СПОСОБ ОЦЕНКИ ЭФФЕКТИВНОСТИ ЛЕЧЕНИЯ И ДИНАМИКИ ДЕСТРУКТИВНЫХ ИЗМЕНЕНИЙ В ЛЕГОЧНОЙ ТКАНИ ПРИ ТУБЕРКУЛЕЗЕ ЛЕГКИХ Российский патент 2012 года по МПК G01N33/53 G01N33/49 

Изобретение относится к клинической медицине, а именно фтизиатрии и иммунологии, и может быть использовано для оценки эффективности лечения туберкулеза легких.

В настоящее время резко возросла заболеваемость туберкулезом и смертность от этой инфекции. При этом отмечается множественная лекарственная устойчивость возбудителей заболевания. В связи с этим, а также в связи с многообразием форм туберкулеза легких, различным течением заболевания и различным ответом больных на химиотерапию большое значение имеет постоянный мониторинг за эффективностью проводимой терапии и оценка динамики патологических изменений в легочной ткани больного. Имеет значение также особенность иммунореактивности организма больного, определяющая характер патологических процессов в легочной ткани и скорость развития репаративных процессов при лечении туберкулеза. Такой мониторинг важен как для своевременного выявления больных с низкой отвечаемостью на проводимую терапию, так и для своевременного заключения об излечении туберкулеза. Последнее имеет большое значение в связи с длительностью и высокой стоимостью лечения туберкулеза, а также большим риском развития побочных эффектов.

В настоящее время основными методами оценки эффективности лечения туберкулеза являются клинические показатели, методы лучевой диагностики и микробиологические методы, а основными критериями эффективности лечения - исчезновение (уменьшение) клинических признаков заболевания, положительная рентгенологическая динамика и прекращение бактериовыделения.

Данные подходы имеют определенные ограничения. Клинические симптомы не являются специфичными. Рентгенологическое обследование обладает рядом побочных эффектов и является дорогостоящим, а рентгенологическая оценка динамики туберкулезного процесса является достаточно субъективной. Основными ограничениями микробиологических и молекулярно-биологических методов являются слабая чувствительность (микроскопия мазков мокроты), длительность получения результатов (посев мокроты на микобактерии, время ожидания результата - 1-3 месяца), недоступность ускоренных методов для обычных клинических лабораторий (ВАСТЕС, ПЦР), а также необходимость использования мокроты, получение которой не всегда возможно, особенно у пациентов с ограниченными деструктивными процессами в легочной ткани. Кроме того, результаты микробиологических методов не позволяют судить о характере патологических изменений в легочной ткани, прогнозировать и мониторировать течение патологического процесса в легочной ткани.

Поскольку состояние иммунной системы больного зависит от интенсивности инфекционного процесса и характера поражения ткани в очаге инфекции, иммунологические тесты потенциально могут быть использованы для мониторинга течения туберкулеза и эффективности проводимой терапии.

Существуют различные иммунологические методы, используемые во фтизиатрической практике, однако большинство из используемых методов имеют те или иные недостатки и не решают вопрос о мониторинге эффективности лечения туберкулеза легких.

Определение содержания различных популяций и субпопуляций лимфоцитов (B-лимфоциты, T-лимфоциты CD4⁺, T-лимфоциты CD8, NK клетки) методом проточной цитометрии является современным методом, точным и быстрым, однако не позволяет получить информацию о функциональном состоянии иммунитета; в большинстве случаев результаты исследования не отражают активности туберкулезного процесса и не могут быть использованы для оценки эффективности проводимой терапии.

Определение антиген-индуцированной продукции интерферона-гамма и других цитокинов клетками крови позволяет оценить функциональное состояние иммунной системы больного и выявить наличие антиген-специфического иммунного ответа, но не позволяют дать однозначную оценку активности туберкулезного процесса и эффективности проводимой терапии. Например, низкий уровень продукции интерферона-гамма может наблюдаться как при низкой активности туберкулезного процесса (вследствие низкой антигенной нагрузки и, соответственно, низкой активации клеток в организме), так и при тяжелом течении туберкулеза (вследствие постоянной активации клеток в условиях высокой антигенной нагрузки и «истощении» иммунной системы больного). К другим недостаткам данного и других функциональных тестов относятся необходимость культивирования клеток in vitro, обусловливающая трудоемкость и длительность получения результатов.

Определение индуцированной люминолзависимой хемилюминесценции нейтрофилов в ответ на их стимуляцию инактивированной вакциной БЦЖ и опсонизированным [RU 2389020, G01N 33/49, 10.05.2010] предлагается для диагностики ТБ, но не используется для оценки течения ТБ процесса и эффективности проводимой терапии.

