ШТАММ БАКТЕРИЙ LACTOCOCCUS LACTIS ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ТВОРОГА ИЗ МОЛОКА Российский патент 2005 года по МПК C12N1/20 A23C19/76 C12N1/20 C12R1/00 

Бактерии Lactococcus lactis давно используют в качестве заквасок для получения молочнокислых продуктов и, в частности, творога из молока. Закваски в зависимости от состава можно разделить на моноштаммовые (монозакваски), когда для приготовления закваски используют только один штамм, и полиштаммовые (полизакваски), когда в состав закваски входят несколько штаммов.

Одной из проблем, возникающих при сквашивании молока с помощью бактериальных заквасок L. lactis, является фаголизис, т.е. лизис бактерий под действием лактофагов (вирусов бактерий L. lactis). В этом случае закваска испорчена и желаемый продукт не может быть получен. Для того чтобы избежать подобной ситуации, в промышленности используют фагоустойчивые штаммы. Однако полностью преодолеть проблему фаголизиса таким образом не удается, т.к. помимо фагов, попадающих в емкости для сквашивания молока извне, фаги могут существовать в клетках самих бактерий в латентной (скрытой) форме и не проявляться в обычных условиях. В условиях стресса, связанного с повышением температуры в ходе технологического процесса, возможен выход свободного фага и отбор фагочувствительных бактериальных мутантов. Вид бактерий L. lactis отличается высокой изменчивостью свойств [2] и большим разнообразием лактофагов [3, 4]. Таким образом, желательно, чтобы используемый в промышленности штамм имел устойчивость ко всем или хотя бы к основным известным фагам.

В случае полиштаммовых заквасок, если заражение хотя бы одного из штаммов, используемых в закваске, происходит, то штамм, поддерживающий рост лактофагов, исключается из закваски и заменяется другим [5].

В связи с этим стоит задача получать новые фагоустойчивые штаммы, расширяя арсенал уже имеющихся, и иметь в распоряжении коллекцию штаммов, которые в любой момент могут быть использованы для замены подвергнувшихся фаголизису как в моноштаммовых, так и в полиштаммовых заквасках. Новые штаммы могут быть получены отбором спонтанных мутантов [6], а также после обработки мутагенами [7]. Есть попытки создания генноинженерных вариантов [5].

При выборе штаммов для заквасок наиболее важными и решающими производственными характеристиками являются эффективность сквашивания бактериями молока и органолептические свойства конечного продукта [1, с.274]. При составлении закваски для творога вводят штаммы, сообщающие продукту хорошие вкус и запах, образующие сгустки, легко отделяющие сыворотку [1, с.276]. Эти характеристики обеспечиваются либо совокупностью свойств штаммов, входящих в полизакваску, либо свойствами одного штамма, если его используют в качестве монозакваски.

В настоящее время в промышленности в основном используют полизакваски [7, 1, с.275,], однако существует интерес к использованию монозаквасок. Их применение способствует длительному использованию специализированых штаммов [8], а также уменьшению разнообразия фагов на производстве [9].

В мировой практике изучения бактерий L. lactis с целью использования их в качестве монозакваски известна работа Э. Дурмаз и Т. Клаенхаммера [5]. В этой работе генноинженерными методами сконструирован фагоустойчивый штамм L. lactis. Этот штамм рассмотрен нами в качестве ближайшего аналога. Он устойчив к следующим бактериофагам: ϕ31 (вид Р335), ϕ37.7 (производный ϕ31), u136 и композиция производственных фагов, содержащая 10 независимых лизатов [5]. Однако данный штамм обладает недостаточной эффективностью сквашивания молока, которую авторы определяли по накоплению молочной кислоты и оценивали на основании изменения рН. Измеряемое значение рН не опускалось ниже 5,1.

Задача заявляемого изобретения: получить без применения мутагенов и генетических манипуляций устойчивый к широкому кругу лактофагов штамм Lactococcus lactis, который можно использовать в качестве монозакваски для эффективного сквашивания молока.

Задачу решают путем получения штамма Lactococcus lactis TB2, депонированного во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов под номером ВКПМ В-8354.

Заявляемый штамм является природным. Он выделен из самоквасного творога.

Характеристика штамма Lactococcus lactis ВКПМ В-8354.

