СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ОТНОСИТЕЛЬНОЙ УСТОЙЧИВОСТИ СОРТОВ МЯГКОЙ ЯРОВОЙ ПШЕНИЦЫ К ХЛОРИДНОМУ ЗАСОЛЕНИЮ Российский патент 2012 года по МПК A01G7/00 A01G1/00 A01H1/04 

Предлагаемое изобретение относится к области сельского хозяйства, в частности к биофизическим способам оценки устойчивости растений, и может быть использовано для эффективной массовой оценки селекционного материала мягкой яровой пшеницы на устойчивость к хлоридному засолению в лабораторных условиях.

Известен способ определения солеустойчивости растений, основанный на регистрации электроемкости корней растений, выдержанных в растворах солей, и электроемкости корней, не обработанных солями. О степени солеустойчивости растений судят по разности значений емкости между обработанными и необработанными корнями. Чем больше разница, тем менее устойчиво растение к действию солей (см. а.с. СССР №599766, М.кл. A01G 7/00, 1978). Однако данный способ не дает необходимой дифференциации между близкородственными генотипами мягкой яровой пшеницы и для его реализации требуется специально разработанная аппаратура.

Известен способ оценки солеустойчивости растений по измерению электрического сопротивления листьев растений. Устойчивость к засолению оценивают по изменению данного показателя растений, произрастающих на засоленном субстрате и в оптимальных условиях роста. Чем меньше изменяется сопротивление, тем выше солеустойчивость растений (см. патент РФ №2017408, МПК А01Н 1/04, 1994). Однако данный способ не позволяет дифференцировать относительную солеустойчивость сортов мягкой яровой пшеницы, так как известно, что дифференцирующая концентрация солей определена в диапазоне 7-10 ат для зерновых культур и 9-13 ат для пшеницы (см. Диагностика устойчивости растений к стрессовым воздействиям: Методическое руководство / Под ред. Г.В.Удовенко. - Ленинград, 1988. - С.86-89).

Известны прямые способы определения солеустойчивости растений - вегетационный метод, технические модификации метода проростков, отличающиеся способом проращивания, условиями засоления и элементами учета показателей. Критерием солеустойчивости служат показатели прорастания семян и морфофизиологические показатели проростков в солевых растворах и водопроводной воде (см. Диагностика устойчивости растений к стрессовым воздействиям: Методическое руководство / Под ред. Г.В.Удовенко. - Ленинград, 1988. - С.86-89). Недостатком известных способов является их значительная трудоемкость, длительность и субъективность оценки.

Наиболее близким по технической сущности к предлагаемому способу (прототипом) является способ оценки солеустойчивости растений методом проростков в рулонной культуре (см Удовенко Г.В., Гончарова Э.А. Эффективные экспресс-методы оценки сортовой и индивидуальной устойчивости растений к экстремальным условиям // Докл. ВАСХНИЛ. - 1982, №7. - С.13-19).

Способ включает проращивание семян растений в рулонной культуре в термостате на водопроводной воде (контроль) и растворах NaCl с осмотическим давлением 7-10 ат (опыт) при температуре 22ºС в течение 7 дней с последующим определением количества проросших семян, длины ростков и корней, сухой массы проростков контрольных (без засоления) и опытных (засоленный фон) вариантов и вычислением показателя солеустойчивости сорта как отношения соответствующих показателей роста проростков с засоленного фона к таковым с незасоленного фона. Однако данный способ не дает достаточной дифференциации между близкородственными генотипами и достаточно трудоемок.

Целью предлагаемого изобретения является ранняя, на стадии проростков, дифференциальная диагностика устойчивости сортов мягкой яровой пшеницы к хлоридному засолению и ускорение селекционного процесса.

