СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СОЛЕУСТОЙЧИВЫХ РАСТЕНИЙ-РЕГЕНЕРАНТОВ ЛЮЦЕРНЫ Российский патент 1994 года по МПК A01H4/00 C12N5/04 

Изобретение относится к сельскому хозяйству, сельскохозяйственной биотехнологии растений, может быть использовано в селекции и семеноводстве.

Способ регенерации растений люцерны in vitro [1] (прототип) включает отбор материнских растений, эксплантацию стерилизованных сегментов, их листьев на питательную среду Гамборга, модифицированную добавлением аммонийного азота и повышенным содержанием хеллата железа, культивирование до получения каллуса, пассирование на питательную среду для получения соматических эмбриоидов, перенос соматических эмбриоидов на безгормональную среду с уменьшенным вдвое содержанием макро- и микросолей для регенерации, перенос полученных регенерантов в почву и адаптацию их к условиям открытого грунта, причем в качестве материнских растений используют ранее полученные растения-регенеранты, соматические эмбриоиды получают при добавлении в питательную среду 0,1-0,5 мг/л кинетина, 0,1-0,5 мг/л ИУК и 5-15 мг/л глицина и перед переносом (пассированием) на среду для регенерации их культивируют в течение 2-4 сут при температуре 10-15^оС на свету. При этом изолированные эмбриоиды переносят на агаризованную питательную среду Гамборга половинного состава и без гормонов. Пересадку проростков в почву проводят при формировании 2 - 3 листьев и корневой системы, предварительно выращивают для акклиматизации, например, в течение 2-3 недель, в оптимальных условиях влажности воздуха под стеклянными стаканами.

Недостатком способа - прототипа является то, что его использование не позволяет получить солеустойчивые растения - регенеранты, устойчивые к конкретному естественному типу засоления почвы.

Целью изобретения является получение солеустойчивых эмбриоидов и растений-регенерантов во время пассирования камусов за счет добавления в питательную эмбриоидогенную среду в качестве селетективного агента засоленной почвы (СН).

Это достигается тем, что в способе регенерации растений люцерны in vitro во время переноса каллусов на среду для получения соматических эмбриоидов в нее дополнительно добавляют измельченную почву с естественным типом засоления, и на этом селективном фоне ведут отбор эмбриоидов и растений-регенерантов на устойчивость к естественному типу засоления.

Доказательство наличия существенных отличий.

В известной научно-технической и патентной литературе не обнаружено совокупности признаков, аналогичной заявленной.

Не является очевидным использование засоленной почвы в питательной среде в качестве селективной добавки и селективного фона.

На является также очевидным отбор эмбриоидов и растений-регенерантов, устойчивых к конкретному естественному типу засоления in vitro.

Не является очевидным использование эмбриоидогенной среды для отбора на солеустойчивость. Отбор устойчивых растений-регенерантов именно на среде, формирующей эмбриоиды, вызван тем, что на каллусогенной среде каллусные клетки развиваются нестабильно, и для их стабилизации необходимо два-три пассажа культивирования.

Даже в случае отбора устойчивых клеток на каллусогенной среде при пересадке их на среду, формирующую эмбриоиды, на ней появляются новые клетки, дающие начало эмбриоидам, не обладающим устойчивостью к селективному фактору.

Проводить же отбор на стадии растений-регенерантов также целесообразно, так как в этом случае наступает массовая гибель растений-регенерантов и проводится отбор на организменном уровне на быструю модификационную адаптацию растений к стрессовым условиям.

Таким образом, заявленная совокупность признаков отвечает критериям "новизна" и "существенные отличия".

Способ осуществляют следующим образом.

