочной культурой ферментирующих микроорганизмов, в частности, бактерий, предпочтительно молочнокислых бактерий. Используемый в настоящем описании термин «ферментированное молоко» означает продукт или композицию, полученную из молока подкисляющим действием по меньшей мере одной молочнокислой бактерии. Соответственно, в настоящем описании ферментированный молочный продукт может представлять собой ферментированное молоко, такое как йогурт (например, набор, перемешанный или питьевой йогурт), или свежий сыр, такой как белый сыр или «petit-Suisse». Это также может быть cцеженное ферментированное молоко, такое как cцеженный йогурт (например, концентрированный или греческий йогурт).

Термины «ферментированное молоко» и «йогурт» имеют свои обычные значения в области молочной промышленности, то есть продукты, пригодные для потребления человеком и происходящие от подкисляющего молочнокислого брожения молочного субстрата. Эти продукты могут содержать вторичные ингредиенты, такие как фрукты, овощи, сахар и т. д. Выражение «ферментированное молоко» может использоваться для обозначения кисломолочных продуктов, отличных от йогуртов, например, «Кефир», «Kumtss», «Lassi», «Dahi», «Leben», «Filmjolk», «Villi», «Ацидофильное молоко».

Термин «йогурт», используемый в настоящем описании, означает ферментированное молоко, полученное подкисляющим молочнокислым брожением определенных термофильных молочнокислых бактерий, таких как Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus и Streptococcus thermophilus (также обозначаемых как Streptococcus salivarius subsp. thermophilus), которые в готовом продукте должны находиться в живом состоянии на минимальном уровне КОЕ. В некоторых странах правила разрешают добавлять в йогурт дополнительные молочнокислые бактерии, такие как, но не ограничиваясь этим, штаммы Bifidobacterium и/или Lactobacillus acidophilus и/или Lactobacillus casei. Эти дополнительные штаммы молочнокислых бактерий предназначены для придания готовому продукту различных свойств, таких как придание органолептических качеств, благоприятствование равновесию кишечной флоры или модулирование иммунной системы.

Используемый в настоящем описании термин «сцеженная ферментированная молочная композиция» означает ферментированную молочную композицию, которая была подвергнута постферментационному процессу отделения кислой сыворотки.

Используемый в настоящем описании термин «вязкий» означает твердое или полутвердое вещество, которое можно употреблять с помощью ложки или другого прибора.

Используемый в настоящем описании термин «кое» или «КОЕ» следует понимать как аббревиатуру термина «колониеобразующая единица».

Используемый в настоящем описании термин «CNCM I-», за которым следует 4-значный номер, означает штамм, депонированный в Национальной коллекции культур микроорганизмов (CNCM) 25, rue du Docteur Roux, Париж, Франция, в соответствии с Будапештским договором с номером доступа, соответствующим указанному 4-значному номеру, например CNCM I-5448.

Используемая в настоящем описании ссылка на бактериальный штамм или вид должна включать функционально эквивалентные бактерии, происходящие от него, такие как, но не ограничиваясь ими, мутанты или варианты. Эти мутанты или варианты могут быть штаммами, в которых один или более эндогенных генов родительского штамма были мутированы нецелевыми средствами (случайный мутагенез, индуцированный, например, УФ-излучением или алкилирующими агентами), например, для модификации некоторых из их метаболических свойств (например, их способность ферментировать сахара, их устойчивость к кислотности, их выживаемость при транспортировке в желудочно-кишечном тракте, их свойства после подкисления или продукция их метаболитов).

Используемый в настоящем описании термин «ГМО» означает организм, за исключением человека, в котором генетический материал был изменен таким образом, который не происходит естественным образом в результате спаривания и/или естественной рекомбинации, причем указанный термин следует понимать как охватывающий, например, организмы, которые подвергаются генетической трансформации, включая экзогенную ДНК, или целенаправленное редактирование генов, как например методики CRISPR/Cas9. Термин «ГМО» следует понимать, как исключающий и не охватывающий организм, в котором генетический материал был изменен в результате случайного мутагенеза, такого как химические или радиационные средства, с последующим фенотипическим отбором.

В настоящем тексте штаммы, мутанты и варианты, происходящие от родительского вида или штамма, будут рассматриваться как охватываемые ссылкой на указанный родительский вид или штамм, например выражения «Streptococcus thermophilus» и «CNCM I-5448» должны включать штаммы, мутанты и производные от них варианты. Соответственно, используемая в настоящем описании ссылка на бактериальный штамм, указанный номером доступа или номером депозита, должна охватывать его варианты, имеющие по меньшей мере 95% идентичности (см.: Stackebrandt & Goebel, 1994, Int. J. Syst. Bacteriol. 44:846-849). В особенно предпочтительном варианте осуществления указанный вариант имеет по меньшей мере 97% идентичности с последовательностью 16S рРНК указанного определенного штамма, более предпочтительно по меньшей мере 98% идентичности, более предпочтительно по меньшей мере 99% или более идентичности.

Используемый в настоящем описании термин «по существу чистый» при использовании в отношении бактериального штамма относится к проценту указанного бактериального штамма по отношению к общему содержанию микроорганизмов. По существу чистый может быть чистым по меньшей мере примерно на 99,99%, по меньшей мере примерно на 99,9%, по меньшей мере примерно на 99,5%, по меньшей мере примерно на 99%, по меньшей мере примерно на 95%, по меньшей мере примерно на 90%, по меньшей мере примерно на 85% или по меньшей мере примерно на 75%.

Используемый в настоящем описании термин «молочнокислая бактерия» представляет собой грамположительную, кислотоустойчивую, обычно не образующую спор и не дышащую палочковидную или коккообразную бактерию, которая способна ферментировать сахара в молочную кислоту.

Streptococcus thermophilus

В одном аспекте настоящее изобретение относится к штамму Streptococcus thermophilus, отличающемуся тем, что он является галактозоположительным (Gal+) и сахарозоотрицательным (Suc-).

В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к штамму, определенному выше, дополнительно отличающемуся тем, что он является фруктозоотрицательным (Fru-).

В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к штамму, определенному выше, дополнительно отличающемуся тем, что он является глюкозоположительным (Glu+).

В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к штамму, как определено выше, дополнительно отличающемуся тем, что он является лактозоположительным (Lac+).

В предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение относится к штамму Streptococcus thermophilus, отличающемуся тем, что он представляет собой Gal+Suc-Fru-, предпочтительно Gal+Suc-Fru-Glu+, наиболее предпочтительно Gal+Suc-Fru-Glu+Lac+.

Такие штаммы особенно подходят для приготовления ароматизированных ферментированных продуктов, поскольку они ограничивают или предотвращают снижение содержания сахарозы и/или фруктозы, присутствующих в исходной смеси.

В наиболее предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение относится к штамму Streptococcus thermophilus, как определено выше, отличающемуся высокой ферментативностью.

В предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение относится к штамму, определенному выше, дополнительно отличающемуся тем, что он является текстурирующим.

В предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение относится к штамму, определенному выше, дополнительно отличающемуся тем, что он не является ГМО-организмом, за исключением варианта встречающегося в природе штамма, который был получен в процессе случайного мутагенеза химическими или радиационными средствами и фенотипическим отбором. Так, например, штамм по изобретению может быть галактозоположительным (Gal+) и сахарозоотрицательным (Suc-), полученным из штамма S. thermophilus дикого типа с помощью УФ-излучения или случайного мутагенеза с алкилирующим агентом с последующим отбором на основе метаболического профиля.

В одном варианте осуществления штамм по настоящему изобретению продуцирует экзополисахарид при культивировании в среде на основе молока, и в предпочтительных вариантах осуществления его можно использовать для приготовления ферментированного молочного продукта, имеющего вязкость более 800 мПа⋅с, более предпочтительно более 900 мПа⋅с и наиболее предпочтительно более 1000 мПа⋅с при 4°C. В некоторых вариантах осуществления композиция имеет диапазон вязкости от 800 до 2000 мПа⋅с или от 800 до 1500 мПа⋅с при 4°C. Указанную вязкость измеряют с использованием охлаждаемого реометра MCR301, снабженного системой концентрических цилиндров диаметром 27 мм в соответствии с уравнением I, после 7 дней хранения при 4°С.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к штамму Streptococcus thermophilus, отличающемуся тем, что его геном содержит по меньшей мере одну мутацию, выбранную из группы, состоящей из замены в гене lacS, соответствующей SEQ ID NO: 1, замены в промоторе galK, предпочтительно в сайте Cre, соответствующем TGAAAGGGGTTACG (SEQ ID NO: 15), несмысловой мутации в гене scrA, соответствующей SEQ ID NO: 7, и замены в гене galR, соответствующем SEQ ID NO: 11.

В одном варианте осуществления геном штамма по изобретению содержит две, три или все мутации из группы, состоящей из замены в гене lacS, соответствующей SEQ ID NO: 1, замены в промоторе galK, предпочтительно в Cre-сайте, соответствующей SEQ ID NO: 15, несмысловой мутации в гене scrA, соответствующей SEQ ID NO: 7, и замены в гене galR, соответствующей SEQ ID NO: 11.

В одном варианте осуществления замена в гене lacS представляет собой замену, в частности C/A, в положении 1159 SEQ ID NO: 1. В одном варианте осуществления замена в промоторе galK представляет собой замену, в частности, G/T, в положении 228 SEQ ID NO: 5. В одном варианте осуществления несмысловая мутация в scrA представляет собой замену, в частности C/T, в положении 1393 SEQ ID NO: 7. В одном варианте осуществления замена в гене galR представляет собой замену, в частности Т/С, в положении 281 SEQ ID NO: 11.

В одном варианте осуществления геном штамма по изобретению содержит замену, в частности C/A, в положении 1159 SEQ ID NO: 1, замену, в частности G/T, в положении 228 SEQ ID NO: 5 и замену, в частности, С/Т, в положении 1393 SEQ ID NO: 7.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к штамму Streptococcus thermophilus, отличающемуся тем, что его геном содержит по меньшей мере одну последовательность, выбранную из группы, состоящей из: SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8 и SEQ ID НЕТ: 12.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к штамму Streptococcus thermophilus, отличающемуся тем, что его геном содержит две, три или все последовательности, выбранные из группы, состоящей из: SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8 и SEQ ID NO: 12.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к штамму Streptococcus thermophilus, отличающемуся тем, что его геном содержит последовательности SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 8.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к штамму Streptococcus thermophilus, отличающемуся тем, что он экспрессирует по меньшей мере один белок, выбранный из группы, состоящей из белка LacS с последовательностью SEQ ID NO: 4, белка ScrA с последовательностью SEQ ID NO: 10 и белка GalR с последовательностью SEQ ID NO: 14.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к штамму Streptococcus thermophilus, отличающемуся тем, что он экспрессирует два, три или все белки, выбранные из группы, состоящей из белка LacS с последовательностью SEQ ID NO: 4, белка ScrA с последовательностью SEQ ID NO: 10 и белка GalR с последовательностью SEQ ID NO: 14.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к штамму Streptococcus thermophilus, отличающемуся тем, что он экспрессирует белок LacS с SEQ ID NO: 4, белок ScrA с SEQ ID NO: 10.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к штамму Streptococcus thermophilus CNCM I-5448. Этот штамм был депонирован в Национальной коллекции культур микроорганизмов (CNCM) (Институт Пастера, 25 Rue du Docteur Roux, Париж, Франция) на основании Будапештского Договора от 20 ноября 2019 г. под идентификационным номером CNCM I-5448. Депонирование было сделано в соответствии с Будапештским договором о международном признании депонирования микроорганизмов для целей патентной процедуры, как указано в нем, заявитель просит предоставить образец депонированных микроорганизмов только независимому эксперту, до даты выдачи патента. Штамм S. thermophilus CNCM I-5448 соответствует клону 11R15, описанному в приведенных ниже примерах.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к штамму S. thermophilus CNCM I-5448, который является по существу чистым.

Способы получения сахарозоотрицательных штаммов

Большинство штаммов S. thermophilus дикого типа являются сахарозоположительными, и разработка сахарозоотрицательных вариантов путем случайного мутагенеза оказалась сложной задачей. Кроме того, метаболический путь углеводов и путь биосинтеза экзополисахаридов тесно связаны у S. thermophilus, и вредная мутация в метаболизме сахарозы резко снижает рост S. thermophilus. Однако, как показано в приведенных ниже примерах, эта трудность прямого выделения вариантов Suc- преодолевается путем выделения вариантов Gal+ перед отбором вариантов Suc-.

Большинство штаммов S. thermophilus дикого типа являются Gal-, и почти все текстурирующие штаммы содержат галактозу в составе EPS. Безотносительно к какой-либо теории, была выдвинута гипотеза, что галактозный путь может компенсировать дефицит сахарозного пути и сделать возможным выделение Suc-вариантов, которые также сохраняют способность к текстурированию штамма дикого типа.

Соответственно, аспект настоящего изобретения относится к способу получения сахарозоотрицательного штамма S. thermophilus, включающему:

i) предоставление первого штамма S. thermophilus,

ii) отбор по меньшей мере одного его галактозоположительного клона,

iii) мутирование указанного отобранного клона(клонов), выбранного в ii), предпочтительно с помощью химических веществ или облучения, и отбор по меньшей мере одного его сахарозоотрицательного варианта.

В одном варианте осуществления указанный первый штамм S. thermophilus представляет собой Gal-Suc+.

В предпочтительном варианте осуществления указанный первый штамм S. thermophilus представляет собой Gal-Suc+Fru-.

В наиболее предпочтительном варианте осуществления указанный первый штамм S. thermophilus представляет собой Gal-Suc+ Fru-Glu+ Lac+.

В одном варианте осуществления указанный первый штамм S. thermophilus представляет собой текстурирующий штамм, продуцирующий экзополисахариды.