Поставленная цель достигается тем, что в известный способ оценки солеустойчивости сортов зерновых культур, включающий проращивание семян растений в рулонной культуре в термостате на водопроводной воде (контроль) и растворах NaCl с осмотическим давлением 7-10 ат (опыт) при температуре 22ºС в течение 7 дней с последующим определением количества проросших семян, длины ростков и корней, сухой массы проростков контрольных (без засоления) и опытных (засоленный фон) вариантов и вычислением показателя солеустойчивости сорта как отношения соответствующих показателей роста проростков с засоленного фона к таковым с незасоленного фона, вводят следующие операции: выращивание проростков в рулонной культуре на водопроводной воде в условиях постоянной освещенности до фазы 2-3 листьев, помещение растений в дистиллированную воду (контроль) и растворы NaCl (9 ат) (опыт) на 24 ч, приготовление путем нарезки из второго листа контрольных и опытных растений образцов, помещение образцов в дистиллированную воду в соотношении 1:20 на 1,5 ч в условия освещения, фильтрацию вытяжек, определение их электропроводности при частоте 1 кГц и дифференцирование сортов по устойчивости - при относительных изменениях проводимости менее чем на 150% сорт включают в группу относительно солеустойчивых сортов.

Предлагаемый способ определения устойчивости сортов мягкой яровой пшеницы к хлоридному засолению осуществляется следующим образом. Отбирают хорошо выполненное без видимых признаков поражения болезнями, вредителями и без механических повреждений зерно пшеницы и для устранения поверхностной сапрофитной и патогенной микрофлоры стерилизуют его этанолом в течение 1 минуты, после чего трижды ополаскивают стерильной дистиллированной водой (см.Wood L.S. Relation of variation in Helminthosporium sativum to seedling blight of small grains // Phytopathology. - 1962, v.52. - P.493-498). Простерилизованное зерно проращивают в термостате в чашках Петри на фильтровальной бумаге, смоченной водой. Затем проросшие семена раскладывают на лентах фильтровальной бумаги, ленты скручивают в рулоны и помещают в кюветы с дистиллированной водой в условия постоянной температуры и освещенности (t=22ºС, влажность 60%, Е=5000 лк). Проростки выращивают до фазы 2-3 листьев. В фазе 2-3 листьев часть растений оставляют в дистиллированной воде (контроль), а часть помещают в растворы NaCl с осмотическим давлением 9 ат (опыт) на 24 ч.

Концентрация действующего раствора хлорида натрия была подобрана опытным путем. Экспериментально было установлено, что при меньших концентрациях NaCl межсортовые различия по электрофизическим параметрам водных вытяжек из тканей могут быть менее выражены (Таблица 1).

Таблица 1 Влияние концентрации действующего раствора хлористого натрия на выход электролитов из листовой ткани проростков яровой пшеницы Сорт К=((G₀-G_K)/G_K)·100% 1 кГц 5 ат (NaCl) 9 ат (NaC)l Новосибирская 22 +111,0 +439,5 Лютесценс 25 +92,3 +346,3 Новосибирская 89 +115,4 +197,8 Коэффициент вариации, % 11,6 37,2 Примечание: G_K - электропроводность настоев листовой ткани растений в контроле; G₀ - электропроводность настоев листовой ткани растений на засоленном фоне (9 ат).

Затем из контрольных и опытных растений готовят образцы.

Подготовка образцов. У проростков отделяют вторые листья, промывают их водопроводной водой, обсушивают фильтровальной бумагой. Для получения экспериментального материала одного физиологического возраста при подготовке образцов берутся листья только одного яруса. Листья контрольных и опытных растений промывают водопроводной водой и обсушивают фильтровальной бумагой. В каждом варианте готовят средний образец. Для этого из средней части листьев лезвием нарезают растительный материал на кусочки длиной 1,5 мм. Такой способ подготовки образцов позволяет получить однородный экспериментальный материал и уменьшить вариацию измеряемых параметров (Таблица 2). Нарезанный растительный материал помещают в капроновый мешочек и промывают под струей водопроводной воды, затем ополаскивают дистиллированной водой. Нарезанную ткань осторожно промокают фильтровальной бумагой и готовят навески, помещают их в стеклянный стаканчик с дистиллированной водой. Экспериментально установлено, что соотношение массы листовой ткани и дистиллированной воды, которая добавляется для получения вытяжек, должно составлять не менее 1:30…1:20. При меньших соотношениях получаемые вытяжки представляют собой сильно разбавленные растворы электролитов (особенно в контрольных вариантах), вследствие чего значительно возрастает вариабельность показателей (Таблица 3).

Ввиду ограниченного количества экспериментального материала, особенно при испытании новых сортов или селекционных образцов, более высокая массовая доля листовой ткани не всегда достижима. Указанное массовое соотношение, как было установлено, является вполне достаточным для выявления межсортовых различий по электрофизическим параметрам.

