Настоящее изобретение относится к области пищевых продуктов, богатых питательными веществами, витаминами и/или микроэлементами, и имеет своей целью увеличение содержания и улучшение качественного и количественного баланса питательных веществ, поступающих в организм человека.
Более конкретно, изобретение относится к способам обогащения пищевых продуктов витамином K.
В частности, настоящее изобретение относится к получению вариантов штаммов молочнокислых бактерий, которые продуцируют в стандартных условиях брожения, по меньшей мере, примерно в 1,2 раза больше витамина K2, чем исходные штаммы молочнокислых бактерий, культивируемые в тех же условиях.
Изобретение также относится к способу приготовления пищевых продуктов, более конкретно, продуктов, получаемых путем брожения, и/или свежих молочных продуктов, обогащенных витамином K2, а также пищевым продуктам, полученным таким способом. Витамин K является жирорастворимым витамином, который встречается в двух естественных формах: витамин K1 (или филлохинон) и витамин K2 (или менахинон).
Витамин K1 синтезируется растениями. Он находится, главным образом, в зеленных овощах (листовых овощах) и в соевом масле. Витамин K1 непосредственно участвует в процессе свертывания крови.
Что касается витамина K2, он продуцируется бактериями кишечной флоры. Он также появляется в небольших количествах в некоторых пищевых продуктах в результате процесса брожения (сыр, традиционные азиатские продукты, такие как японские мисо и натто, приготовленные на базе сои, подвергнутой брожению, и т.д.). Витамин K2 могут синтезировать многие бактерии. Так, помимо бактерий кишечной флоры и, более конкретно, видов Escherichia coli, Bacillus subtilis и Bacteroides spp., можно назвать некоторые виды или подвиды молочнокислых бактерий, такие как Lactococcus lactis spp. lactis, Lactococcus lactis spp. cremoris, Leuconostoc lactis, Leuconostoc mesenteroides и Propionibacterium sp. Количество витамина K2, синтезированного этими бактериями, обычно варьирует примерно от 29 до 90 мкг/л сквашенного молока (Morishita et al., 1999). Важно отметить, что мероприятия по получению витамина K2 чаще всего проводят на базе лиофилизатов клеточной массы, и результаты этих мероприятий демонстрируют значительную неоднородность уровня выработки в зависимости от тестируемых штаммов, который может варьироваться от однократного до более чем трехкратного (Morishita et al., 1999; Parker et al., 2003). В плане биологической активности витамин K2 известен, главным образом, своим действием на кальцификацию мягких тканей.
Первоначально витамин K был описан в связи с его важной ролью в процессе свертывания крови. Так, большой дефицит витамина K приводит к кровотечениям с аномальным удлинением времени свертывания и к кровоподтекам. Долгое время считалось, что значительный дефицит витамина K редко встречается у взрослых, поскольку в принципе потребности в витамине могут в приемлемой степени покрываться за счет разнообразного и сбалансированного питания, а также за счет эндогенного образования витамина кишечными бактериями. В связи с этим, к группе риска относятся следующие категории людей:
- новорожденные, в кишечнике которых при рождении отсутствуют бактерии, продуцирующие витамин K;
- лица с нарушенными функциями печени, желчного пузыря или кишечника (болезни печени, муковисцидоз, колиты, дизентерия…); и
- лица, принимающие антибиотики в течение длительного времени.
Позднее было установлено, что влияние витамина K на здоровье человека не ограничивается только его ролью в механизмах свертывания крови. Действительно, с 80-х годов было признано, что витамин K также играет роль в костном метаболизме (Hart et al., 1984; Hart et al., 1985).
Этот витамин играет роль кофактора в ферментной реакции, обусловливающей активность остеокальцина в рамках регуляции костеобразования (Hauschka PV et al., 1989; Ducy P et al., 1996). Более конкретно, его роль заключается в создании условий для карбоксилирования остеокальцина, ключевого протеина, который регулирует процесс костеобразования. В случае дефицита витамина K эта реакция не происходит, что влечет за собой повышение соотношения декарбоксилированного остеокальцина к карбоксилированному остеокальцину в крови (Väänänen et al., 1999).
Изменение демографической ситуации в западных странах проявилось в постепенном старении населения, которое неизбежно сопровождалось повышением уровня распространения дегенеративных патологий, в частности, остеопороза. Теперь в этой связи остеопороз стал считаться серьезной проблемой здравоохранения.
Результаты демографического анализа, проведенного в 90-х годах, стали сигналом тревоги, прогнозируя значительное увеличение числа случаев этой патологии в ближайшие 50 лет, в частности, у лиц старшего возраста. Таким образом, очень быстро стала очевидной необходимость и неотложность действий по предотвращению этой патологии, которая до недавнего времени редко выявлялась, и ее лечение начиналось с опозданием.
На перспективу было признано, что предупреждение остеопороза должно начинаться с детства через создание оптимальных условий роста костей и продолжаться в течение всей жизни путем поддержания костной массы. Известно, что связанные с питанием факторы играют важную роль в развитии и поддержании костной системы. До настоящего времени рассматриваемые или предлагаемые стратегии питания для предупреждения остеопороза были по существу основаны на двух ключевых факторах, а именно: на кальции и на витамине D. Тем не менее, сейчас мы знаем, что значительный интерес могут представлять и другие факторы, связанные с питанием.
В связи с большой ролью, которую играет витамин К в костеобразовании, он все чаще и чаще упоминается в литературе как многообещающий путь сохранения костного здоровья человека в течение всей его жизни.
Рекомендованные нормы приема витамина K у человека (1,5 мкг/день/кг веса) были установлены только с учетом его роли в процессе свертывания крови. Так, последние исследования наводят на мысль, что эти рекомендованные нормы приема являются, в - конечном счете, заниженными, если также учитывать активность витамина K в костном метаболизме (Ronden et al., 1998). Если потребности в витамине K еще плохо известны, это не умаляет значимости того факта, что поступление в организм небольшого количества витамина связано с низкой костной массой и повышенным риском возникновения переломов у взрослых (Hart et al., 1985; Knapen et al., 1989; Szulc et al., 1993; Booth et al., 2000). Кроме того, исследования действия витамина у женщин в период менопаузы показали, что витамин K может привести к снижению потерь костной ткани в этой целевой группе (Shiraki et al., 2000; Braam et al., 2003). И наконец, опыты на животных показали, что он мог бы оказывать благоприятное воздействие в момент пика костной массы и это действие будет более выраженным при синергическом сочетании с витамином D. При этом исследования, ясно связывающие витамин K и костный рост, в настоящее время проводились только на животных.