Стадия ii) может быть осуществлена, но не ограничиваясь этим, путем субкультивирования первого штамма S. thermophilus в среде с галактозой в качестве единственного источника углерода, предпочтительно в среде М17, наиболее предпочтительно в модифицированной среде М17 (глицерофосфат 9 г/л).

Стадию iii) предпочтительно проводят путем случайного мутагенеза, предпочтительно путем воздействия алкилирующих агентов или воздействия УФ-излучения, более предпочтительно путем воздействия дозы УФ-излучения, дающей приблизительно 2% выживаемости.

В одном варианте осуществления указанный способ дополнительно включает:

iv) отбор сахарозоотрицательного варианта, который является высокоферментативным в среде на основе молока, и/или субкультивирование сахарозоотрицательного варианта в среде на основе молока. Эта дополнительная стадия позволяет выделить по меньшей мере один штамм, обладающий способностью к более быстрой ферментации молока.

Субкультивирование сахарозоотрицательного варианта в среде на основе молока предпочтительно проводить более одного раза, например 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 или 15 раз. Предпочтительно субкультивирование проводят по меньшей мере 10 раз, более предпочтительно по меньшей мере 15 раз.

В варианте осуществления стадию iii) осуществляют путем мутации гена lacS, соответствующего SEQ ID NO: 1, и/или промотора galK, предпочтительно в сайте Cre, соответствующем TGAAAGGGGTTACG (SEQ ID NO: 15), и/или гена scrA, соответствующего SEQ ID NO: 7, и/или гена galR, соответствующего SEQ ID NO: 11.

В одном варианте осуществления стадию iii) осуществляют путем введения замены в гене lacS, соответствующем SEQ ID NO: 1, и/или замены в промоторе galK, предпочтительно в сайте Cre, соответствующем TGAAAGGGGTTACG (SEQ ID NO: 15), и/или несмысловой мутации в гене ScrA, соответствующем SEQ ID NO: 7, и/или замены в гене galR, соответствующем SEQ ID NO: 11.

В одном варианте осуществления замена в гене lacS представляет собой замену, в частности C/A, в положении 1159 SEQ ID NO: 1. В одном варианте осуществления замена в промоторе galK представляет собой замену, в частности, G/T, в положении 228 SEQ ID NO: 5. В одном варианте осуществления несмысловая мутация в scrA представляет собой замену, в частности C/T, в положении 1393 SEQ ID NO: 7. В одном варианте осуществления замена в гене galR представляет собой замену, в частности Т/С, в положении 281 SEQ ID NO: 11.

Композиции по изобретению

В одном аспекте настоящее изобретение относится к композициям, содержащим штамм Streptococcus thermophilus, как определено выше.

Предпочтительно композиция содержит по меньшей мере 10⁵, более предпочтительно по меньшей мере 10⁶ и наиболее предпочтительно по меньшей мере 10⁷ колониеобразующих единиц (КОЕ) штамма S. thermophilus по изобретению на грамм (г) композиции.

В некоторых вариантах осуществления композиция содержит от 10⁵ до 10¹² КОЕ штамма S. thermophilus по изобретению на грамм (г) композиции. В некоторых вариантах осуществления композиция содержит от 10⁶ до 10¹¹ КОЕ штамма S. thermophilus по изобретению на грамм (г) композиции. В некоторых вариантах осуществления композиция содержит по меньшей мере 10⁵, 10⁶, 10⁷, 10⁸, 10⁹, 10¹⁰, 10¹¹ или 10¹² КОЕ штамма S. thermophilus по изобретению на грамм (г) композиции.

В одном варианте осуществления композиция содержит по меньшей мере 10⁵, 10⁶, 10⁷, 10⁸, 10⁹, 10¹⁰, 10¹¹ или 10¹² КОЕ штамма Streptococcus thermophilus CNCM I-5448 на грамм (г) композиции.

Представленная в настоящем описании бактерия пригодна для использования в пищевых композициях, соответственно, в одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к композиции, пригодной для потребления человеком или приема внутрь, предпочтительно пероральным путем. Соответственно, композиция содержит съедобный материал или состоит из него. Особенно предпочтительно, чтобы композиции вариантов осуществления изобретения по существу не содержали патогенных или токсикогенных веществ. Композиция в соответствии с вариантами осуществления изобретения может представлять собой лекарственное средство или фармацевтическую композицию. В особенно предпочтительном варианте осуществления композиция по изобретению может быть нетерапевтической композицией, предпочтительно нутрицевтической композицией, питательной композицией и/или пищевой композицией. Особенно предпочтительно, чтобы пищевая композиция представляла собой ферментированную пищевую композицию, предпочтительно ферментированную молочную композицию. Дополнительные композиции в соответствии с вариантами осуществления изобретения также включают пищевые добавки, пищевые ингредиенты, нутрициональные добавки, питательные смеси, детское питание, молочные смеси для грудных детей и смеси для прикорма младенцев.

Композиция может содержать другие дополнительные штаммы Bifidobacterium и/или молочнокислых бактерий; обычно 1, 2, 3, 4 или более дополнительных штаммов. Примеры Bifidobacterium, которые можно использовать, включают, но не ограничиваются ими, Bifidobacterium animalis (например, Bifidobacterium animalis subsp. Animalis или Bifidobacterium animalis subsp. lactis); Bifidobacterium longum; Bifidobacterium breve; Bifidobacterium bifidum. Примеры молочнокислых бактерий, которые можно использовать, включают, но не ограничиваются ими, Lactobacilli (например, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus buchneri, Lactobacillus delbrueckii, в частности L. delbrueckii subsp. bulgaricus, или lactis, или delbrueckii, Lactobacillus casei, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus brevis, Lactobacillus rhamnosus); Lactococci (например, Lactococcus lactis, обычно Lactococcus lactis subsp. lactis или Lactococcus lactis subsp. cremoris). Предпочтительно композиция дополнительно содержит Lactobacillus и/или Streptococcus. Для приготовления йогурта композиция обычно содержит Lactobacillus bulgaricus (также называемую Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus) и Streptococcus thermophilus, необязательно с дополнительными микроорганизмами, такими как, но не ограничиваясь ими, пробиотические виды или другие виды, например другие штаммы Lactococcus lactis, которые могут придать композиции желаемые органолептические или другие качества.

Соответственно, в одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к композиции, содержащей штамм Streptococcus thermophilus CNCM I-5448 и дополнительно содержащей по меньшей мере один штамм Lactobacillus bulgaricus и необязательно один или более штаммов Lactococcus lactis и/или Bifidobacterium.

Молочные композиции

Штаммы по настоящему изобретению особенно подходят для приготовления ферментированных композиций. Соответственно, в одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к молочной композиции, предпочтительно ферментированной молочной композиции. Молочная композиция по изобретению содержит молоко, предпочтительно ферментированное молоко. Предпочтительно композиция содержит по меньшей мере примерно 30% (масс./масс.) молока, более предпочтительно, по меньшей мере примерно 50% (масс./масс.) молока и еще более предпочтительно, по меньшей мере примерно 70% (масс./масс.) молока. В некоторых вариантах осуществления композиция содержит от 30% до 100% (масс./масс.) молока. В некоторых вариантах осуществления композиция содержит от 50% до 100% (масс./масс.) молока. В некоторых вариантах осуществления композиция содержит от 70% до 100% (масс./масс.) молока. Молоко предпочтительно представляет собой растительное и/или животное молоко, более предпочтительно соевое, миндальное, овсяное, конопляное, полбяное, кокосовое, рисовое, козье, овечье, верблюжье, кобылье или коровье молоко, и наиболее предпочтительно коровье молоко. Предпочтительно указанное молоко подвергают термической обработке, обычно пастеризации, для обеспечения стерильности. Предпочтительно указанную термическую обработку проводят перед приготовлением ферментированной молочной композиции.

Предпочтительно указанное молоко включает одно или более из обезжиренного, частично обезжиренного или не обезжиренного молока. Предпочтительно указанное молоко или несколько видов молока могут быть в жидкой, порошкообразной и/или концентрированной форме. В одном варианте осуществления указанное молоко дополнительно содержит компоненты молока, предпочтительно выбранные из группы, состоящей из сливок, казеина, казеината (например, казеината кальция или натрия), белков молочной сыворотки, в частности, в форме концентрата (WPC), белков молока, в частности, в форме концентрата (MPC), гидролизатов молочного белка и их смесей. В одном варианте осуществления указанная смесь дополнительно содержит растительные и/или фруктовые соки. В одном варианте осуществления указанное молоко или несколько видов молока могут быть обогащены или витаминизированы дополнительными компонентами молока или другими питательными веществами, такими как, помимо прочего, витамины, минералы, микроэлементы или другие питательные микроэлементы.

Предпочтительно, молочная композиция содержит выше примерно 0,3 г на 100 г по массе свободной молочной кислоты, более предпочтительно выше примерно 0,7 г или 0,6 г на 100 г по массе свободной молочной кислоты. В некоторых вариантах осуществления композиция содержит от 0,3 г до 0,7 г на 100 г по массе свободной молочной кислоты.

Молочная композиция предпочтительно имеет содержание белка, по меньшей мере эквивалентное содержанию белка в молоке или нескольких видах молока, из которого она получена, предпочтительно по меньшей мере примерно 2,5%, более предпочтительно по меньшей мере примерно 3% или 3,5% (масс./масс.). Предпочтительно композиция имеет рН, равное или ниже 5, предпочтительно от примерно 3 до примерно 4,5 и более предпочтительно от примерно 3,5 до примерно 4,5.

Предпочтительно ферментированная молочная композиция после 7 дней хранения при 4°С имеет вязкость более 800 мПа⋅с, более предпочтительно более 900 мПа⋅с и наиболее предпочтительно более 1000 мПа⋅с при 4°С согласно уравнению I. В некоторых вариантах осуществления композиция имеет диапазон вязкости от 800 до 2000 мПа⋅с или от 800 до 1500 мПа⋅с при 4°C, измеренной с использованием охлаждаемого реометра MCR301, оснащенного системой концентрических цилиндров диаметром 27 мм, в соответствии с уравнением I.

Ферментированная молочная композиция в соответствии с вариантами осуществления изобретения предпочтительно представляет собой продукт, выбранный из группы, включающей йогурт, термостатный йогурт, перемешанный йогурт, жидкий йогурт, йогуртовый напиток, замороженный йогурт, кефир, пахту, творог, сметану, свежий сыр и сыр. В одном варианте осуществления композиция в соответствии с вариантами осуществления изобретения представляет собой питьевую композицию, более предпочтительно кисломолочный напиток, такой как, помимо прочего, йогуртовый напиток, кефир и т.д. В альтернативном варианте осуществления композиция в соответствии с вариантами осуществления изобретения представляет собой вязкую композицию, такую как термостатный или перемешанный йогурт или их эквивалент.

В одном варианте осуществления ферментированная молочная композиция представляет собой сцеженную ферментированную молочную композицию. Сцеженная ферментированная молочная композиция предпочтительно имеет следующее содержание (% по массе):

- от 8,5% до 11% молочного белка

- от 0% до 8% жира, например от 0% до 3,5% или от 3,5% до 8%

- от 0% до 7% лактозы, например от 2,8% до 6%.

рН сцеженной ферментированной молочной композиции может составлять, например, от 3,8 до 4,65.

Предпочтительно композиция согласно вариантам осуществления изобретения может храниться, транспортироваться и/или распределяться при температуре от 1°C до 10°C в течение по меньшей мере примерно 30 дней, по меньшей мере примерно 60 дней или по меньшей мере примерно 90 дней из упаковки и остается пригодной для употребления.

В некоторых вариантах осуществления молочные композиции по изобретению содержат по меньшей мере 10⁵ КОЕ/г, более предпочтительно по меньшей мере 10⁶ КОЕ/г, например, по меньшей мере 10⁷ КОЕ/г, например по меньшей мере 10⁸ КОЕ/г, например по меньшей мере 10⁹ КОЕ/г, например по меньшей мере 10¹⁰ КОЕ/г, например, по меньшей мере 10¹¹ КОЕ/г штамма S. thermophilus по изобретению на грамм молочной композиции. В некоторых вариантах осуществления композиции по изобретению содержат от 10⁵ до 10¹² или от 10⁶ до 10¹⁰ колониеобразующих единиц (КОЕ) штамма S. thermophilus по изобретению на грамм композиции, предпочтительно S. thermophilus CNCM I-5448.

Предпочтительно композиция представляет собой упакованный продукт, который содержит по меньшей мере 10⁶, более предпочтительно по меньшей мере 10⁷ и наиболее предпочтительно по меньшей мере 10⁸ колониеобразующих единиц (КОЕ) Streptococcus thermophilus CNCM I-5448 на грамм (г) композиции в соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения после хранения, транспортировки и/или распределения при температуре от 1°С до 10°С в течение по меньшей мере примерно 30 дней, по меньшей мере примерно 60 дней или по меньшей мере примерно 90 дней с момента упаковки.

В некоторых вариантах осуществления композиция представляет собой упакованный продукт, содержащий от 10⁵ до 10¹² или от 10⁶ до 10¹⁰ колониеобразующих единиц (КОЕ) Streptococcus thermophilus CNCM I-5448 на грамм (г) композиции согласно вариантам осуществления изобретения после хранения, транспортировки и /или распределение при температуре от 1°С до 10°С в течение по меньшей мере примерно 30 дней, по меньшей мере примерно 60 дней или по меньшей мере примерно 90 дней с момента упаковки.

В некоторых вариантах осуществления молочная композиция дополнительно содержит промежуточный препарат. Промежуточные препараты известны специалистам в данной области. Их обычно используют для модификации вкуса, ощущения во рту и/или текстуры молочной композиции, например ферментированной молочной композиции. Их также можно использовать для введения некоторых добавок, таких как питательные вещества. Обычно они содержат подсластители, ароматизаторы, модификаторы цвета, злаки и/или фрукты. Промежуточные фруктовые препараты представляют собой, например, суспензии или фруктовые препараты. Ароматизаторы включают, например, фруктовые ароматизаторы, ванильные ароматизаторы, карамельные ароматизаторы, кофейные ароматизаторы, шоколадные ароматизаторы.