Отбирают материнские растения-регенеранты с ценными признаками. Изолируют их части, например листочки, стерилизуют в 5-10%-ном водном растворе хлорамина "В" после трехкратной промывки в стерильной дистиллированной воде. Тройчатые листья делят на отдельные листочки и из них вырезают кусочки, делают на каждом из них ряд частичных повреждений (поранений) по всей поверхности листового кусочка, помещают на агаризованную каллусогенную питательную среду Гамборга, модифицированную добавлением аммонийного азота (200-300 мг/л) и повышением хеллата железа (до 15 мг/л). Материал культивируют до получения каллуса, например 3-4 недели, при непрерывном освещении люминесцентными лампами (0,5-4,0 тыс.люкс), температуре 26±1^оС. Развившиеся из листочков-эксплантатов каллусы делят на 3-5 ч и переносят на агаризованную питательную среду, т.е. на ту же по составу питательную среду, что и каллусогенная, но в которой гормоны заменены на кинетин 0,1-0,5 мг/л, ИУК 0,1-0,5 мг/л и глицин 5-15 мг/л и, кроме того, дополнительно добавлена мелко измельченная засоленная почва. Для получения эмбриоидов каллусы культивируют в течение 2-4 недель при тех же условиях и 16-часовом фотопериоде. Появившиеся через 2-3 недели на каллусах единичные эмбриоиды переносят на 2- сут в камеру с температурой 10-15^оС с круглосуточным освещением. Полученные эмбриоиды переносят на агаризованную питательную среду, например Гамборга, разбавленную водой вдвое, и без гормонов. Пересадку проростков-регенерантов в почву проводят при формировании 2-3 листьев и корневой системы и предварительно выращивают в течение 2 недель при оптимальных условиях влажности воздуха, например, под стеклянными стаканами для лучшей акклиматизации проростков-регенерантов.

П р и м е р. Для получения и отбора солеустойчивых эмбриоидов использовали в качестве материнских, маточных растения-регенеранты из сорта Краснокутская 4009 и линии 451, полученные в условиях in vitro.

На растениях отбирали и срезали хорошо сформированные тройчатые листья, их стерилизовали в 10% -ном водном растворе хлорамина "В". Концентрация стерилизатора зависит от инфекционного фона выращиваемых растений. После стерилизации листочки трехкратно промывали стерильной дистиллированной водой. Разрезали на отдельные листочки и из них вырезали кусочки размером 5 х 5 мм и делали на каждом из них ряд повреждений (поранений) по всей листовой поверхности.

Их помещали на агаризованную каллусогенную питательную среду Гамборга с повышенным содержанием хеллата железа (15 мг/л), добавлением аммонийного азота (220-300 мг/л) и фитогормонов: 2,4Д 8 мг.л, кинетина 8 мг/л, НУК 0,5 мг/л; сахарозы 3% и доведением рН среды до 5,8-6,0. Эксплантаты культивировали 4 недели при непрерывном освещении люминесцентными лампами (3,0 тыс. люкс) и температуре 26±1^оС.

Через четыре недели развившиеся из листочков-эксплантатов каллусы делили на 3-5 ч. и переносили на ту же агаризованную среду, гормоны которой заменены на кинетин и ИУК, по 0,1 мг/л каждого, и где лицина 7 мг/л. Кроме того, в отличие от основного изобретения в качестве селективного агента фона) здесь дополнительно использовали засоленную солонцовую) почву с естественным типом засоления.

В исследованиях использовали почвенные образцы солонцов, содержащие комплекс солей с максимальным количеством Na, Cl^-, SO^-4 (таблица).

Почвенные солонцовые образцы были взяты в Ершовском районе, Саратовской области, в колхозе им.XXII партсъезда. На этих почвах посевы люцерны были угнетены и выпадали на 2-4 год жизни.

Из высушенных образцов удаляли остатки растений и червей, а также примеси нетипичной почвы (вкрапления глины, гравия и т.п.) Почвенные образцы измельчали до пылеватого состояния в фарфоровой чашке, пестиком и просевали через сито с диаметром отверстий 1 мм.