Более того, последние исследования позволили получить дополнительные аргументы в пользу влияния витамина K на костный метаболизм и, более конкретно, на построение и сохранение костной массы (Booth et al., 2000; Shiraki et al., 2000; Braam et al., 2003; Hirano et Ishi, 2002).
В отличие от взрослых, пока существует мало данных о благоприятном действии витамина K на костный метаболизм ребенка. Известно только то, что важно оптимизировать костную массу в период роста для создания максимального костного запаса и защиты взрослого от риска возможного остеопороза.
Во всяком случае, из массива данных, имеющихся на данный момент, следует, что повышение содержания витамина K в пищевых продуктах является очень интересным и многообещающим путем, который позволит индивидууму построить и поддерживать хорошую костную конституцию.
В свете этого, на рынке пищевых продуктов уже имеются промышленные изделия, содержащие значительное количество витамина K. Более конкретно, можно назвать некоторые молочные продукты, которые содержат молочнокислые бактерии, такие как кисломолочные продукты с фруктовыми наполнителями («Petits Gervais aux Fruits»), выпускаемые во Франции компанией, подавшей заявку. Однако следует отметить, что, с одной стороны, содержание витамина K в этих продуктах, как правило, зависит от типа используемых ферментов и, с другой стороны, штаммы Lactococcus lactis, которые традиционно используются в молочных продуктах, не продуцируют витамин K в достаточном количестве, чтобы полностью удовлетворить потребности населения и даже способствовать временному уменьшению возможного дефицита витамина K.
Следовательно, существует потребность в современном способе приготовления пищевых продуктов, более конкретно продуктов, получаемых путем брожения, и/или свежих молочных продуктов, которые содержат витамин K в количестве, достаточном для удовлетворения потребностей и, при необходимости, для восполнения дефицита как у детей и подростков, так и у взрослых, и лиц старшего возраста.
В дальнейшем, термины «витамин K2» и «витамин K» без различия будут использоваться для обозначения витамина K2.
Так, настоящее изобретение имеет своей целью удовлетворить эту потребность, предложив приготовление пищевых продуктов, более конкретно продуктов, получаемых путем брожения, и/или свежих молочных продуктов, используя новые варианты штаммов молочнокислых бактерий, которые продуцируют витамин K в количестве, значительно превышающем количество, продуцируемое штаммами, от которых они происходят.
Кроме того, в процессе работы изобретатели подобрали условия использования молочнокислых бактерий, которые существенным образом способствуют выработке витамина K по сравнению с классическими условиями выработки. Так, для приготовления молочных продуктов, таких как продукты, получаемые путем брожения, и/или свежие молочные продукты, обогащенные витамином K2, можно предпочтительно применять варианты, продуцирующие повышенное количество витамина K, которые являются предметом настоящего изобретения, в условиях использования, определенных изобретателями как особо благоприятные для продуцирования витамина K и являющиеся объектом французской заявки на изобретение №06/08690 от 4 октября 2006 г.
Здесь под термином «вариант» в настоящей заявке понимают:
- природные варианты, то есть полученные спонтанно на базе эталонного штамма молочнокислых бактерий под действием отбора; следовательно, такие варианты не подвергались никаким генетическим манипуляциям, а были получены, главным образом, путем мутаций и селекции на базе эталонного штамма; и
- мутанты, имеющие одну или несколько мутаций в своем геноме, которые были получены методами генной инженерии, то есть методами направленного мутагенеза, в частности, путем генетической трансформации при помощи векторов, приложенных к эталонному штамму.
Следует отметить, что в некоторых странах (в частности, в Европе), промышленники, занятые на пищевых производствах, должны принимать меры предосторожности при разработке продуктов, предназначенных для питания человека и/или кормления животных, в состав которых входят микроорганизмы, более конкретно, живые микроорганизмы. Действительно, организмы (здесь, микроорганизмы), которые были генетически модифицированы (ГМО или мутанты), могут вызвать у потребителей чувство опасения и страха. Этот негативный образ, который связан с ГМО в некоторых странах, настолько яркий, что население склонно «бойкотировать» пищевые продукты, содержащие ГМО. Таким образом, в условиях, когда потребители постоянно требуют все большей прозрачности информации о составе пищевых продуктов, которые им предлагают, и о происхождении ингредиентов, содержащихся в этих продуктах, промышленники могут быть поставлены перед необходимостью предлагать продукты почти полностью или даже полностью свободные от ГМО. В рамках настоящего изобретения, может быть предпочтительным то, что пищевые продукты промышленного производства, содержащие микроорганизмы, были приготовлены с использованием только природных штаммов или вариантов природных штаммов.
По первому аспекту настоящее изобретение относится к способу получения варианта штамма молочнокислых бактерий, который продуцирует в стандартных условиях брожения количество витамина K2, превышающее, по меньшей мере, примерно в 1,2 раза, то количество, которое продуцирует исходный штамм молочнокислых бактерий, культивируемый в тех же условиях, при том, что упомянутый способ включает, по меньшей мере:
a) культуру упомянутого штамма молочнокислых бактерий в стандартных условиях брожения на селективной среде, вызывающей изменение окислительно-восстановительного состояния клетки; и
b) отбор упомянутого варианта, если он продуцирует, по меньшей мере, примерно в 1,2 раза больше витамина K2, чем исходный штамм молочнокислых бактерий, культивируемый в тех же условиях.
В контексте изобретения «варианты» являются штаммами молочнокислых бактерий, которые способны продуцировать большее количество витамина K2, чем штаммы, из которых они были получены. Более конкретно, варианты по настоящему изобретению могут продуцировать, по меньшей мере, примерно в 1,2 раза больше витамина K2, чем исходные штаммы. Предпочтительно, количество витамина K2, продуцируемое вариантом по настоящему изобретению, превышает, по меньшей мере, примерно в 1,5 раза количество витамина, полученное при культивировании исходного штамма молочнокислых бактерий в тех же стандартных условиях брожения. Более предпочтительно, этот показатель увеличения составляет, по меньшей мере, примерно 1,7, более предпочтительно, по меньшей мере, примерно 1,8, еще более предпочтительно, по меньшей мере, примерно 1,9. Наиболее предпочтительно, чтобы величина этого показателя увеличения составляла, по меньшей мере, примерно 2; 2,2; 2,4; 2,5; 2,7; 2,8; 2,9; 3.