Фруктовые препараты обычно содержат фрукты, поскольку используемый в настоящем описании термин «фрукты» относится к любой форме фруктов, включая, например, цельные фрукты, кусочки, пюре, концентраты, соки и т.д.

Промежуточный препарат или суспензия обычно содержит стабилизирующий агент, содержащий по меньшей мере один стабилизатор. Стабилизирующий агент может включать по меньшей мере два стабилизатора. Такие стабилизаторы известны специалистам в данной области. Обычно они помогают избежать фазового разделения твердых веществ, например фруктов или фруктовых экстрактов, и/или избежать синерезиса. Они обычно придают композиции некоторую вязкость, например вязкость (вязкость по Боствику при 20°С) от 1 до 20 см/мин, предпочтительно от 4 до 12 см/мин.

Стабилизирующая система или стабилизатор может, например, представлять собой крахмал, пектин, агар, ксантан, каррагинан, камедь плодов рожкового дерева или их смесь. Количество стабилизирующей системы обычно составляет от 0,5 до 5 масс.%.

Промежуточный препарат обычно может содержать органолептические модификаторы. Такие ингредиенты известны специалистам в данной области техники.

Органолептические модификаторы могут представлять собой, например, подсластители, отличные от сахара, красители, злаки и/или экстракты злаков.

Примерами подсластителей являются ингредиенты, называемые высокоинтенсивными подсластителями, такие как сукралоза, ацесульфам К, аспартам, сахарин.

Примеры фруктов включают, например, клубнику, персик, абрикос, манго, яблоко, грушу, малину, чернику, ежевику, маракуйю, вишню и их смеси или сочетания, такие как маракуйя-персик.

Плоды могут быть представлены, например, в следующем виде:

- кубики замороженных фруктов, например, кубики фруктов размером 10 мм, например, отдельные кубики быстрозамороженных фруктов, например, кубики клубники, персика, абрикоса, манго, яблока, груши или их смеси,

- асептические фруктовые кубики, например кубики фруктов размером 10 мм, например кубики клубники, персика, абрикоса, манго, яблока или груши или их смеси,

- фруктовые пюре, например фруктовые пюре, концентрированные от 2 до 5 раз, предпочтительно в 3 раза, например асептические фруктовые пюре, например фруктовые пюре из клубники, персика, абрикоса, манго, малины, черники или яблока или их смеси,

- однокомпонентные асептические фруктовые пюре, например клубничное, малиновое, персиковое, абрикосовое, черничное или яблочное однокомпонентные асептические фруктовые пюре или их смесь,

- замороженные цельные фрукты, например цельные фрукты индивидуальной быстрой заморозки, например замороженные цельные фрукты черники, малины или ежевики, или их смеси,

- их смеси.

Ингредиенты и/или компоненты промежуточного препарата и их количества обычно могут быть такими, чтобы композиция имела степень по шкале Брикса от 1 до 65, например, от 1 до 10 по шкале Брикса, или от 10 до 15 по шкале Брикса, или от 15 до 20 по шкале Брикса, или от 20 до 25 по шкале Брикса, или от 25 до 30 по шкале Брикса, или от 30 до 35 по шкале Брикса, или от 35 до 40 по шкале Брикса, или от 40 до 45 по шкале Брикса, или от 45 до 50 по шкале Брикса, или от 50 до 55 по шкале Брикса, или от 55 до 60 по шкале Брикса, или от 55 до 60 по шкале Брикса, или от 60 до 65 по шкале Брикса.

Фруктовый препарат может, например, содержать фрукты в количестве от 30% до 80% по массе, например, от 50 до 70% по массе.

Промежуточный препарат может содержать воду. Упоминается, что часть воды может поступать из ингредиентов, используемых для приготовления фруктового препарата, например, из фруктов или фруктовых экстрактов или из раствора фосфорной кислоты.

Фруктовый препарат может содержать агенты, изменяющие рН, такие как лимонная кислота. Фруктовый препарат может иметь рН от 2,5 до 5, предпочтительно от 2,8 до 4,2.

Обычно фруктовый препарат можно добавлять в количестве 5-35% по массе по отношению к общему количеству композиции. В вариантах осуществления композиция по изобретению содержит до примерно 30% (масс./масс.) указанного промежуточного препарата, например примерно до 10%, 15%, 20%, 25% (масс./масс.). В одном варианте осуществления композиция согласно вариантам осуществления изобретения содержит от 1% до 30% (масс./масс.) указанного промежуточного препарата. В альтернативных вариантах осуществления композиция согласно вариантам осуществления изобретения содержит от 1% до 25% (масс./масс.) указанного промежуточного препарата. В дополнительных альтернативных вариантах осуществления композиция согласно вариантам осуществления изобретения содержит от 1% до 20% (масс./масс.) указанного промежуточного препарата. В дополнительных вариантах осуществления композиция согласно вариантам осуществления изобретения содержит от 1% до 15% (масс./масс.) указанного промежуточного препарата. В дополнительных вариантах осуществления композиция согласно вариантам осуществления изобретения содержит от 1% до 10% (масс./масс.) указанного промежуточного препарата.

Предпочтительно композиция согласно вариантам осуществления изобретения предоставляется в герметичном или в герметично закрывающемся контейнере, содержащем примерно 50 г, 60 г, 70 г, 75 г, 80 г, 85 г, 90 г, 95 г, 100 г, 105 г, 110 г, 115 г, 120 г, 125 г, 130 г, 135 г, 140 г, 145 г, 150 г, 200 г, 300 г, 320 г или 500 г или примерно 1 унцию, 2 унции, 3 унции, 4 унций, 5 унций, 6 унций или 12 унций продукта по массе.

В некоторых вариантах осуществления композиция согласно вариантам осуществления изобретения предоставляется в герметичном или в герметично закрывающемся контейнере, содержащем примерно от 50 г до 500 г, от 60 г до 500 г, от 70 г до 500 г, от 75 г до 500 г, от 80 г до 500 г, от 85 г до 500 г, от 90 г до 500 г, от 95 г до 500 г, от 100 г до 500 г, от 105 г до 500 г, от 110 г до 500 г, от 115 г до 500 г, от 120 г до 500 г, от 125 г до 500 г, от 130 г до 500 г, от 135 г до 500 г, от 140 г до 500 г, от 145 г до 500 г, от 150 г до 500 г, от 200 г до 500 г, от 300 г до 500 г, от 320 г до 500 г или 500 г продукта по массе. В некоторых вариантах осуществления композиция согласно вариантам осуществления изобретения предоставляется в герметичном или герметично закрывающемся контейнере, содержащем от примерно 1 до 12 унций, от 2 до 12 унций, от 3 до 12 унций, от 4 до 12 унций, от 5 до 12 унций, от 6 унций до 12 унций или 12 унций продукта по массе.

Композиции инокулята

Штамм Streptococcus thermophilus по изобретению применим в качестве заквасочной культуры при приготовлении пищевых композиций, таких как ферментированные молочные продукты. Соответственно, в одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к инокуляту, содержащему штамм S. thermophilus, как определено выше, который подходит для приготовления ферментированных молочных продуктов. Инокулят по изобретению пригоден для прямой инокуляции штаммов S. thermophilus в композицию, содержащую молоко, для получения ферментированных молочных продуктов по изобретению, как правило, без необходимости стадии культивирования перед указанной прямой инокуляцией. В предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение относится к инокуляту, содержащему штамм S. thermophilus CNCM I-5448.

Обычно инокулят дополнительно содержит вспомогательное вещество или носители, выбор которых находится в компетенции специалиста, но может включать буферы или питательные среды. Инокулят может необязательно содержать дополнительные компоненты, такие как криопротекторы, консерванты и/или добавки, включая питательные вещества, такие как дрожжевые экстракты, цистеин, сахара и витамины.

Обычно инокулят используют при приготовлении ферментированных молочных продуктов, согласно одному варианту осуществления инокулят по изобретению можно вводить в молочную композицию в количествах примерно до 500 мг/л.

Обычно инокулят свежий, замороженный, высушенный или лиофилизированный. Инокулят может быть в жидкой, сухой, порошковой или твердой форме. Особенно предпочтительно, чтобы инокулят находился в жидкой форме. Инокулят можно разморозить и/или диспергировать в жидкости (например, в воде) перед инокуляцией в композицию, содержащую молоко.

В некоторых вариантах осуществления инокулят содержит по меньшей мере 10⁶ КОЕ, по меньшей мере 10⁷ КОЕ, по меньшей мере 10⁸ КОЕ, 10⁹ КОЕ, например по меньшей мере 10¹⁰ КОЕ, например, по меньшей мере 10¹¹ КОЕ S. thermophilus по изобретению на грамм композиции инокулята. В некоторых вариантах осуществления инокулят содержит от 10⁷ до 10¹² колониеобразующих единиц (КОЕ) или, более предпочтительно, от 10¹⁰ до 10¹² колониеобразующих единиц (КОЕ) штамма S. thermophilus по изобретению на грамм инокулята.

Предпочтительно инокулят, содержащий штамм S. thermophilus по изобретению, является по существу чистым.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к смеси или набору частей инокулята по изобретению вместе с инокулятом бифидобактерий и/или молочнокислых бактерий.

Примеры Bifidobacterium, которые можно использовать, включают, но не ограничиваются ими, Bifidobacterium animalis (например, Bifidobacterium animalis subsp. Animalis или Bifidobacterium animalis subsp. lactis); Bifidobacterium longum; Bifidobacterium breve; Bifidobacterium bifidum. Примеры молочнокислых бактерий, которые можно использовать, включают, но не ограничиваются ими, Lactobacilli (например, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus buchneri, Lactobacillus delbrueckii, в частности L. delbrueckii subsp. bulgaricus или lactis, Lactobacillus casei, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus brevis, Lactobacillus rhamnosus); Lactococci (например, Lactococcus lactis, обычно Lactococcus lactis subsp. lactis или Lactococcus lactis subsp. cremoris). Предпочтительно инокуляционная смесь дополнительно содержит Lactobacillus и/или Streptococcus. Для приготовления йогурта инокуляционная смесь обычно содержит Lactobacillus bulgaricus (также называемую Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus) и Streptococcus thermophilus, необязательно с дополнительными микроорганизмами, такими как, но не ограничиваясь ими, пробиотические виды или другие виды, например, Lactococcus lactis, которые могут придать композиции желаемые органолептические или другие качества.

Соответственно, в одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к инокулирующей смеси, содержащей инокулят Streptococcus thermophilus CNCM I-5448 и дополнительно содержащей по меньшей мере один инокулят Lactobacillus bulgaricus и необязательно один или более дополнительных инокулятов Lactococcus lactis и/или Bifidobacterium.

Способы приготовления кисломолочных продуктов

Штаммы S. thermophilus по изобретению пригодны для использования при приготовлении ферментированных молочных продуктов. Соответственно, аспект настоящего изобретения также относится к целевому применению этих штаммов, в частности Streptococcus thermophilus CNCM I-5448, для приготовления пищевой композиции, более конкретно для ферментации пищевого продукта.

Настоящее изобретение также относится к способу приготовления ферментированного молочного продукта, включающему инокуляцию композиции на основе молока штаммом S. thermophilus, как определено выше, и ферментацию.

Соответственно, в одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу, включающему следующие стадии:

i) предоставление смеси, содержащей:

a) молоко, и

b) штамм или инокулят S. thermophilus, как определено выше,

ii) ферментация указанной смеси с получением ферментированного молочного продукта.

В одном варианте осуществления смесь дополнительно содержит сахарозу. В предпочтительном варианте осуществления смесь содержит по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 10 или 20 масс.% сахарозы, предпочтительно 1-15 масс.%, более предпочтительно 2-10 масс.%. Особенно предпочтительно, чтобы содержание сахарозы в ферментированном молочном продукте, полученном на стадии ii), составляло по меньшей мере 90% или более, предпочтительно по меньшей мере 91%, 92% или 93% от содержания сахарозы в смеси на стадии i). Предпочтительно, чтобы указанное содержание сахарозы измеряли через 7 дней хранения при 4°С.

Предпочтительно ферментированные молочные продукты готовят с использованием молока, подвергнутого термической обработке, по меньшей мере эквивалентной пастеризации. Предпочтительно указанную термическую обработку проводят до приготовления композиции.

Как правило, молоко пастеризуют посредством следующих последовательных стадий:

1) стандартизация жировых веществ сырья с целью получения стандартизованного вещества,

2) обогащение сухим веществом стандартизованного вещества, полученного на предыдущей стадии, с целью получения обогащенного вещества,

3) предварительный нагрев обогащенного вещества, полученного на предыдущей стадии, для получения исходного вещества,

4) пастеризация и выдержка исходного вещества, полученного на предыдущей стадии, с получением пастеризованного и выдержанного вещества,

5) необязательная стадия гомогенизации пастеризованного и выдержанного вещества, полученного на предыдущей стадии, с целью получения пастеризованного, выдержанного и необязательно гомогенизированного вещества,

6) начальное охлаждение пастеризованного, выдержанного и необязательно гомогенизированного вещества, полученного на предыдущей стадии, с тем, чтобы получить пастеризованное исходное вещество, которое выдерживали, необязательно гомогенизировали и охлаждали.

Используемый в настоящем описании термин «стандартизация жировых веществ» означает стадию доведения количества жиров, присутствующих в исходном веществе, до заранее определенного уровня. Обогащение сухими веществами предполагает добавление белков и жировых веществ для модификации творожной консистенции.

Под выдержкой здесь понимается быстрый нагрев и поддержание температуры молока, что позволяет уничтожить вегетативную микробную флору, в том числе патогенные формы. Ее типичная продолжительность составляет от 4 до 10 минут, в частности от 5 до 8 минут и, в частности, приблизительно 6 минут.