1. Морфологические признаки штамма ВКПМ В-8354. Клетки овальные, неподвижные, располагаются в виде диплококков или коротких цепочек, грамположительные, эндоспор не образуют, факультативные анаэробы. Растут на органических средах. На поверхности агара с гидролизованным молоком, и синтетических сред М21 и М02 (табл.1) через 24 часа при 28-30°С образуют белые, выпуклые, гладкие колонии с ровными краями.

2. Видовую принадлежность штамма ВКПМ В-8354 определяли на основании ГЦ-состава и уровню ДНК-ДНК гибридизации [10]. Ранее [11] был определен ГЦ состав чувствительного к лактофагам штамма ВКПМ В-6886, равный 36,3 мол.%. ГЦ-состав заявляемого штамма равен 36,7 мол.%. Ошибка определения составляет 0,2-0,3%. Поскольку этот показатель для вида Lactococcus lactis может изменяться в пределах 35-37 мол.%, то, следовательно, штамм ВКПМ В-8354 может быть отнесен к виду Lactococcus lactis. Этот вывод подтверждается высоким уровнем ДНК-ДНК гибридизации, равным 93%, со штаммом ВКПМ В-8548, который является фузидинустойчивым мутантом чувствительного к лактофагам штамма ВКПМ В-6886.

3. Заявляемый штамм ВКПМ В-8354 получен без применения мутагенов и генетических манипуляций и устойчив к следующим бактериофагам: подгруппа В1-U33A, U88A и U50A; подгруппа В2-U13A, U14, U15A, U27A, U55A, U80A, U87A, Р001, а также лактофагам R10, R103 и С7.

4. Штамм ВКПМ В-8354 эффективно (до рН 4,6-4,8) сквашивает молоко различной жирности (от 1,5% до 20%), разных торговых марок и способов термической обработки. Он позволяет получить в качестве конечного продукта творог гомогенной консистенции и некислого вкуса, с приятными органолептическими свойствами. Выход готового творога от 263 до 750 грамм из литра молока.

Перечень фигур, иллюстрирующих изобретение.

Фиг.1. Кривая роста заявляемого штамма.

1- ВКПМ В-8354; 2 - ВКПМ В-6920.

На графиках представлены средние результаты измерений в трех независимых опытах.

Фиг.2. Изменение значения рН при росте бактерий штаммов ВКПМ В-8354 и ВКПМ В-6920 в молоке различных жирности, производителя и термической обработки.

1-1 - штамм ВКПМ В-8354; молоко "Домик в деревне" (стерилизованное) 6%;

1-2 - штамм ВКПМ В-6920; молоко "Домик в деревне" (стерилизованное) 6%;

2-1 - штамм ВКПМ В-8354; молоко "Свято Мир" (пастеризованное) 3,2%;

2-2 - штамм ВКПМ В-6920; молоко "Свято Мир" (пастеризованное) 3,2%;

3-1 - штамм ВКПМ В-8354; молоко "Лианозовское" (стерилизованное) 1,5%;

3-2 - штамм ВКПМ В-6920; молоко "Лианозовское" (стерилизованное) 1,5%.

Изобретение подтверждено следующими примерами.

Пример 1. Устойчивость заявляемого штамма к лактофагам.

С целью проверки штамма ВКПМ В-8354 на устойчивость к различным лактофагам нами были использованы фаги, полученные из коллекции НПО "Углич" [4]. Показано, что они относятся к группе В по классификации Бредли и что среди них часть принадлежит подгруппе В1, а другая часть подгруппе В2 по классификации Аккермана. Для теста на фагоустойчивость были взяты следующие фаги: подгруппа В1 - U33A, U88A и U50A; подгруппа В2 - U13A, U14, U15A, U27A, U55A, U80A, U87A, Р001, а также лактофаги R10, R103 и С7, хранящиеся в ВКПМ (РН-738, РН-736, РН-730). Бактерии штамма ВКПМ В-8354 выращивали на чашках Петри с агаризованной средой М02 (табл.1). Выросшие бактерии собирали петлей (~0,5 петли) в 0,3 мл физиологического раствора и рессуспендировали. Далее бактерии смешивали с агаризованной средой М02, разбавленной физиологическим раствором до концентрации агара 0,7%, и тонким слоем этой суспензии бактерий заливали чашки со средой М02. После того как верхний слой застынет, на его поверхность наносили капли с фаговой суспензией (титр фага 10⁷-10⁸). Чашки Петри инкубировали ночь при 30°С. На газоне штамма ВКПМ В-8354 не было обнаружено пятен лизиса, тогда как на контрольном газоне с бактериями фагочувствительного штамма ВКПМ В-8548 наблюдался рост всех фагов.