«Эталонные» или «исходные» штаммы молочнокислых бактерий являются штаммами, на базе которых получены варианты по изобретению. Эти штаммы могут быть природными или сами быть вариантами, то есть природными вариантами или мутантами.
В рамках настоящего изобретения «лабораторными условиями» являются стандартные условия брожения, хорошо известные специалистам. Так, выражения «лабораторные условия» и «стандартные условия брожения» здесь являются полными синонимами. Предпочтительные «лабораторные условия» в контексте настоящего изобретения являются следующими: предварительная культура штамма осуществляется на промышленной среде M17 (Difco™ M17) или на аналогичной среде. Для последующей культуры посев проводится с использованием предварительной культуры из расчета 1%. Температура инкубации составляет около 30°C. Следует иметь в виду, что лабораторные условия при необходимости могут быть изменены специалистом, на основании общих знаний и, возможно, после опытов по отработке стандартных условий. Культуральная среда является средой, пригодной для культивирования штаммов молочнокислых бактерий, в частности штаммов Lactococcus spp.
По предпочтительному способу осуществления штамм молочнокислых бактерий выбирают из числа родов Lactococcus, Leuconostoc, Enterococcus и Propionibacterium. Более предпочтительно штамм выбирают из числа видов Lactococcus lactis, Leuconostoc lactis, Leuconostoc pseudomesenteroides, Leuconostoc mesenteroides, Leuconostoc dextranicum, Enterococcus faecium, Propionibacterium sp.
Предпочтительно, как это будет показано ниже, в способе по изобретению используют селективную среду, выбранную из числа культуральных сред, содержащих бацитрацин или окислитель, такой как перекись.
Такая селективная среда при использовании позволяет спровоцировать изменение окислительно-восстановительного состояния клетки. Предпочтительно это изменение коррелирует с изменением у упомянутого варианта и в сравнении со штаммом молочнокислых бактерий, из которого он был получен, применительно к экспрессии, по меньшей мере, одного гена, выбранного из числа генов №1-27, перечисленных в таблице I ниже:
Предпочтительно экспрессия генов №1-27 у упомянутого варианта изменена по сравнению с исходным штаммом молочнокислых бактерий.
Под «изменением экспрессии гена» здесь подразумевается то, что экспрессия рассматриваемого гена оказывается количественно измененной по сравнению с экспрессией, наблюдаемой у исходного штамма молочнокислых бактерий:
- либо экспрессия увеличивается, и предпочтительно это должно затрагивать, по меньшей мере, один ген, выбранный из числа генов №1-15;
- либо экспрессия уменьшается, и предпочтительно это должно затрагивать, по меньшей мере, один ген, выбранный из числа генов №16-27.
Предпочтительно вариант отбирают на этапе b), если он продуцирует в стандартных условиях брожения:
- по меньшей мере, примерно в 1,5 раза больше, предпочтительно, по меньшей мере, примерно в 2 раза больше, наиболее предпочтительно, по меньшей мере, примерно в 3 раза больше витамина K2, чем фермент CHN-12; и/или
- по меньшей мере, примерно в 1,5 раза больше, предпочтительно, по меньшей мере, примерно в 2 раза больше, более предпочтительно, по меньшей мере, примерно в 3 раза больше и наиболее предпочтительно, по меньшей мере, примерно в 10 раз больше витамина K2, чем модельный штамм MG1363.
Предпочтительно вариант отбирают на этапе b), если он продуцирует в стандартных условиях брожения, по меньшей мере, примерно 5,5 мкг витамина K2 на 100 г сквашенного молока.
Если количество витамина K2, продуцированного вариантами, составляет, по меньшей мере, примерно 5,5 мкг на 100 г сквашенного молока в стандартных условиях брожения, можно говорить о варианте с повышенной способностью продуцировать витамин K2. Более конкретно, вариант по настоящему изобретению продуцирует, по меньшей мере, примерно 5,7 мкг, более предпочтительно, по меньшей мере, примерно 5,9 мкг, более предпочтительно, по меньшей мере, примерно 6,1 мкг, и наиболее предпочтительно, по меньшей мере, примерно 6,3 мкг витамина K2 на 100 г сквашенного молока в стандартных условиях брожения. Более предпочтительно, вариант по настоящему изобретению продуцирует, по меньшей мере, примерно 6,5 мкг, более предпочтительно, по меньшей мере, примерно 7 мкг, более предпочтительно, по меньшей мере, примерно 7,5 мкг, более предпочтительно, по меньшей мере, примерно 8 мкг, более предпочтительно, по меньшей мере, примерно 8,5 мкг, более предпочтительно, по меньшей мере, примерно 9 мкг, более предпочтительно, по меньшей мере, примерно 9,5 мкг и наиболее предпочтительно, по меньшей мере, примерно 10 мкг витамина K2 на 100 г сквашенного молока в стандартных условиях брожения.
По второму аспекту настоящее изобретение относится к варианту штамма молочнокислых бактерий, который может быть получен способом, описанным выше, а также к биологически чистым культурам и фракциям культур упомянутого варианта, которые продуцируют в стандартных условиях брожения количество витамина K2, по меньшей мере, примерно в 1,2 раза превышающее количество, продуцируемое исходным штаммом молочнокислых бактерий, культивируемым в тех же условиях.
Более конкретно, вариант по настоящему изобретению продуцирует в лабораторных условиях (или в стандартных условиях брожения):
- по меньшей мере, примерно в 1,5 раза больше, предпочтительно, по меньшей мере, примерно в 2 раза больше, наиболее предпочтительно, по меньшей мере, примерно в 3 раза больше витамина K2, чем фермент CHN-12, выпускаемый компанией CHR. Hansen A/S (Хорсхольм, Дания); и/или
- по меньшей мере, примерно в 1,5 раза больше, предпочтительно, по меньшей мере, примерно в 2 раза больше, более предпочтительно, по меньшей мере, примерно в 3 раза больше и наиболее предпочтительно, по меньшей мере, примерно в 10 раз больше витамина K2, чем модельный штамм Lactococcus lactis ssp. cremoris MG1363, депонированный в Центральном бюро культур грибов (CBS) (Баарн, Нидерланды) под номером CBS 364.89. Этот модельный штамм Lactococcus lactis ssp. cremoris прекрасно известен специалистам. Он был впервые описан Гассоном в 1983 г. (Gasson M., 1983).