Используемый в настоящем описании термин «гомогенизация» означает диспергирование жировых веществ в веществе молочного типа на маленькие жировые глобулы. Гомогенизацию проводят, например, при давлении от 100 до 280 бар, в частности от 100 до 250 бар, в частности от 100 до 200 бар, в частности примерно 200 бар. Эта стадия гомогенизации не является обязательной. В частности, она отсутствует в процессе производства продуктов с нулевым содержанием жиров.

Обычно ферментированный молочный продукт готовят путем культивирования молока при подходящей температуре с подходящими микроорганизмами для обеспечения снижения рН, предпочтительно до рН, равного или ниже 5, предпочтительно в диапазоне примерно 3 и 4,7; более предпочтительно в диапазоне от примерно 3,5 до примерно 4,7. рН можно регулировать, контролируя ферментацию микроорганизмом и останавливая ее при необходимости, например, путем охлаждения.

Согласно варианту осуществления способа приготовления ферментированного молочного продукта, как определено выше, смесь, содержащая молоко и S. thermophilus по изобретению, дополнительно содержит по меньшей мере один, два, три или более штаммов Bifidobacterium и/или молочнокислых бактерий. Выбор подходящих штаммов Bifidobacterium входит в компетенцию специалиста и обычно представляет собой пробиотические молочнокислые бактерии. Примеры Bifidobacterium, которые можно использовать, включают, но не ограничиваются ими, Bifidobacterium animalis (например, Bifidobacterium animalis subsp. Animalis или Bifidobacterium animalis subsp. lactis); Bifidobacterium longum; Bifidobacterium breve; Bifidobacterium bifidum.

Выбор подходящих штаммов молочнокислых бактерий входит в компетенцию специалиста в данной области и обычно представляет собой термофильные молочнокислые бактерии. Примеры молочнокислых бактерий, которые можно использовать, включают, но не ограничиваются ими, Lactobacilli (например, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus buchneri, Lactobacillus delbruckeii, в частности L. delbrueckii subsp. bulgaricus или lactis, Lactobacillus casei, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus brevis, Lactobacillus rhamnosus); Lactococci (например, Lactococcus lactis, обычно Lactococcus lactis subsp. lactis или Lactococcus lactis subsp. cremoris). Обычно можно использовать смесь или ассоциацию множества видов молочнокислых бактерий, как правило, смесь или ассоциацию Lactobacillus и Streptococcus. Для приготовления йогурта обычно используется Lactobacillus bulgaricus (также называемая Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus) и Streptococcus thermophilus, необязательно с дополнительными микроорганизмами, такими как, но не ограничиваясь ими, пробиотические виды или другие виды, например, Lactococcus lactis, которые могут придать композиции желаемые органолептические или другие качества.

Соответственно, в одном варианте осуществления смесь дополнительно содержит по меньшей мере один штамм Lactobacillus bulgaricus и необязательно один или более штаммов Lactococcus lactis и/или Bifidobacterium.

Подходящие температуры для ферментации молока обычно составляют от примерно 36°С до примерно 44°С, и эту температуру поддерживают в течение времени инкубации, достаточного для обеспечения желаемого снижения рН. Для приготовления ферментированного молочного продукта температура в начале ферментации обычно составляет от примерно 36°С до примерно 43°С, в частности, от примерно 37°С до примерно 40°С, температура в конце ферментации обычно составляет от примерно 37°С до примерно 44°С, в частности, от примерно 38°С до примерно 41°С. Время ферментации обычно составляет от примерно 6 до примерно 11 часов.

После ферментации кисломолочный продукт охлаждают. Необязательно может быть осуществлена стадия промежуточного охлаждения ферментированного молока для получения предварительно охлажденного ферментированного молока, имеющего температуру от примерно 22°С до примерно 4°С. Обычно время промежуточного охлаждения составляет от примерно 1 часа до примерно 4 часов, в частности, от примерно 1 часа 30 минут до примерно 2 часов. Предварительно охлажденное ферментированное молоко обычно хранится до 40 часов или меньше.

Предпочтительно стадию окончательного охлаждения ферментированного молока проводят таким образом, чтобы температура в начале окончательного охлаждения составляла менее примерно 22°С, а температура в конце окончательного охлаждения составляла от примерно 4°С до примерно 10°С. С. Затем охлажденный продукт можно хранить, транспортировать и/или распределять при температуре от примерно 1°С до примерно 10°С в течение по меньшей мере примерно 30 дней, по меньшей мере примерно 60 дней или по меньшей мере примерно 90 дней.

Особенно предпочтительно, чтобы количество сахарозы в ферментированном молочном продукте составляло по меньшей мере 90% или более, предпочтительно по меньшей мере 91%, 92% или 93% от содержания сахарозы в смеси продуктов перед ферментацией. Предпочтительно измерять указанную сахарозу через 7 дней хранения при 4°C. В соответствии с дополнительным вариантом осуществления способ приготовления ферментированного молочного продукта, как определено выше, необязательно включает стадию перемешивания при давлении по меньшей мере 20 бар, или выполнение динамического сглаживания для получения композиции, имеющей желаемую вязкость, обычно вязкость до 20 мПа⋅с. Операции перемешивания или динамического сглаживания придают композиции некоторый сдвиг, который обычно позволяет снизить вязкость. Такие операции известны специалистам в данной области, и их можно проводить с помощью обычного соответствующего оборудования. Эту стадию обычно проводят при низкой температуре, например, при температуре от 1°С до 20°С. Безотносительно к какой-либо теории считается, что приложение некоторого усилия сдвига при низкой температуре, как правило, путем перемешивания при высоком давлении или выполнения динамического сглаживания, может привести к образованию жидкого геля внутри композиции, что обеспечивает улучшенную стабильность даже при низкой вязкости до 20 мПа⋅с.

Альтернативно, в соответствии с дополнительным вариантом осуществления способ приготовления ферментированного молочного продукта, как определено выше, необязательно включает стадию удаления кислой сыворотки для получения «сцеженной ферментированной молочной композиции». На этой стадии кислая сывороточная композиция отделяется от творога, полученного в результате коагуляции белка вследствие подкисления во время ферментации. Таким образом, получают:

- ферментированный молочный продукт, обычно содержащий сгусток белков, называемый сцеженной ферментированной молочной композицией, и

- кислый побочный продукт молочной сыворотки

Такие стадии разделения известны специалистам в данной области техники, например, в процессах приготовления «греческих йогуртов». Разделение может осуществляться, например, обратным осмосом, ультрафильтрацией или центробежным разделением. Стадию разделения можно проводить, например, при температуре от 30°С до 45°С.

В соответствии с дополнительным вариантом осуществления способ приготовления ферментированного молочного продукта, как определено выше, необязательно включает стадию добавления промежуточного продукта, как описано выше, до или после ферментации, причем указанный промежуточный продукт обычно включает препарат из фруктов и/или злаки и/или добавки, такие как ароматизаторы и/или красители.

Изобретение будет дополнительно проиллюстрировано следующими неограничивающими фигурами и примерами.

Описание чертежей

Фиг. 1. Рост штамма дикого типа и клонов Gal+ от G9 до G16 в M17m с лактозой в качестве единственного источника углерода.

Фиг. 2. Рост штамма дикого типа и клонов Gal+ от G9 до G16 в M17m с галактозой в качестве единственного источника углерода.

Фиг. 3. Ферментация полуобезжиренного ультрапастеризованного молока штаммом дикого типа или клонами 1-13 с дефицитом сахарозы.

Фиг. 4. Рост штамма дикого типа и клонов 1-13 с дефицитом сахарозы в M17m с лактозой в качестве единственного источника углерода.

Фиг. 5. Рост штамма дикого типа и клонов 1-13 с дефицитом сахарозы в M17m с использованием сахарозы в качестве единственного источника углерода.

Фиг. 6. Ферментация полуобезжиренного ультрапастеризованного молока штаммом дикого типа, клоном 11 или клоном 11R15 (CNCM I-5448).

Фиг. 7. Сравнение геномов штамма дикого типа и клона G15. (A) Выравнивание последовательностей нуклеотидов lacS. (B) Выравнивание аминокислотных последовательностей LacS. (C) Выравнивание межгенной области между генами galR и galK. Точечная мутация обозначена прямоугольником. Сайт Cre в промоторе galK подчеркнут.

Фиг. 8. Сравнение геномов клона G15 и клона 11. (A) Выравнивание нуклеотидных последовательностей scrA. (B) Выравнивание аминокислотных последовательностей ScrA. Точечная мутация обозначена прямоугольником.

Фиг. 9. Сравнение геномов клона 11 и клона 11R15 (CNCM I-5448). (A) Выравнивание нуклеотидных последовательностей galR. (B) Выравнивание аминокислотных последовательностей GalR. Точечная мутация обозначена прямоугольником.

Примеры

Целью авторов изобретения было идентифицировать сахарозоотрицательный (Suc-) штамм S. thermophilus, подходящий для приготовления ферментированных молочных продуктов, таких как йогурт, причем указанный штамм является сахарозоотрицательным (Suc-) для обеспечения повышенной сладости в сахаросодержащих продуктах с минимальным подкислением.

Кроме того, требовалось, чтобы указанный штамм обладал структурообразующими свойствами (т. е. продуцировал EPS), и, кроме того, было предпочтительно, чтобы штамм был фруктозоотрицательным (Fru-), чтобы гарантировать повышенную сладость и снижение посткислотности в продуктах, содержащих фрукты.

Соответственно, авторы изобретения выполнили программу скрининга 655 штаммов S. thermophilus из коллекции культур Danone заявителя. Каждый штамм анализировали с использованием теста API 50CH через 48 часов после инкубации при 37°C с MRS API. Это позволило определить профиль ферментации галактозы, сахарозы и фруктозы.

Из всех протестированных штаммов 654 были Suc+, 13 - Gal+, 84 - Fru+. Все штаммы Gal+ (13) также были Fru+. Из всех протестированных штаммов Suc-Gal+ не был идентифицирован. Единственным идентифицированным штаммом Suc- был Glu+, Fru+, Lac+, Gal-.

I. Отбор варианта S. thermophilus Gal+

Штамм дикого типа (Wt) проявляет фенотип Lac+ Glu+ Suc+ Gal- Fru- и эффективно осуществляет ферментацию лактозы с высокими структурообразующими свойствами. Штамм дикого типа последовательно субкультивировали в модифицированной среде М17 (М17м, концентрация бета-глицерофосфата 9 г/л вместо 19 г/л в М17) в присутствии галактозы в качестве единственного источника углерода. После 12 пересевов некоторые клоны выделяли на чашках, содержащих галактозу М17м. Восемь клонов (от G9 до G16) выделяли и культивировали в галактозе M17m при концентрации 5 г/л.

Рост восьми отселектировнных клонов тестировали и контролировали с помощью Bioscreen C при длине волны 600 нм (Bioscreen C представляет собой спектрофотометр, позволяющий контролировать рост путем измерения оптической плотности при 600 нм в микропланшетах) в двух разных средах. Рост тестировали в присутствии (i) лактозы в качестве единственного источника углерода или (ii) галактозы в качестве единственного источника углерода. Предварительное культивирование проводили в M17m gal для колоний и в M17m lac для штамма дикого типа. Степень инокуляции составляла 1% от прекультур.

Штамм дикого типа и восемь выделенных клонов эффективно растут в среде, содержащей лактозу (Фиг. 1), тогда как в среде, содержащей галактозу, способны расти только восемь выделенных клонов (Фиг. 2).

Эти результаты показывают выделение вариантов Gal+ из штамма Gal-дикого типа.

Клон G15 был отобран потому, что он показал лучший рост как на галактозе, так и на лактозе.

II. Мутагенез варианта S. thermophilus Gal+

Ультрафиолетовый мутагенез проводили на Gal+ клоне G15, полученном из штамма дикого типа. Для мутагенеза использовали дозу УФ, дающую примерно 2% выживаемости.

Четыре тысячи клонов, полученных в результате мутагенеза, тестировали на их способность подкислять среду М17m в присутствии 5 г/л галактозы в качестве источника углерода и подкислять среду М17m в присутствии сахарозы в концентрации 5 г/л в качестве источника углерода. Фиолетовый бромкрезол использовали в качестве индикатора рН, который становится желтым в кислой среде и пурпурным в неинокулированной среде.

Тринадцать из 4000 протестированных клонов показали пониженную способность подкислять среду в присутствии сахарозы, сохраняя при этом хорошую подкисляемость в присутствии галактозы в качестве источника углерода.

III. Характеристика мутантов S. thermophilus Gal+ с дефицитом метаболизма сахарозы

13 клонов тестировали на полуобезжиренном ультрапастеризованном молоке с добавлением дрожжевого экстракта в концентрации 2 г/л. Молоко, обогащенное дрожжевым экстрактом, инокулировали в количестве 1% из прекультуры, приготовленной на полуобезжиренном ультрапастеризованном молоке, обогащенном дрожжевым экстрактом в количестве 2 г/л. Культуры инкубировали при 38°С, и ферментацию останавливали при рН 4,7 охлаждением до 4°С.

Ферментацию контролировали с помощью системы iCinac, которая позволяет постоянно получать значения pH. Все клоны показали сниженную способность подкислять молоко (Фиг. 3).

Способность клонов расти в среде, содержащей сахарозу в качестве источника углерода, также оценивали путем контроля оптической плотности при 600 нм с помощью Bioscreen C.

Мониторинг роста проводили в присутствии (i) лактозы в качестве единственного источника углерода или (ii) сахарозы в качестве единственного источника углерода. Предварительное культивирование проводили в M17m gal для колоний и в M17m Lac для штамма дикого типа. Степень инокуляции составляла 1% от прекультур.

В присутствии лактозы все клоны были способны расти (Фиг. 4). В присутствии сахарозы рост большинства клонов был снижен по сравнению с ростом штамма дикого типа, но только клон 11 показал неспособность расти в присутствии сахарозы (Фиг. 5).

Эти результаты показывают успешное выделение Suc-клона из варианта Gal+.