На технических весах отвешивали навеску 100, 200 г измельченной воздушно-сухой почвы, пересыпали в литровую колбу и приливали 500 мл дистиллированной воды. Содержамое колбы взбалтывали в течение 5-10 мин [2], затем приливали приготовленную заранее растопленную, агаризованную органогенную питательную среду Гамборга и дистиллированной водой доводили объем среды до 1000 мл.

При разливе питательной среды следили за тем, чтобы частички засоленной почвы находились во взвешенном состоянии. Это необходимо для равномерного распределения почвы и создания одинакового осмотического давления в пробирках.

Стерилизацию питательной среды проводили при обычном режиме автоклавирования питательной среды. После стерилизации пробирки с агаризованной питательной средой, встряхивали до получения однородной массы и ставили в холодную воду для быстрого застывания агара.

Приготовленную среду помещали на 2-3 дня в термостат с температурой 26^оС для провоцирования развития грибковой и бактериальной инфекции.

Кусочки каллусов, высаженные на эту среду, формировали соматические эмбриоиды через две недели культивирования. Их переносили на трое суток в камеру с температурой 10-15^оС с круглосуточным освещением. Затем эмбриоиды переносили на питательную среду Гамборга, разбавленную водой вдвое и без гормонов. Пересадку проростков-регенерантов в почву проводили при формировании 2-3 листьев и корневой системы и выращивали в течение двух недель при оптимальных условиях влажности воздуха, например, под стеклянными стаканами, для лучшей акклиматизации проростков-регенерантов.

Для применения засоленной (солонцовой) почвы в качестве селективного фона в клеточной селекции in vitro использовали различные варианты агаризованных питательных сред. Варианты сред с 1 по 4 имели минеральную основу по Гамборгу, а в 5 и 6 вариантах минеральная основа солей уменьшена до 1/2 и 1/4 части, т.е. в 2 и 4 раза. В седьмом варианте селективной агаризованной среды отсутствовала минеральная основа среды Гамборга, но были добавлены гормоны кинетина 0,1 мг/л, ИУК 0,1 мг/л, глицин 7 мг/л, а витамины и сахароза по прописи среды Гамборга.

В варианты с третьего по седьмого добавляли засоленную (солонцовую) почву в количестве 100 или 200 г/л, а во втором варианте к минеральной основе Гамборга добавляли 1% раствора NaCl (искусственное засоление).

Были изучены следующие варианты селективных питательных сред:
1 вариант среда Гамборга - (прототип);
2 вариант -"- +1% NaCl (аналог);
3 вариант -"- +200 г/л (20%) CH (заявленный способ);
4 вариант -"- +100 г/л (10%) CH -"- ;
5 вариант -"- 1/2 Гамборга +200 г/л (20%) CH -"- ;
6 вариант -"- 1/4 Гамборга +200 г/л (20%) CH -"- ;
7 вариант без минеральной основы +200 г/л (20%) CH -"- .

среды Гамборга
Первые признаки угнетения каллусных клеток на эмбриоидогенной агаризованной селективной среде наблюдали в седьмом варианте через семь-восемь дней. Каллус имел нездоровый, черно-коричневый цвет шероховатого типа. При дальнейшем культивировании на этой селективной среде наблюдали полный некроз каллусных клеток из-за нехватки элементов минерального питания.

В первом варианте (прототипе) агаризованной эмбриоидогенной среды без добавления почвы, из каллусных клеток, в трех пассажах были получены 733 эмбриоида, тип каллуса оставался глобулярный, здорового, желто-зеленого цвета.

Во втором варианте искусственной селективной питательной среды (аналоге), с добавлением 1% NaCl наблюдали некроз каллусных клеток уже к концу второго пассажа культивирования. Цвет и тип каллуса изменялся от здорового, желто-зеленого, глобулярного до серого, серо-коричневого обводненного глобулярного. Этот тип каллуса не формировал эмбриоиды.