В соответствии с определением «варианта природного штамма», приведенным выше, вариант по настоящему изобретению является природным вариантом, полученным под действием отбора на подходящей культуральной среде.
В настоящей заявке представлено много примеров таких природных вариантов, полученных в результате отбора. Ниже коротко описаны предпочтительные примеры вариантов и способы их получения (более подробно, см. в разделе «Примеры» ниже).
По первому способу осуществления вариант по изобретению получают путем селекции на культуральной среде, содержащей бацитрацин. В зависимости от исходных штаммов, концентрация бацитрацина в среде может составлять, например, по меньшей мере, примерно 0,4 мг/л, предпочтительно, по меньшей мере, примерно 1 мг/л, предпочтительно, по меньшей мере, примерно около 2 мг/л, предпочтительно, по меньшей мере, примерно 3 мг/л и наиболее предпочтительно, по меньшей мере, примерно 4 мг/л. При этом специалисту ясно, что концентрация бацитрацина, которую следует применять для получения вариантов по изобретению, будет определяться в зависимости от степени устойчивости к бацитрацину используемого исходного штамма молочнокислых бактерий. При необходимости специалист будет работать с несколькими разными концентрациями, которые он выберет в зависимости от свойств исходного штамма. Предпочтительно специалист может работать с рядами концентраций бацитрацина.
Вариант, представляющий особый интерес, обладает, в основном, теми же биологическими свойствами, что и вариант I-3557, депонированный в Национальной коллекции культур и микроорганизмов (CNCM, Институт Пастера, 25 ул. Доктора Ру, 75724 Париж, п.о. 15, Франция) 20.01.2006 г.
Под выражением «вариант А обладает, в основном, теми же биологическими свойствами, что и вариант I-3557», здесь понимают, что вариант А является вариантом, полученным путем селекции на среде, содержащей бацитрацин. При этом концентрация бацитрацина, созданная в среде для получения варианта А, не является предопределяющей для соответствия настоящему определению. Предопределяющим условием, напротив, является то, что вариант А способен продуцировать в лабораторных условиях примерно столько же витамина K2, предпочтительно, по меньшей мере, столько же витамина K2, сколько вариант I-3557. Вариантом в контексте изобретения предпочтительно является вариант I-3557.
По второму способу осуществления вариант по настоящему изобретению получают путем селекции на культуральной среде, содержащей, по меньшей мере, один окислитель. Например, окислитель может быть выбран из числа перекиси, ионов хлорной кислоты, ионов двухвалентного железа, менадиона, параквата, кислорода или любого другого подходящего окислительного соединения. Предпочтительно, окислитель является перекисью. Как и в случае бацитрацина, концентрация перекиси в среде определяется в зависимости от исходного штамма молочнокислых бактерий. Например, можно протестировать одну или несколько концентраций перекиси в следующих рядах: по меньшей мере, примерно 20, 25, 27, 28,5 мг/л. И в этот раз специалист будет определять одну или несколько подходящих концентраций, или даже один или несколько рядов подходящих концентраций перекиси, которые он протестирует экспериментальным путем, как он это делает обычно.
Предпочтительно, вариант по изобретению обладает, в основном, теми же биологическими свойствами, что и вариант I-3558 (депонированный в CNCM 20.01.2006 г.). Определение выражения «вариант А обладает, в основном, теми же биологическими свойствами, что и вариант I-3557», приведенное выше, применяется здесь mutatis mutandis (с необходимыми поправками) (перекись вместо бацитрацина; вариант I-3558 вместо варианта I-3557). Предпочтительно, такой вариант является вариантом I-3558.
Третий аспект настоящего изобретения касается применения конкретных условий отбора для получения вариантов штаммов молочнокислых бактерий, которые в соответствии с ранее приведенным описанием продуцируют в стандартных условиях брожения, по меньшей мере, примерно в 1,2 раза больше витамина K2, чем исходные штаммы бактерий, культивируемые в тех же условиях.
Более конкретно этим применением конкретных условий является:
- использование устойчивости к бацитрацину; и/или
- использование устойчивости к окислителю, например, к перекиси.
Как было указано выше, упомянутые варианты предпочтительно обладают способностью продуцировать, по меньшей мере, примерно 5,5 мкг витамина K2 на 100 г на 100 г сквашенного молока в стандартных условиях брожения.
Четвертый аспект настоящего изобретения касается молочной закваски, которая включает, по меньшей мере, один вариант, соответствующий описанию выше.
По пятому аспекту настоящее изобретение относится к способу производства пищевого продукта, обогащенного витамином K2, включающему, по меньшей мере:
a) введение, по меньшей мере, одного варианта и/или, по меньшей мере, одной закваски, соответствующей (-их) описанию выше, на промежуточном этапе приготовления вышеназванного продукта; и
b) получение упомянутого продукта, обогащенного витамином K2.
Альтернативно, изобретение относится к способу повышения содержания витамина K2 в пищевом продукте, включающему, по меньшей мере:
a) введение, по меньшей мере, одного варианта и/или, по меньшей мере, одной закваски, соответствующей (их) описанию выше, на промежуточном этапе приготовления вышеназванного продукта; и
b) получение упомянутого продукта, обогащенного витамином K2.
Более конкретно, варианты и/или молочная закваска могут быть внедрены путем использования концентратов бактерий, которые были предварительно культивированы на месте (на месте производства пищевых продуктов), или путем использования бактерий, предварительно культивированных поставщиком заквасок, которые были доведены до кондиции и отправлены к месту (-ам) производства пищевых продуктов. Поставщики могут доводить до кондиции бактерии в свежем или в замороженном состоянии; в качестве альтернативы бактерии могут быть высушены или лиофилизированы. Во всех случаях бактерии добавляют в молочную массу совершенно традиционным способом (как любую другую известную молочную закваску).
Шестой аспект настоящего изобретения касается пищевого продукта, обогащенного витамином K2, который может быть получен способом, раскрытым выше. Изобретение касается пищевых продуктов для человека и/или продуктов для кормления животных, предпочтительно продуктов, предназначенных для использования в пищу людьми. Предпочтительно такой пищевой продукт, обогащенный витамином K2, увеличивает прочность костей человека, который его употребляет. Предпочтительно, этот человек - ребенок.