IV. Улучшение роста штамма Gal+ Suc- в молоке.

Клон 11 демонстрировал явный фенотип Suc-, но также продемонстрировал снижение ферментативной активности молока. Для восстановления эффективности, аналогичной эффективности штамма дикого типа, было проведено 15 последовательных субкультивирований в полуобезжиренном ультрапастеризованном молоке с добавлением дрожжевого экстракта в количестве 2 г/л. Клон 11R15 был получен и впоследствии депонирован как штамм CNCM I-5448, как описано выше. Ферментацию со штаммом дикого типа, клоном 11 или клоном 11R15 в ультрапастеризованном полуобезжиренном молоке с 2 г/л дрожжевого экстракта измеряли с помощью системы iCinac.

Клон 11R15 (CNCM I-5448) продемонстрировал способность подкислять молоко лучше, чем у клона 11, и аналогичную способности штамма дикого типа (Фиг. 6).

Эти результаты показывают выделение варианта Suc- с такой же эффективностью ферментации молока, как и у штамма дикого типа.

V. Характеристика клона 11R15 (CNCM I-5448)

V.1. Дозировка сахарозы

Смеси готовили на ультрапастеризованном полуобезжиренном молоке с 2 г/л дрожжевого экстракта и 55 г/л сахарозы и инокулировали клоном 11R15 или штаммом дикого типа, ферментацию проводили при 38°С и прекращали при рН 4,7 быстрым охлаждением.

В качестве контроля готовили неферментированный кислый (рН 4,7) молочный продукт (без штаммов) с использованием ультрапастеризованного полуобезжиренного молока с 2 г/л дрожжевого экстракта и 55 г/л сахарозы и глюконо-дельта-лактона (GDL) 1,5% масс./масс. в качестве подкислителя. Указанный контрольный продукт нагревали до 38°C в течение 4 часов для обеспечения сопоставимости с тестируемыми продуктами.

Продукты хранили 7 суток при 4°С, затем продукты центрифугировали при 5000 g в течение 5 минут при 4°С. Определение сахарозы в супернатантах анализировали на 3 образцах в 2 экспериментах с использованием набора для анализа глюкозы-фруктозы-сахарозв от Biosentec. Результаты приведены в таблице 1.

Таблица 1 Уровень сахарозы в продуктах после ферментации штаммом дикого типа или клоном 11R15 (CNCM I-5448) Первый эксперимент Стандартное отклонение Второй эксперимент Стандартное отклонение Дикий тип 47,7 г/л 1,77 44,1 г/л 2,36 клон 11R15(CNCM I-5448) 52,9 г/л 2 53 г/л 2,15 GDL 1,5% контроль 55,46 г/л 1,22 52,16 г/л 1,09

В первом эксперименте продукт, ферментированный штаммом дикого типа, потерял 7,3±1,8 г, тогда как продукт, ферментированный штаммом 11R15, потерял только 2,1±1,8 г. Во втором эксперименте продукт, ферментированный штаммом дикого типа, потерял 10,9±2 г, тогда как продукт, ферментированный штаммом 11R15, потерял только 2±2,1 г.

Эти результаты показывают, что клон 11R15 (CNCM I-5448) способен достигать ферментации при значительном сохранении уровня сахарозы в ингредиентах, в отличие от штамма дикого типа. Небольшое снижение содержания сахарозы во время ферментации можно с полным основанием отнести к присущей ей деградации сахарозы при кислом pH, поскольку оно сравнимо с таковым в контроле GDL во втором эксперименте.

V.2. Вязкость

Смеси готовили с использованием ультрапастеризованного полуобезжиренного молока с 2 г/л дрожжевого экстракта и 55 г/л сахарозы и инокулировали клоном 11R15, клоном 11 или штаммом дикого типа. Ферментацию проводили при 38°С и прекращали при рН 4,7 путем быстрого охлаждения. Продукты хранили в течение 7 суток при 4°С, затем измеряли вязкость путем измерения напряжения сдвига.

Этот метод заключается в определении вязкости продуктов после ручного перемешивания и инкубации в течение 30 минут при 4°С. Проводили три измерения при 4°С с использованием трех сосудов с молоком, ферментированным одним и тем же штаммом и в одних и тех же условиях. Прибор, использованный для этого анализа, представлял собой охлаждаемый реометр MCR301, оснащенный системой концентрических цилиндров диаметром 27 мм. Эта вращающаяся система позволяет наблюдать деструктуризацию продукта в зависимости от линейного градиента сдвига, то есть напряжения при заданном градиенте. Результаты получают в виде непрерывной кривой расхода с возрастающей и убывающей скоростью изменения от 0 до 20 с^-1. Продукт подвергается возрастающему градиенту сдвига от 0 до 20 с^-1 в течение 1 минуты. Эта фаза соответствует восходящей скорости изменения. Затем он подвергается уменьшающемуся градиенту сдвига от 20 до 0 с^-1 в течение 1 минуты, что соответствует нисходящей скорости изменения.

Каждая нисходящая кривая затем моделируется в соответствии с моделью Кэссона (уравнение I).

Вязкость продуктов через 7 суток хранения при 4°С приведена в Таблице 2.

Таблица 2. Вязкость продуктов, ферментированных штаммом дикого типа, клоном 11 или клоном 11R15 Вязкость Стандартное отклонение Дикий тип 1116 мПа.с 76 Клон 11 557 мПа.с 36 Клон 11R15 1143 мПа.с 42

Эти результаты показывают, что клон 11R15 (CNCM I-5448) имеет сходные текстурирующие свойства по сравнению со штаммом дикого типа.

V.3. Тест API (аналитический индекс профилей)

Профиль ферментации клона 11R15 (CNCM I-5448) получали путем проведения теста API 50CH через 48 часов после инкубации при 37°C с MRS API. Это позволило определить профиль ферментации галактозы, сахарозы и фруктозы.

Клон 11R15 (CNCM I-5448) является галактозоположительным (Gal+), сахарозоотрицательным (Suc-), фруктозоотрицательным (Fru-), лактозоположительным (Lac+), глюкозоположительным (Glu+), как определено с помощью указанного теста, и, кроме того, является высокоферментативным. и текстурирование (в значительной степени производящим EPS).

VI. Геномные сравнения вариантов S. thermophilus

Полные геномы дикого штамма S. thermophilus и его вариантов, т. е. клона G15, клона 11 и клона 11R15, секвенировали с помощью NGS с использованием системы Illumina NovaSeq6000.

Геномные последовательности всех вариантов сравнивали друг с другом, чтобы идентифицировать мутации, связанные с конкретными фенотипами, которые постепенно появлялись до выделения клона 11R15 (CNCM I-5448).

VI.1. Gal+ фенотип

Сравнение генома штамма дикого типа с геномом клона G15 показало, что с фенотипом Gal+ связаны мутация в гене lacS и мутация в межгенной области между galR и galK.

В частности, авторы изобретения отметили замену C/A в гене lacS в положении 1159 SEQ ID NO: 1 (Фиг. 7A), что приводит к замене пролина треонином в положении 387 белка LacS SEQ ID. NO: 3 (Фиг. 7B) и замену G/T в промоторе galK в положении 228 SEQ ID NO: 5 (Фиг. 7C).

VI.2. Suc- фенотип

Сравнение генома клона G15 с геномом клона 11 показало, что несмысловая мутация в гене scrA ассоциирована с Suc-фенотипом.

В частности, авторы изобретения отметили несмысловую замену C/T в гене scrA в положении 1393 SEQ ID NO: 7 (Фиг. 8A), которая приводит к остановке белка ScrA в положении 465 SEQ ID NO: 9 (Фиг. 8В).

VI.2. Быстрый рост в молоке

Сравнение генома клона 11 с геномом клона 11R15 (CNCM I-5448) показало, что мутация в гене galR связана с улучшением роста штамма в молоке.

В частности, авторы изобретения отметили замену T/C в гене galR в положении 281 SEQ ID NO: 11 (Фиг. 9A), которая приводит к замене лейцина пролином в белке GalR в положении 94 SEQ ID NO: 13 (Фиг. 9В).

Мутации суммированы в Таблице 3 в порядке появления.

Таблица 3. Краткое изложение пошаговых мутаций между вариантами S. thermophilus Мутация Штамм дикого типа Клон G15
Gal+ клон 11
Gal+
Suc- клон 11R15
(CNCM I-5448)
Gal+
Suc-
Быстрый рост в молоке lacS
Замена C/A (P T) Нет Да да Да Межгенная область между galR и galK
Замена G/T
в galK промоторе(cre-сайт) Нет Да да Да scrA
Замена C/T
(несмысловая мутация) Нет Нет да Да galR
Замена T/C (L→P) Нет Нет Нет Да