В пролиферативных тестах (реакция бласттрансформации) определяют уровень пролиферации лимфоцитов в ответ на антигены микобактерий и дают заключение о наличии инфицирования микобактериями. Способы используются, в основном, для диагностики туберкулеза, но не для оценки его активности или мониторинга за эффективностью его лечения. Примером является способ диагностики туберкулезной инфекции у детей, основанный на реакции пролиферации лимфоцитов в микрокультурах [RU 2315315, C2, G01N 33/53, G01N 33/60, 20.01.2008]. У пациентов определяют уровень пролиферации лимфоцитов в микрокультурах цельной крови по реакции бластной трансформации лимфоцитов (РБТЛ) с аллергеном туберкулином (ППД-Л). Оценивают индекс стимуляции специфического клеточного ответа и при показателях индекса менее 3,2 диагностируют отсутствие инфицирования микобактериями туберкулеза, при индексе более 3,2 диагностируют инфицирование микобактериями туберкулеза, а при показателе более 12,1 - активный туберкулезный процесс. Данный способ может быть использован для диагностики туберкулезной инфекции, но малоинформативен для мониторинга течения ТБ процесса или оценки эффективности его лечения. Кроме того, способ предложен для применения у детей, но не у взрослых, а достоверность диагностики ТБ данным способом относительно невысока.

Интерфероновые тесты основаны на определении количества клеток, продуцирующих интерферон-гамма (метод T-SPOT), или уровня продукции интерферона-гамма (метод QuantiFERON-TB) клетками периферической крови при стимуляции образцов крови антигенами микобактерий. Метод иммунологической диагностики и мониторинга туберкулезной инфекции T-SPOT (USPTO Applicaton №20070196878) основан на определении количества клеток, продуцирующих интерферон-гамма в ответ на стимуляцию образцов крови антигенами микобактерий ESAT-6 и CFP-10. Данный метод был предложен для диагностики туберкулеза, дифференциальной диагностики активного туберкулеза и латентной инфекции и мониторинга течения ТБ. Однако, по данным большинства исследователей, основной областью применения данного метода является диагностика туберкулеза, а не мониторинг его активности или эффективности лечения (Streitz М, Tesfa L, Yildirim V, Yahyazadeh A, Ulrichs T, et al: 2007 Loss of Receptor on Tuberculin-Reactive T-Cells Marks Active Pulmonary Tuberculosis. PLoS ONE 2(8): e735. doi:10.1371/journal.pone.0000735). Помимо этого, метод является сложным и трудоемким, требует культивирования клеток в стерильных условиях и дорогостоящих реагентов.

Метод QuantiFERON-TB Gold in-tube основан на определении уровня продукции интерферона-гамма клетками периферической крови в ответ на стимуляцию клеток антигенами микобактерий ESAT-6 и CFP-10. Метод используется для диагностики туберкулезной инфекции, однако не позволяет проводить дифференциальную диагностику активной и латентной туберкулезной инфекции, оценивать активность туберкулезного процесса или эффективность лечения.

Наиболее близким по своей сущности к методу, предложенному в данном изобретении, является подход, описанный Streitz и соавт.(Streitz M, Tesfa L, Yildirim V, Yahyazadeh A, Ulrichs T, et al. (2007) Loss of Receptor on Tuberculin-Reactive T-Cells Marks Active Pulmonary Tuberculosis. PLoS ONE 2(8):e735. doi:10.1371/journal.pone.0000735). В данном подходе образцы периферической крови стимулируют антигеном (ППД или пептидами, входящими в антиген миокбактерий ESAT-6). После окончания стимуляции клетки обрабатывают антителами, специфичными к маркерам CD4 и CD27, а также к внутриклеточному интерферону-гамма, и среди лимфоцитов, отвечающих на стимуляцию антигеном продукцией интерферона-гамма (лимфоциты IFN-γ+), определяют долю лимфоцитов CD27^-. Содержание лимфоцитов CD27^- выше 49% от всех лимфоцитов CD4⁺, продуцирующих IFN-γ, свидетельствует об активном туберкулезе, ниже 49% - о латентной инфекции. Способ позволяет диагностировать активный ТБ и латентную инфекцию. Ограничениями способа являются: а) невозможность его применения для мониторинга туберкулеза и оценки эффективности лечения вследствие того, что процент лимфоцитов CD27^- среди лимфоцитов, продуцирующих IFN-γ, в процессе лечения не изменяется; б) необходимость культивирования клеток in vitro, приводящая к трудоемкости и высокой стоимости метода.