Подготовленные образцы листовой ткани проростков двух сортов мягкой яровой пшеницы помещают в условия освещения. Авторами экспериментально установлено, что существенным условием подготовки образцов являются условия освещенности проб. Как было показано, различия между сортами по электрофизическим параметрам вытяжек при экспозиции образцов в темновых условиях были менее выражены по сравнению с таковыми при световой экспозиции образцов (Таблица 4). Наблюдаемый эффект, по-видимому, связан с более низкой проницаемостью клеточных мембран на свету по сравнению с темновыми условиями (см. Федулов Ю.П. Влияние условий освещенности на проницаемость клеток листьев пшеницы // Докл. ВАСХНИЛ. - 1983, №11. - С.7-10), и межсортовые различия нивелируются вследствие деструктивного действия засоления.

Время световой экспозиции образцов, как установлено авторами экспериментально, должно составлять не менее 1,5 часа. При меньших временах экспозиции различия между контрольными и опытными вариантами были статистически недостоверны (Таблица 5). Увеличение времени экспозиции приводит к неоправданному возрастанию продолжительности процедуры оценки образцов и снижению производительности.

Затем подготовленные вытяжки фильтруют через капроновую ткань, полученный фильтрат помещают в измерительную ячейку (электрохимический преобразователь) и измеряют электропроводность при переменном напряжении на частоте 1 кГц (для предотвращения поляризации электродов).

Об устойчивости сорта судят по относительному изменению электропроводности (К) водных вытяжек листовой ткани проростков после экспозиции растений в солевых растворах:

где G_K - электропроводность водных вытяжек листьев контрольных образцов;

G₀ - электропроводность водных вытяжек листьев опытных образцов.

Пример реализации способа

Процесс оценки устойчивости к хлоридному засолению мягкой яровой пшеницы по электропроводности водных вытяжек из листовой ткани проростков продемонстрируем на примере двух сортов сибирской селекции Новосибирская 22 и Мана.

Предварительно отобранное хорошо выполненное без видимых признаков поражения болезнями, вредителями и без механических повреждений зерно пшеницы для устранения поверхностной сапрофитной и патогенной микрофлоры стерилизовали этанолом в течение 1 минуты, после чего трижды ополаскивали стерильной дистиллированной водой. Подготовленное зерно раскладывали в чашки Петри на фильтровальную бумагу, смоченную водой, и помещали в термостат для проращивания. Проросшие семена раскладывали на лентах фильтровальной бумаги, после чего ленты скручивали в рулоны, рулоны ставили в кюветы с дистиллированной водой и переносили в шкаф искусственного климата «БИОТРОН-4» (разработка ГНУ СибФТИ) в условия постоянной температуры и освещенности (t=22ºС, влажность 60%, Е=5000 лк). Проростки выращивали до фазы 2-3 листьев. В фазе 2-3 листьев часть растений оставляли в дистиллированной воде (контроль), а часть помещали в растворы NaCl с осмотическим давлением 9 ат на 24 ч (опыт).

Затем из средней части вторых листьев контрольных и опытных растений в соответствии с вышеописанной методикой готовили образцы листовой ткани, укладывали их в стаканчики с дистиллированной водой и помещали в условия освещения на 1,5 ч. После фильтрования водные вытяжки помещали в электрохимическую ячейку и измеряли электропроводность при переменном напряжении на частоте 1 кГц на цифровых измерителей L, С, R, Е 7-8 и Е7-12, а также кондуктометре лабораторном КЛ-С-1. Оценку устойчивости сортов к засолению проводили по формуле (1).

Устойчивость сортов Мана и Новосибирская 22 к хлоридному засолению была предварительно оценена в лабораторных условиях методом проростков - по энергии прорастания, всхожести, ростовым реакциям, накоплению сырой и сухой биомассы. Результаты представлены в таблице 6, относительные изменения параметров роста и электропроводности - в таблице 7. Как следует из приведенных данных, у сорта Новосибирская 22 подавление ростовых процессов и накопления биомассы выражено значительнее, чем у сорта Мана. Это означает, что Новосибирская 22 является менее устойчивым к хлоридному засолению сортом, чем Мана.