Таким образом, заявляемый штамм ВКПМ В-8354 является устойчивым ко всем вышеназванным лактофагам, представляющим собой широкий круг фагов, распространенных на предприятиях молочной промышленности.

Пример 2. Накопление биомассы в колониях и слабая зависимость роста заявляемого штамма от компонентного состава среды.

Уровень накопления биомассы оценивали по площади колоний, посчитанной на основании их сканированного изображения при помощи программы Total Lab v201. Бактерии заявляемого штамма ВКПМ В-8354 и взятого для контроля производственного фагоустойчивого штамма ВКПМ В-6920 рассевали до отдельных колоний на питательных средах М02 и М03 (табл.1) и инкубировали при 30°С 24 часа. Результаты компьютерной оценки площади колоний и их среднее значение на данной чашке Петри, выраженные в мм², представлены в табл. 2. После 24 часов инкубации средняя площадь колоний контрольного штамма, по сравнению с заявляемым, составляла только 66% и, следовательно, была меньше на 34%.

При использовании среды М03, в которой отсутствует дрожжевой экстракт, являющийся источником витаминов, средняя площадь колоний заявляемого штамма после 24 часов роста меньше, чем на среде М02 на 2%, тогда как у контрольного штамма она меньше на 74%.

Эти данные указывают на значительную зависимость роста контрольного штамма и относительную независимость роста заявляемого штамма от витаминизированной добавки.

Пример 3. Время генерации заявляемого штамма.

Для определения времени генерации заявляемого штамма ВКПМ В-8354 и контрольного штамма ВКПМ В-6920 использовали биофотометр фирмы BONET-MAURY-JOUAN. Из свежевыросших на среде М02 (табл.1) бактерий готовили в физиологическом растворе густую суспензию. Клетки хорошо рессуспендировали и осаждали центрифугированием (Eppendorf). Отмытые клетки снова рессуспендировали в 80 мкл и разводили в 10 раз в физиологическом растворе. Суспензию бактерий по 100 мкл добавляли в кюветы биофотометра, содержащие по 6 мл среды М22 (табл.1) и измеряли исходную оптическую плотность. Далее, каждый час отмечали значение изменяющейся в процессе роста клеток оптической плотности. На фиг.1 представлены графики, на основании которых определено время генерации заявляемого штамма ВКПМ В-8354 и контрольного штамма ВКПМ В-6920, т.е. время, необходимое клеткам для удвоения. Его значение определяют как соответствующее увеличению оптической плотности бактериальной суспензии вдвое в период их наиболее интенсивного логарифмического роста. Оно равно соответственно 35 и 51 минутам. Следовательно, время генерации заявляемого штамма короче времени генерации контрольного штамма на 16 минут.

Пример. 4. Изменение величины рН в процессе сквашивания молока различной жирности заявляемым штаммом.

Закисление молока в процессе роста заявляемого штамма ВКПМ В-8354 и контрольного штамма ВКПМ В-6920 характеризовали по изменению рН. Для проведения опыта было использовано молоко различной жирности, торговых марок и термической обработки. Перед началом опыта каждый из 6 литров молока: "Домик в деревне" (стерилизованное) 6%; "Свято Мир" (пастеризованное) 3,2%; "Лианозовское" (стерилизованное) 1,5%, был перелит в литровую банку, закрыт, выдержан 20 минут в кипящей водяной бане и охлажден до комнатной температуры. Закваску готовили, засевая 10 мл молока (10% сухое молоко) бактериями, взятыми из отдельной колонии со среды М02. После добавления 1% закваски банки с молоком ставили в термостат на 30°С и значение рН измеряли в пробах (2 мл), отбираемых через 0, 4, 6, 9, 12, 14, 15 и 28 часов после начала опыта. Результаты измерения рН представлены на фиг.2. Из них видно, что заявляемый штамм ВКПМ В-8354 закисляет любой тип использованного молока более эффективно, чем контрольный штамм ВКПМ В-6920. Способ получения молочно-белкового сгустка предусматривает доведение кислотности молока до рН 4,6-4,8 [12]. Заявляемый штамм достигает этого уровня за 9 часов инкубации в условиях нашего опыта. Сгусток молока образуется между 8 и 9 часами и имеет плотную консистенцию. Контрольный штамм в тех же условиях не может самостоятельно закислить молоко до необходимого значения рН, однако, при использовании соответствующих технологических схем [12] может быть использован на производстве.