Задачей, решаемой данным изобретением, является разработка способа, который позволял бы осуществлять мониторинг течения ТБ процесса, давать объективную оценку эффективности его лечения и динамики патологических изменений в легочной ткани, основываясь на анализе поверхностного фенотипа клеток крови, без их культивирования и внутриклеточного окрашивания.

Решение задачи достигается тем, что оценивают процентное содержание в крови лимфоцитов CD4⁺, имеющих фенотип CD62L^-CD27^-, по отношению ко всем лимфоцитам CD4⁺, а не к лимфоцитам, продуцирующим IFN-γ (как в способе Streitz и соавт). Проведенные нами исследования показали, что процент лимфоцитов CD62L^-CD27^- среди всей популяции лимфоцитов CD4⁺ зависит от интенсивности деструктивных процессов в легочной ткани и изменяется в процессе лечения туберкулеза. Характер изменения процентного содержания лимфоцитов CD62L^-CD27^- (снижение, увеличение, отсутствие изменений) зависит от эффективности проводимой терапии и позволяет проводить мониторинг эффективности лечения. Вторым отличием предлагаемого способа является то, что он не требует культивирования клеток и трудоемкой процедуры окрашивания клеток на внутриклеточные цитокины, поскольку основан на определении экспрессии рецепторов CD27 и CD62L на поверхности лимфоцитов CD4⁺.

Изобретение основано на открытии того факта, что процентное содержание в периферической крови лимфоцитов, CD4⁺, экспрессирующих фенотип CD62L^-CD27^-, зависит от активности туберкулезного процесса и целостности полостей распада в легочной ткани. Эффекторные лимфоциты CD4 (лимфоциты CD4⁺CD62L^-) образуются из наивных лимфоцитов при стимуляции последних антигеном и костимуляционными сигналами. Начальные стадии дифференцировки эффекторных лимфоцитов происходят за пределами легочной ткани, в лимфоидных органах. На этих стадиях эффекторные лимфоциты CD4 экспрессируют маркер CD27 и имеют фенотип CD62L^-CD27⁺ (Kapina MA, Shepelkova GS, Bogacheva PV, Mischenko VV, Sayles P, Winslow G, Apt ASD, Lyadova IV. CD27lo CD4⁺ lymphocytes that accumulate in the mouse lung tissue during mycobacterial infection differentiate from CD27hi precursors in situ, produce IFN-γ, and protect the host against TB infection. J. Immunol., 2007, 178:976-985). При попадании в очаг инфекции, находящийся в легочной ткани, эффекторные лимфоциты CD62L^-CD27⁺ теряют экспрессию молекул CD27 и превращаются в эффекторные лимфоциты CD62L^- CD27^-. Образовавшиеся клетки могут выходить в кровоток, причем интенсивность этого процесса, по-видимому, зависит от степени деструкции легочной ткани в очаге инфекции.

Предлагаемый способ осуществляют следующим образом. К 200 мкл крови, стабилизированной гепарином (50 ед./мл), добавляют антитела, специфичные к антигенам CD4, CD62L, CD27, инкубируют полученную смесь при комнатной температуре 15 мин, после чего лизируют эритроциты и смесь отмывают трижды центрифугированием в забуференном физиологическом растворе с добавлением белка. Полученные клетки анализируют на проточном цитофлуориметре и определяют процентное содержание лимфоцитов CD62L^-CD27^- среди всех лимфоцитов CD4⁺. Исследование проводят в начале лечения ТБ и несколько раз в процессе лечения.

Оценка результатов. У здоровых доноров лимфоциты CD62L^-CD27^- составляют 5-12% от всех лимфоцитов CD4⁺ периферической крови.

У больных туберкулезом исследуемый показатель колеблется от 3 до 60%. Значения показателя ниже 12% могут наблюдаться как у больных с отсутствием клинических признаков заболевания, так и у больных с выраженными клиническими проявлениями туберкулезной инфекции. При значении исследуемого показателя менее 12% у больных с отсутствием выраженных клинических проявлений туберкулеза (интоксикации, изменений клинического анализа крови и др.) делают вывод о низкой активности туберкулезного процесса и прогнозируют его благоприятное течение. При значении исследуемого показателя менее 12% у больных с выраженными клиническими проявлениями заболевания делают вывод об истощении иммунной системы больного и прогнозируют тяжелое, трудно поддающееся лечению течение инфекции. При значениях процентного содержания лимфоцитов CD62L^-CD27^- более 12% делают вывод об активном туберкулезном процессе, при значениях выше 25% - о крайне высокой активности туберкулезного процесса.