Показатели энергия прорастания и всхожесть семян являются ориентировочными и не всегда коррелируют с истинной солеустойчивостью сортов (см. Диагностика устойчивости растений к стрессовым воздействиям: Методическое руководство / Под ред. Г.В.Удовенко. - Ленинград, 1988. - С.85-97). Наилучшая корреляция с продуктивностью в полевых условиях получена при оценке устойчивости к засолению по длине ростка и накоплению биомассы ростков (r=0,76…0,94) (см. Удовенко Г.В. Солеустойчивость культурных растений. - Л.: Колос, 1977. - 215 с.).

Как следует из таблицы 7, выборочные средние относительных изменений показателей длина и биомасса ростка у данных сортов различаются в 1,13…1,24 раза, тогда как выборочные средние для относительных изменений показателя электропроводность водных вытяжек листовой ткани различаются в 4,84 раза.

Представленные данные убедительно показывают, что результаты оценки устойчивости к хлоридному засолению сортов Мана и Новосибирская 22 по ростовым процессам и по электропроводности водных вытяжек листовой ткани совпали.

Проведены испытания предлагаемого способа на ряде сортов мягкой яровой пшеницы. Результаты представлены в таблице 8.

Коэффициент корреляции рангов Спирмена между показателями устойчивости по ростовым процессам и по электропроводности водных настоев листовой ткани проростков составляет r_s=0,87 на уровне значимости по критерию Стьюдента р≤0,01.

Источники информации

1. А.с. СССР 599766. Способ определения солеустойчивости растений / Алешин Е.П, Третьяков Г.И., Федулов Ю.П., Зима П.И., Кошелев В.И. - Заявл. 06.10.75. Опубл. 30.03.78. Бюл. №12.

2. Патент RU №2017408. Способ оценки солеустойчивости растений.- Заявл. 26.06.91. Опубл. 15.08.94.

3. Диагностика устойчивости растений к стрессовым воздействиям: Методическое руководство / Под ред. Г.В. Удовенко. - Ленинград, 1988. - С.85-97.

4. Удовенко Г.В., Гончарова Э.А. Эффективные экспресс-методы оценки сортовой и индивидуальной устойчивости растений к экстремальным условиям // Докл. ВАСХНИЛ. - 1982, №7. - С.13-19.

5. Wood L.S. Relation of variation in Helminthosporium sativum to seedling blight of small grains // Phytopathology. - 1962, v.52. - P.493-498.

6. Федулов Ю.П. Влияние условий освещенности на проницаемость клеток листьев пшеницы // Докл. ВАСХНИЛ. - 1983, №11. - С.7-10.

7. Удовенко Г.В. Солеустойчивость культурных растений. - Л.: Колос, 1977. - 215 с.

Способ относится к области сельского хозяйства. В способе определяют относительную устойчивость сортов яровой пшеницы к хлоридному засолению методом проростков в рулонной культуре. Проростки выращивают до фазы 2-3 листьев, подвергают действию солевого стресса путем экспозиции их в растворе хлорида натрия с осмотическим давлением 9 атм. Готовят нарезки из вторых листьев проростков, помещают их в дистиллированную воду в соотношении 1:20 на 1,5 часа в условия освещения. Фильтруют вытяжки, определяют их электропроводность и вычисляют реакцию сорта на засоление по отношению: , где G_K - электропроводность водных вытяжек листьев контрольных образцов; G₀ - электропроводность водных вытяжек листьев опытных образцов; и при К меньше 150% сорт включают в группу относительно устойчивых к хлоридному засолению. Способ позволяет ускорить селекционный процесс за счет отбора перспективных форм на ранних стадиях органогенеза. 8 табл., 1 пр.

Способ определения относительной устойчивости сортов яровой пшеницы к хлоридному засолению методом проростков в рулонной культуре, отличающийся тем, что проростки выращивают до фазы 2-3 листьев, подвергают действию солевого стресса путем экспозиции их в растворе хлорида натрия с осмотическим давлением 9 атм, готовят нарезки из вторых листьев проростков, помещают их в дистиллированную воду в соотношении 1:20 на 1,5 ч в условия освещения, фильтруют вытяжки, определяют их электропроводность и вычисляют реакцию сорта на засоление по отношению:

где G_K - электропроводность водных вытяжек листьев контрольных образцов;
G_О - электропроводность водных вытяжек листьев опытных образцов;
и при К меньше 150% сорт включают в группу относительно устойчивых к хлоридному засолению.