Предпочтительно в контексте изобретения пищевой продукт выбран из числа продуктов, подвергнутых брожению, свежих молочных продуктов, подвергнутых брожению или нет, продуктов на основе сока растительного происхождения (фрукты, овощи, зерновые, соя и т.д.), подвергнутых брожению или нет, и их сочетаний. Наиболее предпочтительно, в контексте изобретения пищевой продукт является продуктом, подвергнутым брожению, и/или свежим молочным продуктом.
В контексте изобретения, термин «свежие молочные продукты» более конкретно обозначает свежие или подвергнутые брожению молочные продукты, готовые к употреблению в пищу человеком, иначе говоря, свежие и подвергнутые брожению молочные пищевые продукты. В настоящей заявке более конкретно рассматриваются молочнокислые продукты и йогурты. Альтернативно, упомянутыми свежими и подвергнутыми брожению пищевыми продуктами могут быть творог или творожные сырки.
Под терминами «молочнокислые продукты» и «йогурты» понимают их значения, принятые в молочной промышленности, т.е. это продукты, предназначенные для использования человеком в пищу, которые были получены путем окислительного молочнокислого сбраживания молочного субстрата. Эти продукты могут содержать вторичные ингредиенты, такие как фрукты, овощи, сахар и тому подобное. В частности, можно руководствоваться французским Декретом №88-1203 от 30 декабря 1988 г.о кисломолочных продуктах и йогуртах, опубликованном в официальном бюллетене законодательства Франции (Journal Officiel de la Republique Francaise) от 31 декабря 1988 г.
Можно также руководствоваться Сводом правил производства и распространения пищевых продуктов - «Кодекс Алиментариус» («Codex Alimentarius») (подготовленным Комиссией по выработке «Кодекс Алиментариус» под эгидой ФАО и ВОЗ и опубликованным Информационным отделом ФАО, который доступен в онлайновом режиме по адресу: http://www.codexalimentarius.net; сравните, в частности, том 12 «Кодекс Алиментариус» «Стандарты Кодекса на молоко и молочные продукты», и стандарт «CODEX STAN А-11(а)-1975»).
Таким образом, в настоящей заявке под выражением «кисломолочный продукт» понимают молочный продукт, приготовленный из молочного субстрата, который был подвергнут обработке, по меньшей мере, равноценной пастеризации и засеян микроорганизмами, принадлежащими к виду или к видам, характерному (-ым) для каждого продукта. «Кисломолочный продукт» не был подвергнут никакой обработке, которая позволяет извлечь из молочного субстрата внедренную составную часть, и, в частности, отделению сыворотки от сгустка. Свертывание «молочнокислых продуктов» не должно быть достигнуто иными способами, отличными от тех, которые являются результатом деятельности использованных микроорганизмов.
Под термином «йогурт» понимают кисломолочный продукт, полученный в соответствии с местными традиционными и постоянными методами в результате развития специфических термофильных молочнокислых бактерий, называемых Lactobacillus bulgaricus и Streptococcus thermophilus, которые должны находиться в конечном продукте в живом состоянии из расчета, по меньшей мере, 10 миллионов бактерий на грамм молочной части продукта.
В некоторых странах законодательство разрешает добавление других молочнокислых бактерий при производстве йогурта, и, более конкретно, дополнительное применение штаммов Bifidobacterium и/или Lactobacillus acidophilus и/или Lactobacillus casei. Эти дополнительные штаммы молочнокислых бактерий предназначены для придания конечному продукту различных свойств, таких как сохранение и восстановление физиологического равновесия кишечной флоры или способность действовать как модулятор иммунной системы.
На практике выражение «кисломолочный продукт» обычно используется для обозначения кисломолочных продуктов, отличных от йогуртов. Впрочем, в зависимости от страны эти продукты могут иметь разные названия, такие как, например, «кефир», «кумыс», «ласси», «дахи», «лебен», «фильмйолк», «вилли», «ацидофильное молоко».
Когда речь идет о кисломолочных продуктах, количество свободной молочной кислоты, содержащейся в сбраживаемом молочном субстрате, не должно быть ниже 0,6 г на 100 г в момент продажи потребителю, а содержание белка по отношению к молочной части продукта не должно быть ниже этого показателя у обычного молока.
И, наконец, под названием «творог» или «творожный сырок» в контексте настоящей заявки понимают незрелый несоленый сыр, который был подвергнут сбраживанию под действием только молочнокислых бактерий (и никакому другому брожению, кроме молочнокислого брожения). Содержание сухого вещества в твороге может быть снижено до 15 г или 10 г на 100 г творога в зависимости от того, превышает ли содержание жира в нем 20 г, или самое большее равно 20 г на 100 г творога после полного высушивания. Содержание сухого вещества в твороге составляет от 13 до 20%. Содержание сухого вещества в творожном сырке составляет не менее 23 г на 100 г творожного сырка. Как правило, этот показатель составляет от 25 до 30%. Творог и творожные сырки обычно объединяют под названием «творожные продукты», которое традиционно используется в технической области настоящего изобретения.
По седьмому аспекту настоящее изобретение относится к использованию, по меньшей мере, одного варианта и/или, по меньшей мере, одной закваски согласно описанию выше для приготовления пищевого продукта, обогащенного витамином K2.
Предпочтительно такой пищевой продукт, обогащенный витамином K2, увеличивает прочность костей человека, который его потребляет. Предпочтительно, этот человек - ребенок.
Очевидно, что настоящее изобретение не ограничивается только приведенным выше описанием. Из прочтения примеров ниже, которые приведены здесь исключительно как иллюстративный материал, могут вытекать другие способы осуществления и преимущества изобретения.
ПРИМЕРЫ
В качестве предварительных замечаний следует отметить, что описанные ниже процедуры получения вариантов применимы к любому типу исходных штаммов молочнокислых бактерий. В зависимости от исходных штаммов, которые будут использованы специалистом, специалист может столкнуться с необходимостью в основном из практических соображений изменить некоторые экспериментальные условия, отработанные изобретателями. В любом случае, те изменения, которые сможет внести специалист в описанные ниже процедуры, будут второстепенными и потребуют только обычных простых манипуляций, не предусматривающих никакой изобретательской деятельности.
I. Получение и использование вариантов, устойчивых к бацитрацину.
Несмотря на известный факт, что воздействие таких веществ, как бацитрацин или перекись, позволяет провести отбор штаммов бактерий, обладающих повышенной устойчивостью к этим веществам, в литературе никогда не отмечалась связь между устойчивостью к бацитрацину или перекиси и уровнем выработки витамина K2 бактериями.