Определение процентного содержания лимфоцитов CD62L^-CD27^- в процессе лечения туберкулеза позволяет сделать вывод о динамике туберкулезного процесса в легочной ткани. У больных с исходно высоким значением процента лимфоцитов CD62L^- CD27^- (более 12%) снижение исследуемого показателя до нормальных (менее 12%) значений является признаком закрытия полостей распада в легочной ткани и эффективного лечении туберкулеза. Снижение исходно высокого показателя без достижения нормального значения (процент лимфоцитов CD62L^-CD27^- остается выше 12%) свидетельствует о положительной динамике туберкулезного процесса, уменьшении деструктивных процессов в легких, но сохранении полостей распада в легочной ткани. Отсутствие изменений в процентном содержании лимфоцитов CD62L^-CD27^- при его исходно высоком значении свидетельствует об отсутствии динамики патологических изменений в легких, и низкой отвечаемости больного на проводимую терапию. Увеличение процентного содержания лимфоцитов CD62L^-CD27^- является показателем прогрессирования ТБ и увеличения процессов распада в легочной ткани.

У больных с исходно низким (менее 12%) значением процентного содержания лимфоцитов CD62L^-CD27^- нa фоне выраженных клинических признаков туберкулезного процесса лечение может сопровождаться повышением процента лимфоцитов CD62L^-CD27^-, что является признаком восстановления иммунной системы больного. У больных с исходно низким (менее 12%) значением процентного содержания лимфоцитов CD62L^-CD27^- и отсутствием выраженных клинических признаков инфекционного процесса значение исследуемого показателя в процессе лечения, как правило, не изменяется.

Предложенные критерии подобраны на основании клинических исследований 40 больных туберкулезом легких (17 мужчин и 23 женщины) в возрасте от 20 до 70 лет. Обследование больных проводилось в первые дни поступления в стационар. Кровь забирали из вены утром натощак и анализировали согласно описанному способу. На основе полученных результатов, больные были разделены на две основные группы: с исходно низким (нормальным, менее 12%) и высоким (более 12%) процентным содержанием лимфоцитов CD62L^-CD27^- в периферической крови. Повторное исследование проводили через 2-3 месяца после начала лечения. Ряд больных обследовали также через 5-6 или 12 месяцев после начала лечения. На основании динамики изменения исследуемого показателя, больные с исходно высоким содержанием лимфоцитов CD62L^-CD27^- были разделены на группы: а) больные с полной нормализацией показателя в процессе лечения (уменьшение процента лимфоцитов CD62L^-CD27^- до значений менее 12%); б) больные с частичной динамикой (снижение процента CD62L^-CD27^- по сравнению с исходным, но без достижения нормальных значений); в) больные без динамики (отсутствие изменений исследуемого показателя); г) больные с отрицательной динамикой (возрастание процентного содержания лимфоцитов CD62L^-CD27^- по сравнению с исходным). Больные с исходно низким содержанием лимфоцитов CD62L^-CD27^- были разделены на две группы: больные с выраженными признаками туберкулезной интоксикации и больные без признаков туберкулезной интоксикации. Для всех больных двойным слепым методом собирали данные рентгенологических исследований о динамике туберкулезного процесса в легких и анализировали зависимость между динамикой туберкулезного процесса, оцененной рентгенологическими методами, и динамикой процентного содержания лимфоцитов CD62L^-CD27^-.

Примеры

Пример 1. Больной А. Диагноз: кавернозный туберкулез в фазе инфильтрации и обсеменения, МБТ-. Процент лимфоцитов CD62L^-CD27^-: в начале лечения - 43%. Через 2 месяца после начала лечения - 19% (положительная динамика). Результаты рентгенологического обследования и компьютерной томографии. При поступлении в клинику: в верхней доле правого легкого определяется крупная каверна с неравномерно утолщенными стенками и более мелкие полости распада, очаги обсеменения в окружающей легочной ткани. Через 2.5 месяца после начала лечения - положительная рентгенологическая динамика в виде уменьшения объема каверны в два раза, частичного рассасывания и уплотнения очагов.

Пример 2. Больная Б. Диагноз: инфильтративный туберкулез верхней доли правого легкого в фазе распада и обсеменения. Процент лимфоцитов CD62L^-CD27^-: в начале лечения - 17%. Через 3,5 месяца после начала лечения - 12% (нормализация). Результаты рентгенологического обследования и компьютерной томографии. На момент поступления в клинику: наличие полости распада размеров 2×1,8 см с инфильтративными стенками и множества полиморфных очагов. Через 3,5 месяца после начала лечения: положительная динамика в виде исчезновения полостей распада, частичного рассасывания инфильтративных и очаговых изменений.