В третьем варианте (заявленный способ) при добавлении в агаризованную питательную селективную среду засоленной почвы в концентрации 20% (200 г/л) каллусные клетки сформировали 82 эмбриоида, типа каллуса не изменялся (т.е. был глобулярный), а цвет изменился от желто-зеленого до коричнево-желтого.

Уменьшение концентрации засоленной почвы (четвертый вариант) до 10% (100 г/л) приводило к быстрому росту каллусной массы, имеющей как глобулярный, так и шероховатый желто-зеленый тип каллуса. На этом варианте питательной агаризованной селективной среды получили 112 эмбриоидов.

Уменьшение содержания минеральных солей среды в половину и при 20% содержании СН (пятый вариант) приводило к изменению цвета каллуса от желто-зеленого до серо-коричневого с формированием единичных эмбриоидогенных зон и было получено всего 3 эмбриоида. Низкий выход эмбриоидов получен, вероятно, за счет нехватки элементов минерального питания и усиления на этом фоне токсичности почвенных солей.

На питательной среде, содержащей 1/4 состава минеральных солей и 20% (200 г/л) СН (шестой вариант), каллус формировал единичные (12) эмбриоидогенные зоны. Каллус имел шероховатый и глобулярный тип, желто-серого цвета. Пересаженные эмбриогенные зоны на среду без гормонов формировали уродливые растения и гибли.

Из вариантов заявленного способа лучшими являются третий и пятый.

Использование третьего варианта питательной среды позволяет получать большое количество эмбриоидов, из которых в результате дальнейшей комплексной оценки растений можно выбрать солеустойчивые растения-регенеранты с другими ценными признаками. Увеличение концентрации солонцовой почвы позволяет уменьшать выход эмбриоидов и увеличивать в дальнейшем вероятность отбора солеустойчивых эмбриоидов и растений-регенерантов.

Использование пятого варианта позволяет экономить минеральные соли селективной среды и создать жесткие, неблагоприятные в минеральном питании условия для формирования эмбриоидов. В этом варианте высокая вероятность отбора солеустойчивых растений, потому что в среде содержится недостаточное количество элементов минерального питания, что приближает условия развития эмбриоидов к естественным условиям развития растений на засоленной (солонцовой) почве.

Использование заявленного способа повышает выход эмбриоидов и жизнеспособность каллусов по сравнению с аналогом (добавление 1% NaCl), который в настоящее время широко используется в селекционно-генетических работах на солеустойчивость [1] , но формирует меньше эмбриоидов при сравнении с прототипом.

Таким образом, заявленный способ по сравнению с прототипом позволяет вести отбор in vitro на естественном фоне засоления и получать солеустойчивые эмбриоиды. Полученные по заявленному способу растения-регенеранты при высадке их на аналогичные солонцовые почвы были менее угнетены, чем таковые по прототипу, цвели и давали семена.

Использование: биотехнология, растениеводство, селекция. Сущность изобретения: солеустойчивые растения-регенеранты люцерны получают путем выращивания растений из соматических эмбриоидов, при этом в питательную среду для образования эмбриоидов вводят измельченную почву с естественным типом засоления. 1 з.п.ф-лы, табл.

1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СОЛЕУСТОЙЧИВЫХ РАСТЕНИЙ-РЕГЕНЕРАНТОВ ЛЮЦЕРНЫ, включающий отбор донорных растений, эксплантацию листовых сегментов на питательную среду для получения каллуса, перенос полученного каллуса на питательную среду для образования соматических эмбриоидов, перенос эмбриоидов на питательную среду для регенерации, укоренение и адаптирование полученных регенерантов к условиям открытого грунта, отличающийся тем, что в питательную среду для образования соматических эмбриоидов дополнительно вводят измельченную почву с естественным типом засоления. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что измельченную почву с естественным типом засоления вводят в питательную среду в количестве 100 - 200 г/л.