В ходе своей работы изобретатели совершенно неожиданно открыли, что бактерии способны развивать оригинальный механизм устойчивости к некоторым веществам, таким как бацитрацин или перекись, который влечет за собой увеличение выработки витамина K2. Изобретатели решили воспользоваться этим открытием для получения с помощью бацитрацина или перекиси, к примеру, в качестве селекционного фактора, вариантов штаммов молочнокислых бактерий (в частности, Lactococcus lactis), способных продуцировать повышенное количество витамина K2.
I-1. Процедура получения вариантов, устойчивых к бацитрацину.
Предварительная культура была получена на базе кристалла штамма Lactococcus lactis в присутствии 2 мл традиционной промышленной культуральной среды M17 (среда M17, Difco™) с добавлением лактозы из расчета 5 г/л (ниже, среды M17 Лак) и гемина (20 мкл/мл) (ниже, среды M17 Лак + гемин). Инкубация проводилась при перемешивании при 30°С.
Предварительная культура использовалась для засева 2 мл среды M17 Лак + гемин с добавлением бацитрацина (4 мкг/мл). Норма засева составила 1%. После этого культуру инкубировали в течение 48 ч при перемешивании при 30°C.
Затем 100 мкл этой суспензии было помещено на агар-агар из среды M17 Лак. В центр чашки Петри был помещен бумажный диск, пропитанный 2,5 мг бацитрацина. Агар-агар инкубировали в течение 48 ч при 30°C. Клоны, образовавшиеся по соседству с бумажным диском, культивировали в присутствии бацитрацина (4 мкг/мл) в 2 мл среды M17 Лак + гемин. Инкубацию проводили в течение 24 ч при перемешивании при 30°С.
Клетки были изолированы на агар-агар из среды M17 Лак в присутствии бацитрацина (2 мкг/мл) после инкубации в течение 48 ч при 30°C. Изолированные клоны культивировали в среде M17 Лак + гемин, затем инкубировали в течение 24 ч при перемешивании при 30°C. Эта суспензия была использована для получения замороженного запаса.
Эти эксперименты позволили изобретателям провести селекцию варианта Lactococcus lactis subsp. cremoris I-3557, который был депонирован в CNCM 20.01.2006 г.
I-2. Процедура осуществления образца молочного продукта с вариантом «бацитрацин»
Предварительная культура была получена на базе кристалла штамма в 2 мл среды M17 Лак.
Предварительная культура использовалась для засева 50 мл цельного молока, стерилизованного при сверхвысокой температуре, при норме засева 1%, которое затем инкубировали при 30°С в течение 24 час.
В таблице II ниже представлены данные о содержании витамина K2, выраженного в мкг-экв. МК-4/100 г продукта, для варианта, устойчивого к бацитрацину, и соответствующего дикого штамма.
Таким образом, устойчивый к бацитрацину вариант продуцирует в 3 раза больше витамина K при сравнении его с исходным диким штаммом.
II. Получение и использование вариантов, устойчивых к перекиси.
Сравнительно недавно было показано наличие дыхания у Lactococcus lactis (Duwat et al., 2001). Анализ последовательностей в геноме штамма L. lactis (IL1403) подтвердил присутствие генов, кодирующих функции, необходимые для аэробного дыхания (Bolotin et al., 2001). Действительно, L. lactis обладает оперонами men и cytABCD, которые кодируют белки, необходимые для синтеза менахинона и для биогенеза цитохрома D. Этот вид также обладает тремя генами, вовлеченными в последние этапы синтеза гема (hemH, hemK и hemN, которые требуются при окислении порфирина для присоединения железа к гему), но не имеет генов, участвующих в первых этапах этого процесса. Однако L. lactis способен осуществлять окислительное фосфорилирование в присутствии протопорфириногена.
Было также показано, что L. lactis может дышать в присутствии кислорода и гема в культуральной среде. Такое дыхание позволяет клеткам достигать большей биомассы, а наблюдаемый окончательный уровень pH более высокий по сравнению с обычно получаемым уровнем. Культуры в присутствии кислорода и/или гема позволяют получать сравнимые кривые роста в течение примерно 6 или 7 первых часов брожения. Затем потребление глюкозы снижается у культур в присутствии кислорода и гема, и поэтому выработка лактата становится меньше. Это служит отображением «сдвига» метаболизма, который происходит достаточно поздно при культивировании. Таким образом, дыхание L. lactis происходит в конце экспоненциальной фазы роста (Duwat et al., 2001).
Еще неизвестно, какую роль играет дыхание L. lactis, равно как и то, какую роль может играть витамин K2 у этого вида с метаболизмом скорее ферментативного типа. Кроме того, изобретатели отметили, что штаммы L. Lactis продуцировали витамин K2, несмотря на то, что в исследованных условиях дыхание не было вызвано (отсутствие гема в среде и отсутствие перемешивания, обеспечивающего хорошее насыщение среды кислородом).
В отличие от внеклеточных белков, у белков в цитоплазме имеется очень малое число серных мостиков. Существует широко распространенная ферментная система, которая позволяет ограничить число серных мостиков. Количество связей S-S уменьшается в зависимости от SH при посредстве фермента тиоредоксина. Этот фермент восстанавливается тиоредоксин редуктазой. Vido et al. (2005) создали методом генной инженерии мутант trxB1 вида L. lactis. Ген trxBl кодирует тиоредоксин редуктазу. Изучение при помощи двумерного электрофореза белков, синтезированных этим мутантом, показало, что он продуцирует повышенное количество некоторых ферментов, участвующих в синтезе витамина K2, а именно ферментов MenB и MenD.
В свете этих данных, а также на основании собственных наблюдений изобретатели предположили, что один из возможных путей повышения выработки витамина K2 бактериями L. lactis может состоять в стимулировании дыхания. Другой путь может заключаться в том, чтобы попытаться мобилизовать витамин K2 в ответ на окислительный стресс.
Поэтому изобретатели стремились получить варианты, устойчивые к окислительному стрессу. Следует отметить, что полученные варианты не проявляли повышенной экспрессии оперона Men.
II-1. Процедура получения вариантов, устойчивых к окислительному стрессу
В качестве окислителя, который можно использовать, была выбрана перекись. Разумеется, что в аналогичных условиях можно было использовать другие окислители, такие как ионы хлорной кислоты, ионы двухвалентного железа, менадион, паракват, кислород или любое другое подходящее окислительное соединение.