--->

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> COMPAGNIE GERVAIS DANONE

<120> САХАРОЗООТРИЦАТЕЛЬНЫЙ ШТАММ

STREPTOCOCCUS THERMOPHILUS ДЛЯ ПРИМЕНЕНИЯ

В ПРИГОТОВЛЕНИИ ФЕРМЕНТИРОВАННЫХ ПРОДУКТОВ

<130> PAT2598515PC00

<150> EP19306785

<151> 2019-12-30

<160> 15

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1905

<212> ДНК

<213> Streptococcus thermophilus дикого типа

<400> 1

atggaaaaat ctaaaggtca gatgaagtct cgtttatcct acgcagctgg tgcttttggt 60

aacgacgtct tctatgcaac cttgtcaaca tactttatca tgtttgtgac aactcacttg 120

tttaacacag gtgatccaaa gcaaaatagt cactacgtac tattaatcac taacattatc 180

tctattttgc gtatcttgga agtatttatc gatccattga tcggtaatat gattgataac 240

actaatacta agtatggtaa attcaaacca tgggtagttg gtggtggtat catcagttct 300

atcaccttgt tgcttctctt caccgattta ggtggtttga ataaaacaaa tcctttcttg 360

taccttgtac tttttggaat tatctacctt gtaatggatg tcttctactc gattaaagat 420

atcggtttct ggtcaatgat tcctgccttg tctcttgata gtcacgaacg tgaaaaaatg 480

gcaacttttg cccgtattgg ttctacgatt ggtgccaata ttgtaggtgt tgccatcatg 540

ccaatcgttt tgttcttctc tatgacgaac aatagtggct ctggagataa atctggatgg 600

ttctggtttg catttatcgt tgctctcatt ggtgtgatta catcaattgc tgttggtatt 660

ggtacacgtg aagttgagtc aaaaattcgt gataataacg aaaaaactag ccttaaacaa 720

gtctttaagg ttcttggtca aaacgaccaa ttgatgtggt tatctcttgg atattggttc 780

tatggtcttg gtattaatac acttaatact cttcaacttt attatttcac atttatcctt 840

ggtgattcag gtaaatactc aattctttac ggattgaata cagttgttgg tttggtttca 900

gtttcactct tccctaccct agctgataaa ttcaaccgta aacgtttgtt ctacggatgt 960

attgcagtaa tgctcggggg tatcggaata tttagtattg caggtacatc acttccaata 1020

atcttgactg cagctgaact cttcttcatt ccacaacctc ttgtgttcct tgttgtcttt 1080

atgattatct ctgactcagt agaatatggt caatggaaaa cgggacaccg tgatgaatca 1140

cttactttgt cagttcgtcc acttattgat aaacttggtg gtgcgatgtc aaactggctt 1200

gtttctacat ttgccatagc tgccggtatg acaacaggtg cctcagcatc aacaattaca 1260

acacatcaac agtttatctt taagcttggc atgtttgctt tcccagcagc aacaatgctt 1320

atcggtgcct tcattgttgc tcgtaaaatc actttgactg aagcacgtca cgctaaaatt 1380

gttgaagaat tggaacatcg ctttagcgta gcaacttctg aaaatgaagt taaagctaac 1440

gtcgtatctc ttgtaacccc tacaactggt tatttggttg atctctcaag tgttaatgat 1500

gaacactttg cttcaggtag catgggtaaa ggtttcgcca ttaaacctac tgatggagct 1560

gtctttgcac caattagtgg taccattcgt caaattcttc ctactcgcca tgcagttggt 1620

attgaaagtg aagatggtgt cattgttctt atccacgttg gcatcggaac agttaaactt 1680

aatggtgaag gattcattag ttacgtagaa caaggtgatc atgttgaagt tggacaaaaa 1740

cttcttgagt tctggtcacc aattattgag aaaaatggtc ttgatgacac agtacttgtc 1800

actgtaacta attcagaaaa attcagtgct ttccatcttg aacaaaaagt tggagaaaag 1860

gtagaagctt tgtctgaagt tattaccttc aaaaaaggag aataa 1905

<210> 2

<211> 1905

<212> ДНК

<213> Streptococcus thermophilus G15

<400> 2

atggaaaaat ctaaaggtca gatgaagtct cgtttatcct acgcagctgg tgcttttggt 60

aacgacgtct tctatgcaac cttgtcaaca tactttatca tgtttgtgac aactcacttg 120

tttaacacag gtgatccaaa gcaaaatagt cactacgtac tattaatcac taacattatc 180

tctattttgc gtatcttgga agtatttatc gatccattga tcggtaatat gattgataac 240

actaatacta agtatggtaa attcaaacca tgggtagttg gtggtggtat catcagttct 300

atcaccttgt tgcttctctt caccgattta ggtggtttga ataaaacaaa tcctttcttg 360

taccttgtac tttttggaat tatctacctt gtaatggatg tcttctactc gattaaagat 420

atcggtttct ggtcaatgat tcctgccttg tctcttgata gtcacgaacg tgaaaaaatg 480

gcaacttttg cccgtattgg ttctacgatt ggtgccaata ttgtaggtgt tgccatcatg 540

ccaatcgttt tgttcttctc tatgacgaac aatagtggct ctggagataa atctggatgg 600

ttctggtttg catttatcgt tgctctcatt ggtgtgatta catcaattgc tgttggtatt 660

ggtacacgtg aagttgagtc aaaaattcgt gataataacg aaaaaactag ccttaaacaa 720

gtctttaagg ttcttggtca aaacgaccaa ttgatgtggt tatctcttgg atattggttc 780

tatggtcttg gtattaatac acttaatact cttcaacttt attatttcac atttatcctt 840

ggtgattcag gtaaatactc aattctttac ggattgaata cagttgttgg tttggtttca 900

gtttcactct tccctaccct agctgataaa ttcaaccgta aacgtttgtt ctacggatgt 960

attgcagtaa tgctcggggg tatcggaata tttagtattg caggtacatc acttccaata 1020

atcttgactg cagctgaact cttcttcatt ccacaacctc ttgtgttcct tgttgtcttt 1080

atgattatct ctgactcagt agaatatggt caatggaaaa cgggacaccg tgatgaatca 1140

cttactttgt cagttcgtac acttattgat aaacttggtg gtgcgatgtc aaactggctt 1200

gtttctacat ttgccatagc tgccggtatg acaacaggtg cctcagcatc aacaattaca 1260

acacatcaac agtttatctt taagcttggc atgtttgctt tcccagcagc aacaatgctt 1320

atcggtgcct tcattgttgc tcgtaaaatc actttgactg aagcacgtca cgctaaaatt 1380

gttgaagaat tggaacatcg ctttagcgta gcaacttctg aaaatgaagt taaagctaac 1440

gtcgtatctc ttgtaacccc tacaactggt tatttggttg atctctcaag tgttaatgat 1500

gaacactttg cttcaggtag catgggtaaa ggtttcgcca ttaaacctac tgatggagct 1560

gtctttgcac caattagtgg taccattcgt caaattcttc ctactcgcca tgcagttggt 1620

attgaaagtg aagatggtgt cattgttctt atccacgttg gcatcggaac agttaaactt 1680

aatggtgaag gattcattag ttacgtagaa caaggtgatc atgttgaagt tggacaaaaa 1740

cttcttgagt tctggtcacc aattattgag aaaaatggtc ttgatgacac agtacttgtc 1800

actgtaacta attcagaaaa attcagtgct ttccatcttg aacaaaaagt tggagaaaag 1860

gtagaagctt tgtctgaagt tattaccttc aaaaaaggag aataa 1905

<210> 3

<211> 634

<212> белок

<213> Streptococcus thermophilus дикого типа

<400> 3

Met Glu Lys Ser Lys Gly Gln Met Lys Ser Arg Leu Ser Tyr Ala Ala

1 5 10 15

Gly Ala Phe Gly Asn Asp Val Phe Tyr Ala Thr Leu Ser Thr Tyr Phe

20 25 30

Ile Met Phe Val Thr Thr His Leu Phe Asn Thr Gly Asp Pro Lys Gln

35 40 45

Asn Ser His Tyr Val Leu Leu Ile Thr Asn Ile Ile Ser Ile Leu Arg

50 55 60

Ile Leu Glu Val Phe Ile Asp Pro Leu Ile Gly Asn Met Ile Asp Asn

65 70 75 80

Thr Asn Thr Lys Tyr Gly Lys Phe Lys Pro Trp Val Val Gly Gly Gly

85 90 95

Ile Ile Ser Ser Ile Thr Leu Leu Leu Leu Phe Thr Asp Leu Gly Gly

100 105 110

Leu Asn Lys Thr Asn Pro Phe Leu Tyr Leu Val Leu Phe Gly Ile Ile

115 120 125

Tyr Leu Val Met Asp Val Phe Tyr Ser Ile Lys Asp Ile Gly Phe Trp

130 135 140

Ser Met Ile Pro Ala Leu Ser Leu Asp Ser His Glu Arg Glu Lys Met

145 150 155 160

Ala Thr Phe Ala Arg Ile Gly Ser Thr Ile Gly Ala Asn Ile Val Gly

165 170 175

Val Ala Ile Met Pro Ile Val Leu Phe Phe Ser Met Thr Asn Asn Ser

180 185 190

Gly Ser Gly Asp Lys Ser Gly Trp Phe Trp Phe Ala Phe Ile Val Ala

195 200 205

Leu Ile Gly Val Ile Thr Ser Ile Ala Val Gly Ile Gly Thr Arg Glu

210 215 220

Val Glu Ser Lys Ile Arg Asp Asn Asn Glu Lys Thr Ser Leu Lys Gln

225 230 235 240

Val Phe Lys Val Leu Gly Gln Asn Asp Gln Leu Met Trp Leu Ser Leu

245 250 255

Gly Tyr Trp Phe Tyr Gly Leu Gly Ile Asn Thr Leu Asn Thr Leu Gln

260 265 270

Leu Tyr Tyr Phe Thr Phe Ile Leu Gly Asp Ser Gly Lys Tyr Ser Ile

275 280 285

Leu Tyr Gly Leu Asn Thr Val Val Gly Leu Val Ser Val Ser Leu Phe

290 295 300

Pro Thr Leu Ala Asp Lys Phe Asn Arg Lys Arg Leu Phe Tyr Gly Cys

305 310 315 320

Ile Ala Val Met Leu Gly Gly Ile Gly Ile Phe Ser Ile Ala Gly Thr

325 330 335

Ser Leu Pro Ile Ile Leu Thr Ala Ala Glu Leu Phe Phe Ile Pro Gln

340 345 350

Pro Leu Val Phe Leu Val Val Phe Met Ile Ile Ser Asp Ser Val Glu

355 360 365

Tyr Gly Gln Trp Lys Thr Gly His Arg Asp Glu Ser Leu Thr Leu Ser

370 375 380

Val Arg Pro Leu Ile Asp Lys Leu Gly Gly Ala Met Ser Asn Trp Leu

385 390 395 400

Val Ser Thr Phe Ala Ile Ala Ala Gly Met Thr Thr Gly Ala Ser Ala

405 410 415

Ser Thr Ile Thr Thr His Gln Gln Phe Ile Phe Lys Leu Gly Met Phe

420 425 430

Ala Phe Pro Ala Ala Thr Met Leu Ile Gly Ala Phe Ile Val Ala Arg

435 440 445

Lys Ile Thr Leu Thr Glu Ala Arg His Ala Lys Ile Val Glu Glu Leu

450 455 460

Glu His Arg Phe Ser Val Ala Thr Ser Glu Asn Glu Val Lys Ala Asn

465 470 475 480

Val Val Ser Leu Val Thr Pro Thr Thr Gly Tyr Leu Val Asp Leu Ser

485 490 495

Ser Val Asn Asp Glu His Phe Ala Ser Gly Ser Met Gly Lys Gly Phe

500 505 510

Ala Ile Lys Pro Thr Asp Gly Ala Val Phe Ala Pro Ile Ser Gly Thr

515 520 525

Ile Arg Gln Ile Leu Pro Thr Arg His Ala Val Gly Ile Glu Ser Glu

530 535 540

Asp Gly Val Ile Val Leu Ile His Val Gly Ile Gly Thr Val Lys Leu

545 550 555 560

Asn Gly Glu Gly Phe Ile Ser Tyr Val Glu Gln Gly Asp His Val Glu

565 570 575

Val Gly Gln Lys Leu Leu Glu Phe Trp Ser Pro Ile Ile Glu Lys Asn

580 585 590

Gly Leu Asp Asp Thr Val Leu Val Thr Val Thr Asn Ser Glu Lys Phe

595 600 605

Ser Ala Phe His Leu Glu Gln Lys Val Gly Glu Lys Val Glu Ala Leu

610 615 620

Ser Glu Val Ile Thr Phe Lys Lys Gly Glu

625 630

<210> 4

<211> 634

<212> белок

<213> Streptococcus thermophilus G15

<400> 4

Met Glu Lys Ser Lys Gly Gln Met Lys Ser Arg Leu Ser Tyr Ala Ala

1 5 10 15

Gly Ala Phe Gly Asn Asp Val Phe Tyr Ala Thr Leu Ser Thr Tyr Phe

20 25 30

Ile Met Phe Val Thr Thr His Leu Phe Asn Thr Gly Asp Pro Lys Gln

35 40 45

Asn Ser His Tyr Val Leu Leu Ile Thr Asn Ile Ile Ser Ile Leu Arg

50 55 60

Ile Leu Glu Val Phe Ile Asp Pro Leu Ile Gly Asn Met Ile Asp Asn

65 70 75 80

Thr Asn Thr Lys Tyr Gly Lys Phe Lys Pro Trp Val Val Gly Gly Gly

85 90 95

Ile Ile Ser Ser Ile Thr Leu Leu Leu Leu Phe Thr Asp Leu Gly Gly

100 105 110

Leu Asn Lys Thr Asn Pro Phe Leu Tyr Leu Val Leu Phe Gly Ile Ile

115 120 125

Tyr Leu Val Met Asp Val Phe Tyr Ser Ile Lys Asp Ile Gly Phe Trp

130 135 140

Ser Met Ile Pro Ala Leu Ser Leu Asp Ser His Glu Arg Glu Lys Met

145 150 155 160

Ala Thr Phe Ala Arg Ile Gly Ser Thr Ile Gly Ala Asn Ile Val Gly

165 170 175

Val Ala Ile Met Pro Ile Val Leu Phe Phe Ser Met Thr Asn Asn Ser

180 185 190

Gly Ser Gly Asp Lys Ser Gly Trp Phe Trp Phe Ala Phe Ile Val Ala

195 200 205

Leu Ile Gly Val Ile Thr Ser Ile Ala Val Gly Ile Gly Thr Arg Glu

210 215 220

Val Glu Ser Lys Ile Arg Asp Asn Asn Glu Lys Thr Ser Leu Lys Gln

225 230 235 240

Val Phe Lys Val Leu Gly Gln Asn Asp Gln Leu Met Trp Leu Ser Leu

245 250 255

Gly Tyr Trp Phe Tyr Gly Leu Gly Ile Asn Thr Leu Asn Thr Leu Gln

260 265 270

Leu Tyr Tyr Phe Thr Phe Ile Leu Gly Asp Ser Gly Lys Tyr Ser Ile

275 280 285

Leu Tyr Gly Leu Asn Thr Val Val Gly Leu Val Ser Val Ser Leu Phe

290 295 300

Pro Thr Leu Ala Asp Lys Phe Asn Arg Lys Arg Leu Phe Tyr Gly Cys

305 310 315 320

Ile Ala Val Met Leu Gly Gly Ile Gly Ile Phe Ser Ile Ala Gly Thr

325 330 335

Ser Leu Pro Ile Ile Leu Thr Ala Ala Glu Leu Phe Phe Ile Pro Gln

340 345 350

Pro Leu Val Phe Leu Val Val Phe Met Ile Ile Ser Asp Ser Val Glu

355 360 365

Tyr Gly Gln Trp Lys Thr Gly His Arg Asp Glu Ser Leu Thr Leu Ser