Полученные результаты позволяют сделать вывод о возможности использования заявляемого штамма в качестве монозакваски для эффективного сквашивания молока различных жирности (от 1,5% до 20%), торговых марок ("Домик в деревне", "Свято Мир" "Лианозовское") и способа термической обработки (стерилизация или пастеризация).

Пример 5. Получение творога с использованием заявляемого штамма.

Для приготовления творога использовали сгусток молока, полученный, как описано в примере 4. В качестве контроля был взят штамм ВКПМ В-6920. Стеклянные литровые банки, содержащие молочный сгусток, прогревали в кипящей водяной бане в течение 20 минут, до отделения сыворотки от сгустка. Далее следовало медленное охлаждение продукта до комнатной температуры и отделение сыворотки путем отбрасывания его на марлю. Готовый творог взвешивали и характеризовали его органолептически. Результаты взвешивания представлены в таблице 3. Выход творога при использовании заявляемого штамма был выше во всех трех вариантах по сравнению с контрольным. Максимальный вес творога, полученного штаммом ВКПМ В-8354 из 20% сливок, достигал 750 г готового продукта на литр.

Органолептика показала, что творог, полученный с помощью заявляемого штамма, обладает некислым приятным вкусом и имеет гомогенную консистенцию.

Заявляемый штамм Lactococcus lactis ВКПМ В-8354 получен без применения химических мутагенов и не является генетически модифицированным. Он устойчив к широкому кругу лактофагов, распространенных на предприятиях молочной промышленности. Штамм эффективно сквашивает молоко различных торговых марок, широкого диапозона жирности и разного способа термической обработки. Индивидуальные особенности штамма позволяют использовать его в качестве моноштаммовой закваски. Творог, полученный с использованием заявляемого штамма, имеет хорошие органолептические качества. Такие свойства творога, как некислый вкус и гомогенная консистенция, востребованы в современных условиях, т.к. необходимы для приготовления различных творожных смесей, в том числе десертных. Штамм особенно удобен для предприятий с небольшим объемом производства, но разнообразным ассортиментом.

Использованные источники информации.

1. Степаненко П.П. Микробиология молока и молочных продуктов:

Учебник для ВУЗов. - Сергиев Посад: ООО "Все для Вас - Подмосковье". 1999.

2. Journal Bacteriology 2000, 182(9):2481-91.

3. Canadian Journal Microbiology 1992, 38:875-882.

4. Биотехнология 1992, 6: 40-45.

5. Applied And Environmental Microbiology 1995, 61(4): 1266-1273.

6. Авторское свидетельство СССР 938893.

7. Авторское свидетельство СССР 1486141.

8. Applied And Environmental Microbiology 1993, 59: 365-372.

9. Journal Dairy Science 1981, 64: 2270-2277.

10. Микробиология 1997, 66(2): 233-236.

11. FEMS Microbiology Review 2001, 25: 39-67.

12. Авторское свидетельство СССР 404459.

Изобретение относится к биотехнологии. Штамм бактерий Lactococcus lactis ВКПМ В-8354 получен без применения мутагенов и генетических манипуляций, является устойчивым к широкому кругу лактофагов. Он эффективно сквашивает молоко различных торговых марок широкого диапазона жирности и разного способа термической обработки. Индивидуальные особенности штамма позволяют использовать его в качестве моноштаммовой закваски. Творог, полученный с использованием штамма L. lactis ВКПМ В-8354, имеет хорошие органолептические качества, некислый вкус и гомогенную консистенцию. Штамм особенно удобен для предприятий с небольшим объемом производства, но разнообразным ассортиментом. 2 ил., 3 табл.

Штамм бактерий Lactococcus lactis ВКПМ В-8354 для получения творога из молока.