Пример 3. Больной В. Диагноз ФКТ легких в фазе инфильтрации и обсеменения. Процент лимфоцитов CD62L^-CD27^-: в начале лечения - 18%. Через 2 месяца после начала лечения - 18%) (без динамики). Результаты рентгенологического обследования и компьютерной томографии. При поступлении в клинику: в левом легком - система разновеликих полостей, в верхней доли правого легкого - средних размеров толстостенные каверны, множество полиморфных разнокалиберных очагов с нечеткими контурами. Через 2 месяца после лечения - отсутствие рентгенологической динамики слева, некоторая положительная динамика справа в виде частичного рассасывания и уплотнения очагов и инфильтративных изменений с сохранением полостей распада.

Пример 4. Больной М. Диагноз: инфильтративный туберкулез верхних долей легких в фазе распада и обсеменения. Процент лимфоцитов CD62L^-CD27^-: в начале лечения - 12,5%, через 2 месяца после начала лечения - 13%. Через 9 месяцев - 27% (резко выраженная отрицательная динамика). Результаты рентгенологического обследования и компьютерной томографии. При поступлении в клинику: инфильтрация верхних долей легкого без четких контуров с наличием полостей от 0,5 до 2 см, множество полиморфных очагов в окружающей легочной ткани. Через 2 месяца после начала лечения - уменьшение полостей распада слева, частичное рассасывания инфильтративных и очаговых изменений справа (частичная положительная динамика). Через 9 месяцев - обострение процесса, на компьютерной томографии - отрицательная динамика в виде увеличения полости деструкции слева до размеров 1,5-1,9 см, появления дополнительных очагов отсева в обоих легких.

Способ, предлагаемый в настоящем изобретении, отличается от других существующих методов тем, что: а) основан на анализе небольших образцов периферической крови; б) позволяет оценивать динамику патологических процессов в легочной ткани, прогрессирование заболевания, эффективность его лечения; в) не требует культивирования клеток, стерильных условий и длительного времени для получения результатов (исследование проводится в течение одного дня).

Изобретение относится к клинической медицине, а именно фтизиатрии, и касается способа оценки эффективности лечения и динамики деструктивных изменений в легочной ткани при туберкулезе легких. Сущность способа заключается в том, что определяют процентное содержание лимфоцитов CD62L^-CD27^- в периферической крови относительно всех лимфоцитов CD4⁺ путем обработки клеток периферической крови смесью моноклональных антител, специфичных к маркерам CD4, CD62L, CD27, и последующего анализа клеток методом проточной цитометрии. Исследования проводят в начале и в процессе лечения. При снижении исходно высокого процентного содержания лимфоцитов CD62L^-CD27^- в процессе лечения туберкулеза делают вывод о прекращении (уменьшении) деструктивных процессов в легочной ткани, положительной динамике и эффективности проводимой терапии. Отсутствие изменения процентного содержания лимфоцитов CD62L^-CD27^- в процессе лечения при их исходно высоком значении свидетельствует об отсутствии положительной динамики, продолжающейся деструкции легочной ткани и низкой отвечаемости больного на проводимую терапию. Увеличение процентного содержания лимфоцитов CD62L^-CD27^- является показателем прогрессирования туберкулеза, нарастания деструктивных процессов в легочной ткани и неэффективности применяемой терапии. Использование способа позволяет осуществлять мониторинг течения туберкулезного процесса, объективно оценить эффективность лечения и динамики патологических изменений в легочной ткани. 4 пр.

Способ оценки эффективности лечения при туберкулезе легких, отличающийся тем, что проводят определение показателя процентного содержания лимфоцитов CD62L^-CD27^- по отношению ко всем лимфоцитам CD4⁺ периферической крови в процессе лечения, при этом снижение исходно высокого значения этого показателя - более 12% - в процессе лечения до нормальных величин - менее 12% - считают признаком закрытия полостей распада в легочной ткани и эффективного лечения туберкулеза; снижение исходно высокого показателя, но без достижения нормальных значений и сохранение его выше 12% свидетельствует о положительной динамике туберкулезного процесса, уменьшении деструктивных процессов в легких, но сохранении полостей распада в легочной ткани; отсутствие изменений при исходно высоком значении показателя свидетельствует об отсутствии динамики патологических изменений в легких и отсутствии эффекта от проводимой терапии; увеличение указанного показателя в процессе лечения свидетельствует о прогрессировании заболевания и увеличении процессов распада в легочной ткани.