После предварительного культивирования на среде M17 Лак исходные штаммы были пересажены на ту же среду, содержащую перекись в возрастающей концентрации (например, ряд концентраций, по меньшей мере, примерно от 20 до, по меньшей мере, примерно 25, 27, 28,5 мг/л). Культуры инкубировали при 30°C. После 24 часов первые пробирки ряда концентраций, в которых не было признаков роста, были вновь помещены на инкубацию еще на 24 часа дополнительно. После этого клоны были изолированы на агаровую среду путем экстрагирования. Был отобран один клон из варианта с концентрацией перекиси 27 мг/л. Изобретатели отметили, что при концентрации перекиси свыше 28,5 мг/л рост бактерий отсутствовал.
Эти эксперименты также позволили изобретателям провести селекцию варианта Lactococcus lactis subsp. cremoris 1-3558, который был депонирован в CNCM 20.01.2006 г.
II-2. Процедура осуществления образца молочного продукта с вариантом «перекись».
Выбранный клон был помещен для роста в цельное молоко на 24 часа. После этого были отобраны образцы и заморожены при -80°C для последующего определения количества K. В таблице III ниже приведены данные о количестве витамина K2, которое продуцирует вариант, устойчивый к перекиси в сравнении с количеством, продуцируемым исходным штаммом (количество выражено в мкг-экв. МК-4/100 г сквашенного молока).
Как следует из таблицы III выше, вариант продуцирует примерно в два раза больше витамина K2, чем соответствующий дикий штамм.
III. Генотипическая характеристика естественных вариантов I-3557 и I-3558
III-1 - Материалы и методы
Штаммы культивировали ночью при 30°C на среде M17 Лактоза. Выпускаемое для продажи цельное молоко было засеяно каждым из штаммов из расчета 1% предварительной культуры. Засеянное молоко было разлито по пробиркам на 12 мл. Процесс брожения останавливали на целевом этапе физиологического развития, на экспоненциальной фазе роста или на фазе замедления, путем погружения пробирок в жидкий азот. После этого пробирки хранили при -80°С до использования. Предшествующие опыты показали, что витамин K продуцируется, главным образом, во время фазы замедления (данные не приведены).
- Экстрагирование всей РНК
Все образцы были подвергнуты одинаковой обработке.
Эти образцы были разморожены в присутствии реагента, защищающего РНК (Qiagen - артикул 76506), для предупреждения разложения РНК. Клетки из этих образцов были получены путем центрифугирования.
Затем РНК из клеток каждого образца была выделена с помощью шаровой мельницы для клеток Mixer Mill ММ300 (Qiagen) (Biospec Products - артикул 11079101z, Цирконий/кремниевые шарики диаметром 0,1 мм) в присутствии тризола (Trizol®) (Invitrogen - артикул 15596-026). После этого методом спектрофотометрии была определена концентрация и степень чистоты (230/260 и 260/280 нм) РНК с помощью спектрофотометра ND-1000 Nanodrop® (Nanodrop Technologies). Качество РНК (RIN, отношение 16/23 S) также было проверено с помощью программного обеспечения биоанализатора 2100, версия В.02.05 (Agilent Technologies) и наборов РНК 6000 серия II Nano (Agilent Technologies - артикул 5067-1511).
- Маркировка иРНК и гибридизация на ДНК-чипе
Мишени были синтезированы путем обратной транскрипции иРНК с использованием тех же специфических праймеров обратных транскриптаз, которые были использованы для синтеза продуктов полимеразной цепной реакции (ПЦР) на ДНК-чипах. Эта прямая маркировка была выполнена компанией Еурогентек (Eurogentec) с помощью набора CyScribe dCTP для системы маркировки первой цепочки кДНК / очистки CyScribe GFX (Amersham - артикул RPN6202X) и флюоресцентных молекул, сцепленных с нуклеотидами Cy3-dCTP / Cy5-dCTP (Perkin Elmer - артикул NEL576 / NEL577).
Гибридизация маркированных мишеней на ДНК-чипах с продуктами ПЦР штамма Lactococcus lactis cremoris MG1363 (последовательность имеется в Национальном центре биотехнологической информации) была выполнена компанией Еурогентек (Eurogentec), которая сама производит и продает эти ДНК-чипы. Эта компания использовала традиционную процедуру гибридизации и промывания (гибридизационный буфер Eurogentec - артикул AR-HYB-01, инкубация ночью при 42°С в установке для гибридизации Advalytix Slidebooster SB800 - Implen, промывание ДНК-чипов, гибридизованных в буфере 0,2Х SSC/0,1% SDS в течение 5 мин при перемешивании при комнатной температуре, затем ополаскивание в буфере 0,2Х SSC в течение 5 мин при комнатной температуре при помешивании время от времени, затем высушивание ДНК-чипов путем центрифугирования при 1000 об/мин, в течение 5 мин).
Получение данных о гибридизации было выполнено компанией Еурогентек с помощью сканера Axon 4100A и программного обеспечения GenePix Pro 5.1 (Axon Instruments). После этого компания Еурогентек направила результаты сканирования гибридизованных ДНК-чипов изобретателям.
- Обработка данных
Численные результаты сканирования гибридизованных ДНК-чипов были получены изобретателями с помощью программного обеспечения GenePix Pro 6.0.
Эти первые численные результаты были статистически обработаны с помощью программного обеспечения MANGO, разработанного Транскрипционной платформой GODMAP Национального центра научных исследований в Гиф-сюр-Иветт (91) для получения существенных соотношений экспрессии; при этом каждое пятно соответствовало гену, который был дуплицирован на ДНК-чипах, а каждый биологический опыт был проведен в трех повторностях с включением инверсии маркировки (DyeSwap) с целью ограничения смещения при включении флюоресцентных молекул, сцепленных с нуклеотидами, таким образом, было получено по шесть пластинок на группу для сравнения.
Соотношения дифференцирующей экспрессии отбирали по критериям воспроизводимости, таким как показатель p (<0,01), скорректированный относительно величины среднего шумового фона и по величине соотношений экспрессии (r>2,00 и r<2,00).