370 375 380

Val Arg Thr Leu Ile Asp Lys Leu Gly Gly Ala Met Ser Asn Trp Leu

385 390 395 400

Val Ser Thr Phe Ala Ile Ala Ala Gly Met Thr Thr Gly Ala Ser Ala

405 410 415

Ser Thr Ile Thr Thr His Gln Gln Phe Ile Phe Lys Leu Gly Met Phe

420 425 430

Ala Phe Pro Ala Ala Thr Met Leu Ile Gly Ala Phe Ile Val Ala Arg

435 440 445

Lys Ile Thr Leu Thr Glu Ala Arg His Ala Lys Ile Val Glu Glu Leu

450 455 460

Glu His Arg Phe Ser Val Ala Thr Ser Glu Asn Glu Val Lys Ala Asn

465 470 475 480

Val Val Ser Leu Val Thr Pro Thr Thr Gly Tyr Leu Val Asp Leu Ser

485 490 495

Ser Val Asn Asp Glu His Phe Ala Ser Gly Ser Met Gly Lys Gly Phe

500 505 510

Ala Ile Lys Pro Thr Asp Gly Ala Val Phe Ala Pro Ile Ser Gly Thr

515 520 525

Ile Arg Gln Ile Leu Pro Thr Arg His Ala Val Gly Ile Glu Ser Glu

530 535 540

Asp Gly Val Ile Val Leu Ile His Val Gly Ile Gly Thr Val Lys Leu

545 550 555 560

Asn Gly Glu Gly Phe Ile Ser Tyr Val Glu Gln Gly Asp His Val Glu

565 570 575

Val Gly Gln Lys Leu Leu Glu Phe Trp Ser Pro Ile Ile Glu Lys Asn

580 585 590

Gly Leu Asp Asp Thr Val Leu Val Thr Val Thr Asn Ser Glu Lys Phe

595 600 605

Ser Ala Phe His Leu Glu Gln Lys Val Gly Glu Lys Val Glu Ala Leu

610 615 620

Ser Glu Val Ile Thr Phe Lys Lys Gly Glu

625 630

<210> 5

<211> 300

<212> ДНК

<213> Streptococcus thermophilus дикого типа

<400> 5

tcatcagcga tagttaatat ccgatgtcta gtatcctctg ttacggaaag agtttcatct 60

ttattaagaa cacgtgaaac agttgaaata gatacacctg ctaattttgc gatatctgct 120

aatgtagcca tagtatcctc ctcatatttc agtataacat aacttttatt tttttaccta 180

tattttacta aaaaaatagt aaaaatattg attttccatg tgaaaggggt tacgatttca 240

gtataaacaa aaagaataag tgagatacat cctatgaata catcacagtt aagagaaaag 300

<210> 6

<211> 300

<212> ДНК

<213> Streptococcus thermophilus G15

<400> 6

tcatcagcga tagttaatat ccgatgtcta gtatcctctg ttacggaaag agtttcatct 60

ttattaagaa cacgtgaaac agttgaaata gatacacctg ctaattttgc gatatctgct 120

aatgtagcca tagtatcctc ctcatatttc agtataacat aacttttatt tttttaccta 180

tattttacta aaaaaatagt aaaaatattg attttccatg tgaaaggtgt tacgatttca 240

gtataaacaa aaagaataag tgagatacat cctatgaata catcacagtt aagagaaaag 300

<210> 7

<211> 1902

<212> ДНК

<213> Streptococcus thermophilus G15

<400> 7

atggattaca aacaaattgc aaaagaagtc atcgaagccc tcggtggacg tgaaaatgtt 60

aacagtgttg ctcactgtgc gacacgtcta cgtgttatgg ttaaagatga aaacaaaatc 120

aataaagaaa aagctgagaa tattgaaaaa gttcaaggtg ctttctttaa ctcaggtcaa 180

taccaaatga tctttggtac aggtactgtt aacaagattt acgacgaagt cgttgctcaa 240

ggtcttccaa cagcatctaa agacgaacaa aaagcagaag ctgctaaaca agggaactgg 300

ttccaacgtg ccatccgttc attcggtgac gttttcgttc cattgcttcc agctatcgta 360

gcgactggtc ttttcatggg tatccgtgga gccatcaata atgatacagt tcttgctctt 420

tttggtacaa catctaaagc cttcgctgct actgatttct acacttatac agttgtattg 480

acagatacag cctttgcctt cttcccagcc ttgatctgtt ggtcagcctt taacgttttc 540

ggtggttcac cacttcttgg tttggttctt ggtttgatga tggttaacaa tgctcttcca 600

aatgcttggg atgttgtatc aggtgctgca aaaccaattt acttctttga ctttattcca 660

gtagttggtt accaaaactc agtccttcca gccttcttcg taggtttgat tggtgctaag 720

tttgaacaat gggttcgtaa atgggttcca gatattcttg accttctctt gcgtccactt 780

gttgtctttg ctgtgatgtc agctttggcc ctctttatca ttggtcctgt cttccacaca 840

gttgagagct acgtacttgc tggtacagag tggattcttg ccttgccatt tggtcttgca 900

ggtcttgttc taggtggtat tcaccaaatt atcgtcgtta caggggttca ccacgttttc 960

aacttgcttg aagctaacct tatttctaat acaggtaaag acccacttaa cgctatcatc 1020

acagctgcga tgactgctca agctggtgca acacttgctg ttggtgttaa aactaaagac 1080

tctaagttga aagctctcgc tttccctgca agtctttcag cagtacttgg tatcactgaa 1140

ccagctatct tcggggttaa ccttcgtttc ggtaaaccat ttatcatggg tcttatcgct 1200

ggtgctgctg gtggttggtt ggcatcaatc cttaaccttg ctggtacagg atttggtgta 1260

acaatcgttc ctggtactct tctctaccta aatggtcaag tacttaagta tgtaatcatg 1320

gtacttgtaa cacttgctct tggtttcgct cttacttgga tctttggata taaagaggaa 1380

gaggttgaag ctcaaacaga agttgttgct gaagatatcg cctcagcagg ttctgctcca 1440

gttgcattgc aagctgaaac aattgctgca ccacttaaag gtgaagttgt agctttggaa 1500

aatgtaaatg acccagtctt ctcttcagga gctatgggta aaggtgccgc tatcaaacct 1560

tcaggtaacc gagttgttgc accatttgat ggtgaagtgc aaattgcctt cccaacaggt 1620

cacgcttacg gtcttaaatc tgataaaggt gctgaagtgc ttatccacat cggtatcgat 1680

actgtctcac ttgacggtaa aggatttgat gctaaggttc aagcaaatca acgtgttaaa 1740

aaaggtgatg tcttggctac cttcgatagc tcagttatca ctgaagcagg tcttgacgat 1800

acaactatgg ttatcgttac aaacactgca gactacgaag atgtttcatc agtagcaact 1860

ggttcagttg ctgagggtga tgacttcatc gcagttaaat aa 1902

<210> 8

<211> 1902

<212> ДНК

<213> Streptococcus thermophilus клон 11

<400> 8

atggattaca aacaaattgc aaaagaagtc atcgaagccc tcggtggacg tgaaaatgtt 60

aacagtgttg ctcactgtgc gacacgtcta cgtgttatgg ttaaagatga aaacaaaatc 120

aataaagaaa aagctgagaa tattgaaaaa gttcaaggtg ctttctttaa ctcaggtcaa 180

taccaaatga tctttggtac aggtactgtt aacaagattt acgacgaagt cgttgctcaa 240

ggtcttccaa cagcatctaa agacgaacaa aaagcagaag ctgctaaaca agggaactgg 300

ttccaacgtg ccatccgttc attcggtgac gttttcgttc cattgcttcc agctatcgta 360

gcgactggtc ttttcatggg tatccgtgga gccatcaata atgatacagt tcttgctctt 420

tttggtacaa catctaaagc cttcgctgct actgatttct acacttatac agttgtattg 480

acagatacag cctttgcctt cttcccagcc ttgatctgtt ggtcagcctt taacgttttc 540

ggtggttcac cacttcttgg tttggttctt ggtttgatga tggttaacaa tgctcttcca 600

aatgcttggg atgttgtatc aggtgctgca aaaccaattt acttctttga ctttattcca 660

gtagttggtt accaaaactc agtccttcca gccttcttcg taggtttgat tggtgctaag 720

tttgaacaat gggttcgtaa atgggttcca gatattcttg accttctctt gcgtccactt 780

gttgtctttg ctgtgatgtc agctttggcc ctctttatca ttggtcctgt cttccacaca 840

gttgagagct acgtacttgc tggtacagag tggattcttg ccttgccatt tggtcttgca 900

ggtcttgttc taggtggtat tcaccaaatt atcgtcgtta caggggttca ccacgttttc 960

aacttgcttg aagctaacct tatttctaat acaggtaaag acccacttaa cgctatcatc 1020

acagctgcga tgactgctca agctggtgca acacttgctg ttggtgttaa aactaaagac 1080

tctaagttga aagctctcgc tttccctgca agtctttcag cagtacttgg tatcactgaa 1140

ccagctatct tcggggttaa ccttcgtttc ggtaaaccat ttatcatggg tcttatcgct 1200

ggtgctgctg gtggttggtt ggcatcaatc cttaaccttg ctggtacagg atttggtgta 1260

acaatcgttc ctggtactct tctctaccta aatggtcaag tacttaagta tgtaatcatg 1320

gtacttgtaa cacttgctct tggtttcgct cttacttgga tctttggata taaagaggaa 1380

gaggttgaag cttaaacaga agttgttgct gaagatatcg cctcagcagg ttctgctcca 1440

gttgcattgc aagctgaaac aattgctgca ccacttaaag gtgaagttgt agctttggaa 1500

aatgtaaatg acccagtctt ctcttcagga gctatgggta aaggtgccgc tatcaaacct 1560

tcaggtaacc gagttgttgc accatttgat ggtgaagtgc aaattgcctt cccaacaggt 1620

cacgcttacg gtcttaaatc tgataaaggt gctgaagtgc ttatccacat cggtatcgat 1680

actgtctcac ttgacggtaa aggatttgat gctaaggttc aagcaaatca acgtgttaaa 1740

aaaggtgatg tcttggctac cttcgatagc tcagttatca ctgaagcagg tcttgacgat 1800

acaactatgg ttatcgttac aaacactgca gactacgaag atgtttcatc agtagcaact 1860

ggttcagttg ctgagggtga tgacttcatc gcagttaaat aa 1902

<210> 9

<211> 633

<212> белок

<213> Streptococcus thermophilus G15

<400> 9

Met Asp Tyr Lys Gln Ile Ala Lys Glu Val Ile Glu Ala Leu Gly Gly

1 5 10 15

Arg Glu Asn Val Asn Ser Val Ala His Cys Ala Thr Arg Leu Arg Val

20 25 30

Met Val Lys Asp Glu Asn Lys Ile Asn Lys Glu Lys Ala Glu Asn Ile

35 40 45

Glu Lys Val Gln Gly Ala Phe Phe Asn Ser Gly Gln Tyr Gln Met Ile

50 55 60

Phe Gly Thr Gly Thr Val Asn Lys Ile Tyr Asp Glu Val Val Ala Gln

65 70 75 80

Gly Leu Pro Thr Ala Ser Lys Asp Glu Gln Lys Ala Glu Ala Ala Lys

85 90 95

Gln Gly Asn Trp Phe Gln Arg Ala Ile Arg Ser Phe Gly Asp Val Phe

100 105 110

Val Pro Leu Leu Pro Ala Ile Val Ala Thr Gly Leu Phe Met Gly Ile

115 120 125

Arg Gly Ala Ile Asn Asn Asp Thr Val Leu Ala Leu Phe Gly Thr Thr

130 135 140

Ser Lys Ala Phe Ala Ala Thr Asp Phe Tyr Thr Tyr Thr Val Val Leu

145 150 155 160

Thr Asp Thr Ala Phe Ala Phe Phe Pro Ala Leu Ile Cys Trp Ser Ala

165 170 175

Phe Asn Val Phe Gly Gly Ser Pro Leu Leu Gly Leu Val Leu Gly Leu

180 185 190

Met Met Val Asn Asn Ala Leu Pro Asn Ala Trp Asp Val Val Ser Gly

195 200 205

Ala Ala Lys Pro Ile Tyr Phe Phe Asp Phe Ile Pro Val Val Gly Tyr

210 215 220

Gln Asn Ser Val Leu Pro Ala Phe Phe Val Gly Leu Ile Gly Ala Lys

225 230 235 240

Phe Glu Gln Trp Val Arg Lys Trp Val Pro Asp Ile Leu Asp Leu Leu

245 250 255

Leu Arg Pro Leu Val Val Phe Ala Val Met Ser Ala Leu Ala Leu Phe

260 265 270

Ile Ile Gly Pro Val Phe His Thr Val Glu Ser Tyr Val Leu Ala Gly

275 280 285

Thr Glu Trp Ile Leu Ala Leu Pro Phe Gly Leu Ala Gly Leu Val Leu

290 295 300

Gly Gly Ile His Gln Ile Ile Val Val Thr Gly Val His His Val Phe

305 310 315 320

Asn Leu Leu Glu Ala Asn Leu Ile Ser Asn Thr Gly Lys Asp Pro Leu

325 330 335

Asn Ala Ile Ile Thr Ala Ala Met Thr Ala Gln Ala Gly Ala Thr Leu

340 345 350

Ala Val Gly Val Lys Thr Lys Asp Ser Lys Leu Lys Ala Leu Ala Phe

355 360 365

Pro Ala Ser Leu Ser Ala Val Leu Gly Ile Thr Glu Pro Ala Ile Phe

370 375 380

Gly Val Asn Leu Arg Phe Gly Lys Pro Phe Ile Met Gly Leu Ile Ala

385 390 395 400

Gly Ala Ala Gly Gly Trp Leu Ala Ser Ile Leu Asn Leu Ala Gly Thr

405 410 415

Gly Phe Gly Val Thr Ile Val Pro Gly Thr Leu Leu Tyr Leu Asn Gly

420 425 430

Gln Val Leu Lys Tyr Val Ile Met Val Leu Val Thr Leu Ala Leu Gly

435 440 445

Phe Ala Leu Thr Trp Ile Phe Gly Tyr Lys Glu Glu Glu Val Glu Ala

450 455 460

Gln Thr Glu Val Val Ala Glu Asp Ile Ala Ser Ala Gly Ser Ala Pro

465 470 475 480

Val Ala Leu Gln Ala Glu Thr Ile Ala Ala Pro Leu Lys Gly Glu Val

485 490 495

Val Ala Leu Glu Asn Val Asn Asp Pro Val Phe Ser Ser Gly Ala Met

500 505 510

Gly Lys Gly Ala Ala Ile Lys Pro Ser Gly Asn Arg Val Val Ala Pro

515 520 525

Phe Asp Gly Glu Val Gln Ile Ala Phe Pro Thr Gly His Ala Tyr Gly

530 535 540

Leu Lys Ser Asp Lys Gly Ala Glu Val Leu Ile His Ile Gly Ile Asp

545 550 555 560

Thr Val Ser Leu Asp Gly Lys Gly Phe Asp Ala Lys Val Gln Ala Asn

565 570 575

Gln Arg Val Lys Lys Gly Asp Val Leu Ala Thr Phe Asp Ser Ser Val

580 585 590

Ile Thr Glu Ala Gly Leu Asp Asp Thr Thr Met Val Ile Val Thr Asn

595 600 605

Thr Ala Asp Tyr Glu Asp Val Ser Ser Val Ala Thr Gly Ser Val Ala

610 615 620

Glu Gly Asp Asp Phe Ile Ala Val Lys

625 630

<210> 10

<211> 464

<212> белок

<213> Streptococcus thermophilus клон 11

<400> 10