III-2 - Результаты
Оба варианта продемонстрировали сходные результаты по экспрессии некоторых генов. Большинство генов, обследованных в опытах, были связаны с окислительно-восстановительными функциями клетки и, более конкретно с кластерами Fe-S. В этой связи, оказался измененным метаболизм метионина и цистеина, а также транспорт железа. Оказалась измененной и экспрессия многих ферментов, вовлеченных в механизмы защиты от окислительного стресса: тиоредоксин Н, тиоредоксин В1, НАДН дегидрогеназа, НАД(Н) дегидрогеназы, глутатион пероксидаза.
Во время экспоненциальной фазы отмечено повышение экспрессии некоторых ферментов, вовлеченных в дыхание L. lactis: фумарат редуктазы (frdC) и цитохром оксидазы (cydD). По всей видимости, также оказался измененным метаболизм пуриновых оснований.
В таблице IV ниже представлены соотношения экспрессии некоторых генов и проведено сравнение между вариантами и диким штаммов в фазе замедления.
В таблице V ниже представлены соотношения экспрессии генов у вариантов в сравнении с диким штаммов в экспоненциальной фазе роста.
Источники информации
Настоящее изобретение относится к биотехнологии. Способ получения варианта штамма Lactococcus lactis, который продуцирует в стандартных условиях брожения количество витамина K2, превышающее, по меньшей мере, примерно в 1,2 раза то количество, которое продуцирует исходный/родительский штамм бактерий, культивируемый в тех же условиях, где упомянутый способ включает, по меньшей мере: a) культивирование исходного штамма бактерий в стандартных условиях брожения на культуральной среде, вызывающей изменение окислительно-восстановительного состояния клетки, содержащей бацитрацин или перекись; и b) отбор варианта штамма, если он продуцирует, по меньшей мере, примерно в 1,2 раза больше витамина K2, чем исходный/родительский штамм бактерий, культивируемый в тех же условиях. Штамм Lactococcus lactis subsp. cremoris 1-3557, депонированный в коллекции CNCN Института Пастера 20.01.2006, и штамм Lactococcus lactis subsp. cremoris 1-3558, депонированный в коллекции CNCM Института Пастера 20.01.2006, продуцируют, по меньшей мере, примерно в 1,2 раза больше витамина K2, чем исходный штамм бактерий, культивируемый в тех же условиях. Изобретение также относится к молочнокислой закваске содержащей, по меньшей мере, один указанный выше штамм, к способу приготовления кисломолочного продукта, содержащему указанный выше штамм и/или молочнокислую закваску. Изобретение позволяет повысить содержание витамина K2 в продукте. 10 н. и 1 з.п. ф-лы, 5 табл.
1. Способ получения варианта штамма Lactococcus lactis, который продуцирует в стандартных условиях брожения количество витамина К2, превышающее, по меньшей мере, примерно в 1,2 раза то количество, которое продуцирует исходный/родительский штамм бактерий, культивируемый в тех же условиях, где упомянутый способ включает, по меньшей мере:
a) культивирование исходного штамма бактерий в стандартных условиях брожения на культуральной среде, вызывающей изменение окислительно-восстановительного состояния клетки, содержащей бацитрацин или перекись; и
b) отбор варианта штамма, если он продуцирует, по меньшей мере, примерно в 1,2 раза больше витамина К2, чем исходный/родительский штамм бактерий, культивируемый в тех же условиях.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что экспрессия, по меньшей мере, одного гена, выбранного из числа генов №1 - 27, перечисленных ниже:
у варианта изменена в сравнении с исходным штаммом бактерий, а именно экспрессия, по меньшей мере, одного гена, выбранного из числа генов №1-15, у варианта увеличивается по сравнению с исходным штаммом бактерий, а экспрессия, по меньшей мере, одного гена, выбранного из числа генов №16-27, у варианта уменьшается по сравнению с исходным штаммом бактерий.
3. Штамм Lactococcus lactis subsp. cremoris 1-3557, депонированный в коллекции CNCN Института Пастера 20.01.2006, являющийся вариантом исходного штамма, продуцирующий, по меньшей мере, примерно в 1,2 раза больше витамина К2, чем исходный штамм бактерий, культивируемый в тех же условиях.
4. Штамм Lactococcus lactis subsp. cremoris 1-3558, депонированный в коллекции CNCM Института Пастера 20.01.2006, являющийся вариантом исходного штамма, продуцирующий, по меньшей мере, примерно в 1,2 раза больше витамина К2, чем исходный штамм бактерий, культивируемый в тех же условиях.
5. Применение бацитрацина для отбора вариантов штаммов Lactococcus lactis, которые продуцируют в стандартных условиях брожения количество витамина К2, превышающее, по меньшей мере, примерно в 1,2 раза количество витамина, продуцируемое исходным штаммом, культивируемым в тех же условиях.
6. Применение перекиси для отбора вариантов штаммов Lactococcus lactis, которые продуцируют в стандартных условиях брожения количество витамина К2, превышающее, по меньшей мере, примерно в 1,2 раза количество витамина, продуцируемое исходным штаммом, культивируемым в тех же условиях.
7. Молочная закваска, которая включает штамм бактерий по п.3 и/или 4.
8. Способ производства кисломолочного продукта, обогащенного витамином К2, включающий, по меньшей мере:
a) введение штамма бактерий по п.3 и/или 4 и/или закваски по п.7 на промежуточном этапе приготовления упомянутого продукта и
b) получение упомянутого продукта, обогащенного витамином К2.
9. Кисломолочный продукт, обогащенный витамином К2, который получен способом по п.8.
10. Применение штамма бактерий по п.3 и/или 4 и/или закваски по п.7 для приготовления кисломолочного продукта, обогащенного витамином К2.
11. Применение кисломолочного продукта, содержащего штамм бактерий по п.3 и/или 4 и/или закваски по п.7 для увеличения прочности костей у потребителей.
| MORISHTA Т | |||
| et al | |||
| Production of menaquinones by lactis acid bacteria // J | |||
| Dairy | |||
| Sci., 1999 | |||
| Машина для разделения сыпучих материалов и размещения их в приемники | 0 |
|
SU82A1 |
| JP 2000287676, 17.10.2000 | |||
| YOSHINORI THUKAMOTO et al | |||
| Аппарат для очищения воды при помощи химических реактивов | 1917 |
|
SU2A1 |
| ШТАММ БАКТЕРИЙ LACTOCOCCUS LACTIS ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ТВОРОГА ИЗ МОЛОКА | 2003 |
|
RU2244002C1 |