Met Asp Tyr Lys Gln Ile Ala Lys Glu Val Ile Glu Ala Leu Gly Gly

1 5 10 15

Arg Glu Asn Val Asn Ser Val Ala His Cys Ala Thr Arg Leu Arg Val

20 25 30

Met Val Lys Asp Glu Asn Lys Ile Asn Lys Glu Lys Ala Glu Asn Ile

35 40 45

Glu Lys Val Gln Gly Ala Phe Phe Asn Ser Gly Gln Tyr Gln Met Ile

50 55 60

Phe Gly Thr Gly Thr Val Asn Lys Ile Tyr Asp Glu Val Val Ala Gln

65 70 75 80

Gly Leu Pro Thr Ala Ser Lys Asp Glu Gln Lys Ala Glu Ala Ala Lys

85 90 95

Gln Gly Asn Trp Phe Gln Arg Ala Ile Arg Ser Phe Gly Asp Val Phe

100 105 110

Val Pro Leu Leu Pro Ala Ile Val Ala Thr Gly Leu Phe Met Gly Ile

115 120 125

Arg Gly Ala Ile Asn Asn Asp Thr Val Leu Ala Leu Phe Gly Thr Thr

130 135 140

Ser Lys Ala Phe Ala Ala Thr Asp Phe Tyr Thr Tyr Thr Val Val Leu

145 150 155 160

Thr Asp Thr Ala Phe Ala Phe Phe Pro Ala Leu Ile Cys Trp Ser Ala

165 170 175

Phe Asn Val Phe Gly Gly Ser Pro Leu Leu Gly Leu Val Leu Gly Leu

180 185 190

Met Met Val Asn Asn Ala Leu Pro Asn Ala Trp Asp Val Val Ser Gly

195 200 205

Ala Ala Lys Pro Ile Tyr Phe Phe Asp Phe Ile Pro Val Val Gly Tyr

210 215 220

Gln Asn Ser Val Leu Pro Ala Phe Phe Val Gly Leu Ile Gly Ala Lys

225 230 235 240

Phe Glu Gln Trp Val Arg Lys Trp Val Pro Asp Ile Leu Asp Leu Leu

245 250 255

Leu Arg Pro Leu Val Val Phe Ala Val Met Ser Ala Leu Ala Leu Phe

260 265 270

Ile Ile Gly Pro Val Phe His Thr Val Glu Ser Tyr Val Leu Ala Gly

275 280 285

Thr Glu Trp Ile Leu Ala Leu Pro Phe Gly Leu Ala Gly Leu Val Leu

290 295 300

Gly Gly Ile His Gln Ile Ile Val Val Thr Gly Val His His Val Phe

305 310 315 320

Asn Leu Leu Glu Ala Asn Leu Ile Ser Asn Thr Gly Lys Asp Pro Leu

325 330 335

Asn Ala Ile Ile Thr Ala Ala Met Thr Ala Gln Ala Gly Ala Thr Leu

340 345 350

Ala Val Gly Val Lys Thr Lys Asp Ser Lys Leu Lys Ala Leu Ala Phe

355 360 365

Pro Ala Ser Leu Ser Ala Val Leu Gly Ile Thr Glu Pro Ala Ile Phe

370 375 380

Gly Val Asn Leu Arg Phe Gly Lys Pro Phe Ile Met Gly Leu Ile Ala

385 390 395 400

Gly Ala Ala Gly Gly Trp Leu Ala Ser Ile Leu Asn Leu Ala Gly Thr

405 410 415

Gly Phe Gly Val Thr Ile Val Pro Gly Thr Leu Leu Tyr Leu Asn Gly

420 425 430

Gln Val Leu Lys Tyr Val Ile Met Val Leu Val Thr Leu Ala Leu Gly

435 440 445

Phe Ala Leu Thr Trp Ile Phe Gly Tyr Lys Glu Glu Glu Val Glu Ala

450 455 460

<210> 11

<211> 996

<212> ДНК

<213> Streptococcus thermophilus клон 11

<400> 11

atggctacat tagcagatat cgcaaaatta gcaggtgtat ctatttcaac tgtttcacgt 60

gttcttaata aagatgaaac tctttccgta acagaggata ctagacatcg gatattaact 120

atcgctgatg aaatcggata tactaaatac aaaacaatta ataattcaaa aaaagaaaag 180

tatcaagtgg caattattca atgggttagt gaagaacacg agttagatga catctactat 240

tataatatta gacttggtat tgaaaaaaga gcctatgaac tagactacga gatgcttcac 300

tttttcaacg acattccttc aagtctagga gaggaggtcg ttggtgtact atgtatcgga 360

aaatttagtc gtgaacaaat tgcgaaacta gaaagactaa aaaagactct ggtctttgtt 420

gatagtgata ctcttaatca aggacatcca tgtgttacta ctgattttga aaactccgta 480

caatcggcac tctgttatct taaagaacaa ggttgtaata atataggcct actcattggg 540

caagaaaaaa caacagatgc aactgaaatc atttctgatc ctcgtttacg ttcttatcga 600

aactactgta tggaaaaggg aatctatgac cctcttttta ttctgactgg tgacttcact 660

gtccaatctg gctatgaact tcttgattct aagattaaga gtggagctac tttacctgat 720

gcttactttg cggctagtga tagtctagct attggtgcac tcagagcact tcaggaaaat 780

ggtatcaagg tccctgacga cattcaaatt atctctttta acgatacaac tctagctaaa 840

caagtgtatc ctccactttc tagtgtcact gtctatacag aagaaatggg acgaacagct 900

atggatattc tcaataaaca attattagca cctcgaaaaa taccaacact tactaaacta 960

ggaacaaaat taacattaag aaacagtaca aaatag 996

<210> 12

<211> 996

<212> ДНК

<213> Streptococcus thermophilus клон 11R15

<400> 12

atggctacat tagcagatat cgcaaaatta gcaggtgtat ctatttcaac tgtttcacgt 60

gttcttaata aagatgaaac tctttccgta acagaggata ctagacatcg gatattaact 120

atcgctgatg aaatcggata tactaaatac aaaacaatta ataattcaaa aaaagaaaag 180

tatcaagtgg caattattca atgggttagt gaagaacacg agttagatga catctactat 240

tataatatta gacttggtat tgaaaaaaga gcctatgaac cagactacga gatgcttcac 300

tttttcaacg acattccttc aagtctagga gaggaggtcg ttggtgtact atgtatcgga 360

aaatttagtc gtgaacaaat tgcgaaacta gaaagactaa aaaagactct ggtctttgtt 420

gatagtgata ctcttaatca aggacatcca tgtgttacta ctgattttga aaactccgta 480

caatcggcac tctgttatct taaagaacaa ggttgtaata atataggcct actcattggg 540

caagaaaaaa caacagatgc aactgaaatc atttctgatc ctcgtttacg ttcttatcga 600

aactactgta tggaaaaggg aatctatgac cctcttttta ttctgactgg tgacttcact 660

gtccaatctg gctatgaact tcttgattct aagattaaga gtggagctac tttacctgat 720

gcttactttg cggctagtga tagtctagct attggtgcac tcagagcact tcaggaaaat 780

ggtatcaagg tccctgacga cattcaaatt atctctttta acgatacaac tctagctaaa 840

caagtgtatc ctccactttc tagtgtcact gtctatacag aagaaatggg acgaacagct 900

atggatattc tcaataaaca attattagca cctcgaaaaa taccaacact tactaaacta 960

ggaacaaaat taacattaag aaacagtaca aaatag 996

<210> 13

<211> 331

<212> белок

<213> Streptococcus thermophilus клон 11

<400> 13

Met Ala Thr Leu Ala Asp Ile Ala Lys Leu Ala Gly Val Ser Ile Ser

1 5 10 15

Thr Val Ser Arg Val Leu Asn Lys Asp Glu Thr Leu Ser Val Thr Glu

20 25 30

Asp Thr Arg His Arg Ile Leu Thr Ile Ala Asp Glu Ile Gly Tyr Thr

35 40 45

Lys Tyr Lys Thr Ile Asn Asn Ser Lys Lys Glu Lys Tyr Gln Val Ala

50 55 60

Ile Ile Gln Trp Val Ser Glu Glu His Glu Leu Asp Asp Ile Tyr Tyr

65 70 75 80

Tyr Asn Ile Arg Leu Gly Ile Glu Lys Arg Ala Tyr Glu Leu Asp Tyr

85 90 95

Glu Met Leu His Phe Phe Asn Asp Ile Pro Ser Ser Leu Gly Glu Glu

100 105 110

Val Val Gly Val Leu Cys Ile Gly Lys Phe Ser Arg Glu Gln Ile Ala

115 120 125

Lys Leu Glu Arg Leu Lys Lys Thr Leu Val Phe Val Asp Ser Asp Thr

130 135 140

Leu Asn Gln Gly His Pro Cys Val Thr Thr Asp Phe Glu Asn Ser Val

145 150 155 160

Gln Ser Ala Leu Cys Tyr Leu Lys Glu Gln Gly Cys Asn Asn Ile Gly

165 170 175

Leu Leu Ile Gly Gln Glu Lys Thr Thr Asp Ala Thr Glu Ile Ile Ser

180 185 190

Asp Pro Arg Leu Arg Ser Tyr Arg Asn Tyr Cys Met Glu Lys Gly Ile

195 200 205

Tyr Asp Pro Leu Phe Ile Leu Thr Gly Asp Phe Thr Val Gln Ser Gly

210 215 220

Tyr Glu Leu Leu Asp Ser Lys Ile Lys Ser Gly Ala Thr Leu Pro Asp

225 230 235 240

Ala Tyr Phe Ala Ala Ser Asp Ser Leu Ala Ile Gly Ala Leu Arg Ala

245 250 255

Leu Gln Glu Asn Gly Ile Lys Val Pro Asp Asp Ile Gln Ile Ile Ser

260 265 270

Phe Asn Asp Thr Thr Leu Ala Lys Gln Val Tyr Pro Pro Leu Ser Ser

275 280 285

Val Thr Val Tyr Thr Glu Glu Met Gly Arg Thr Ala Met Asp Ile Leu

290 295 300

Asn Lys Gln Leu Leu Ala Pro Arg Lys Ile Pro Thr Leu Thr Lys Leu

305 310 315 320

Gly Thr Lys Leu Thr Leu Arg Asn Ser Thr Lys

325 330

<210> 14

<211> 331

<212> белок

<213> Streptococcus thermophilus клон 11R15

<400> 14

Met Ala Thr Leu Ala Asp Ile Ala Lys Leu Ala Gly Val Ser Ile Ser

1 5 10 15

Thr Val Ser Arg Val Leu Asn Lys Asp Glu Thr Leu Ser Val Thr Glu

20 25 30

Asp Thr Arg His Arg Ile Leu Thr Ile Ala Asp Glu Ile Gly Tyr Thr

35 40 45

Lys Tyr Lys Thr Ile Asn Asn Ser Lys Lys Glu Lys Tyr Gln Val Ala

50 55 60

Ile Ile Gln Trp Val Ser Glu Glu His Glu Leu Asp Asp Ile Tyr Tyr

65 70 75 80

Tyr Asn Ile Arg Leu Gly Ile Glu Lys Arg Ala Tyr Glu Pro Asp Tyr

85 90 95

Glu Met Leu His Phe Phe Asn Asp Ile Pro Ser Ser Leu Gly Glu Glu

100 105 110

Val Val Gly Val Leu Cys Ile Gly Lys Phe Ser Arg Glu Gln Ile Ala

115 120 125

Lys Leu Glu Arg Leu Lys Lys Thr Leu Val Phe Val Asp Ser Asp Thr

130 135 140

Leu Asn Gln Gly His Pro Cys Val Thr Thr Asp Phe Glu Asn Ser Val

145 150 155 160

Gln Ser Ala Leu Cys Tyr Leu Lys Glu Gln Gly Cys Asn Asn Ile Gly

165 170 175

Leu Leu Ile Gly Gln Glu Lys Thr Thr Asp Ala Thr Glu Ile Ile Ser

180 185 190

Asp Pro Arg Leu Arg Ser Tyr Arg Asn Tyr Cys Met Glu Lys Gly Ile

195 200 205

Tyr Asp Pro Leu Phe Ile Leu Thr Gly Asp Phe Thr Val Gln Ser Gly

210 215 220

Tyr Glu Leu Leu Asp Ser Lys Ile Lys Ser Gly Ala Thr Leu Pro Asp

225 230 235 240

Ala Tyr Phe Ala Ala Ser Asp Ser Leu Ala Ile Gly Ala Leu Arg Ala

245 250 255

Leu Gln Glu Asn Gly Ile Lys Val Pro Asp Asp Ile Gln Ile Ile Ser

260 265 270

Phe Asn Asp Thr Thr Leu Ala Lys Gln Val Tyr Pro Pro Leu Ser Ser

275 280 285

Val Thr Val Tyr Thr Glu Glu Met Gly Arg Thr Ala Met Asp Ile Leu

290 295 300

Asn Lys Gln Leu Leu Ala Pro Arg Lys Ile Pro Thr Leu Thr Lys Leu

305 310 315 320

Gly Thr Lys Leu Thr Leu Arg Asn Ser Thr Lys

325 330

<210> 15

<211> 14

<212> ДНК

<213> Streptococcus thermophilus

<400> 15

tgaaaggggt tacg 14

<---

Изобретение относится к штамму Streptococcus thermophilus и его применению. Предложен штамм Streptococcus thermophilus, депонированный в CNCM под идентификационным номером CNCM I-5448, подходящий для применения при получении ферментированного молочного пищевого продукта для потребления человеком. Также предложены композиция, содержащая указанный штамм, способ приготовления ферментированного молочного пищевого продукта с использованием указанного штамма, а также применение указанного штамма для ферментации молочного пищевого продукта. Изобретение обеспечивает достижение штаммом ферментации при значительном сохранении уровня сахарозы в ингредиентах, увеличение вязкости в продукте, быстрый рост штамма в молоке. 4 н. и 4 з.п. ф-лы, 9 ил., 3 табл.

1. Штамм Streptococcus thermophilus, депонированный в CNCM под идентификационным номером CNCM I-5448, подходящий для применения при получении ферментированного молочного пищевого продукта для потребления человеком.

2. Композиция, содержащая штамм по п. 1, отличающаяся тем, что она представляет собой ферментированный молочный пищевой продукт, предназначенный для потребления человеком.

3. Композиция по п. 2, содержащая по меньшей мере 10⁵ КОЕ/г указанного штамма.

4. Способ приготовления ферментированного молочного пищевого продукта, включающий:

i) предоставление смеси, содержащей:

a) молоко, и

b) по меньшей мере один штамм S. thermophilus по п. 1,

ii) ферментацию указанной смеси с получением ферментированного молочного пищевого продукта.

5. Композиция по п. 2 или 3, имеющая вязкость по меньшей мере 800 мПа⋅с.

6. Композиция по п. 2 или 3, имеющая рН 4,7 или ниже.

7. Композиция по п. 2 или 3, дополнительно содержащая по меньшей мере один штамм Bifidobacterium или молочнокислых бактерий.

8. Применение штамма по п. 1 для ферментации молочного пищевого продукта.