СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ТУБЕРКУЛЕЗА ЛЕГКИХ Российский патент 2013 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится к клинической медицине, точнее к фтизиатрии и иммунологии, а именно к способам оценки состояния больных туберкулезом легких (ТБ).

В последние годы во многих странах, независимо от уровня их экономического развития, отмечается увеличение заболеваемости и распространения туберкулеза, который все чаще упоминается среди так называемых "возрождающихся" инфекций. Для предотвращения распространения туберкулеза актуальное значение приобретает возможность диагностики этого заболевания, в частности выявления контингента, больного туберкулезом в активной форме, и представляющего опасность для окружающих. Это особенно актуально в условиях широкого распространения латентной формы туберкулеза, не представляющей серьезной опасности для окружающих, и ограниченных возможностях лечебных учреждений.

В настоящее время наиболее широко распространена диагностика заболеваний с использованием пробы Манту и, при наличии положительной реакции, бактериологических методов анализа. Однако результат постановки внутрикожной аллергической пробы Манту учитывают через 72 часа, причем в связи с высоким процентом инфицированности населения ТБ частота подтверждения диагноза заболевания в разных возрастных группах составляет от 25 до 50% (Бородулина Е.А., Бородулин Б.Е. Дифференциальная диагностика поствакцинальной и инфекционной туберкулиновой аллергии у детей с атопическими заболеваниями.//Проблемы туберкулеза и болезней легких. - №1, 2006, - с.9-12). На результаты пробы Манту оказывает влияние предыдущая вакцинация, неконтролируемый прием антибиотиков широкого спектра действия и наличие сопутствующей патологии, в том числе аллергопатологии (Аксенова В.А., Овсянкина Е.С., Александрова Т.М. Методы контроля качества работы при массовой туберкулинодиагностике. // Проблемы туберкулеза. - 2002, №2. - С.3-5). Недостатками бактериологических методов являются низкая частота выявления Mycobacterium tuberculosis (МБТ) и длительный рост МБТ на питательных средах (до 30 дней). Все перечисленное определяет сложность клинико-лабораторной диагностики туберкулеза и обуславливает необходимость разработки более быстрых и надежных способов лабораторной диагностики туберкулезной инфекции.

Известен ускоренный способ бактериологической диагностики туберкулеза по методу Прайса, позволяющий выделить и идентифицировать МБТ через 7-14 дней (Медицинская микробиология, вирусология и иммунология. / Под ред. А.А. Воробьева. М.: Медицинское информационное агенство, 2004. - 671 с.), однако и эти сроки также достаточно велики, а надежность метода достаточно низка.

Широко используется для диагностики туберкулеза метод иммуноферментного анализа (ИФА), позволяющий определять наличие туберкулезной инфекции по концентрации (титру) специфических иммуноглобулинов классов А, М, G, Е (Авдеенко В.Г. с соавт. Повышение эффективности иммунодиагностики туберкулеза путем применения моноклональных антител против иммуноглобулина G человека. / Клиническая лабораторная диагностика. - 1999, №6. - С.22-35; Авдеенко В.Г. с соавт. Противотуберкулезные IgE-антитела. Иммунодоминантные антигены. // Проблемы туберкулеза. - 2002, ч.1, №2. - С.30-33). Недостатком данного способа является необходимость повторного исследования сывороток крови через 10-14 дней для выявления нарастания титра антител к МБТ, свидетельствующее об активном инфекционном процессе в организме.

Общим недостатком вышеперечисленных методов является длительность анализа, их недостаточная селективность, невозможность подразделить контингент больных на пациентов с латентной и активной формами туберкулеза, что не позволяет своевременно проводить активные мероприятия с больными второй из вышеперечисленных групп.

Одним из наиболее перспективных направлений диагностики туберкулеза (ТБ) является проведение анализа in vitro с использованием антигенов, специфических для Mycobacterium tuberculosis. Как показывают обобщенные аналитические данные, клеточные тесты in vitro обладают высокой специфичностью: у 99% вакцинированных лиц наблюдаются отрицательные реакции, а у 78% больных туберкулезом - положительные реакции (Menzies Т. Meta-analysis: New tests for the diagnosis of latent tuberculosis infection: areas of uncertainty and recommendations for research march / Т. Menzies, M. Pai, G. Comstock // Annals. Intern. Med. - 2007. - Vol.146 - P.340-354; Pai M. T-cell based assays for the diagnosis of latent tuberculosis infection: an update / M. Pain, A. Zwerling, D. Menzies // Ann. Intern. Med. - 2008. - Vol.149(3). - P.177-184).

В настоящее время прошел сертификацию тест T-SPOT, являющийся экспресс-аналогом стандартной диагностики туберкулеза на основе кожных реакций замедленного типа (Кожная проба с препаратом "ДИАСКИНТЕСТ" - новые возможности идентификации туберкулезной инфекции. Под ред. Академика РАН и РАМН М.А. Пальцева. Второе издание, переработанное и дополненное. - М.: Издательство "Шико", 2011. 256 с). Способ иммунологической диагностики и мониторинга туберкулезной инфекции Т-SPOT (Oxford Immunotec, USPTO Applicaton №20070196878) основан на определении количества клеток, продуцирующих интерферон-гамма (IFNγ) в присутствии таких специфических индукторов, как белки ESAT-6 (ранний секретируемый антиген) и CFP-10 (белок культурального фильтрата), которые отсутствуют у микобактерий вакцинного штамма М. bovis (BCG) и большинства нетуберкулезных микобактерий окружающей среды, за исключением Mycobacterium marinum и Mycobacterim kansasii. При этом предварительная БЦЖ-вакцинация не оказывает значительного влияния на результаты индукции IFNγ in vitro, а повышение его количества свидетельствует о наличии туберкулезной инфекции (Мордовская Л.И. Индукция IFNγ в образцах цельной венозной крови in vitro - тест для определения туберкулезного инфицирования детей и подростков. / Л.И. Мордовская, М.А. Владимирский, В.А. Аксенова, Е.Е. Ефремов, Г.И. Игнашенкова, Т.Н. Власик // Проблемы туберкулеза и болезней легких. -2009. -№6. - С.19-24).

Основными недостатками этого теста является его сложность и трудоемкость, необходимость культивирования клеток в стерильных условиях, а также невозможность на его основе диагностировать носит ли заболевание латентный или активный характер.

Наиболее близким по своей сущности к методу, предлагаемому в данном изобретении, является способ с использованием тест-системы "QuantiFERON-TB Gold In-Tube" ("Cellestis", Австралия), основанный на измерении уровня продукции IFNγ клетками периферической крови при стимуляции образцов крови антигенами микобактерий. В качестве антигенов используют белки ESAT-6, CFP-10 и ТВ 7.7 (р4) (Мордовская Л.И. Индукция IFNγ в образцах цельной венозной крови in vitro - тест для определения туберкулезного инфицирования детей и подростков. / Л.И. Мордовская, М.А. Владимирский, В.А. Аксенова, Е.Е. Ефремов, Г.И. Игнашенкова, Т.Н. Власик // Проблемы туберкулеза и болезней легких. - 2009. - №6. - С.19-24). Способ диагностики включает в себя взятие крови у пациента, последующее культивирование каждого образца цельной крови, стабилизированной гепарином, при 37°C в течение 18-24 часов в трех пробирках: первая (антигениндуцированная продукция) - в присутствии антигенов микобактерий, вторая (спонтанная продукция) - без антигенов, третья (митогениндуцированная продукция) - в присутствии митогена (последняя проба используется в качестве положительного контроля). После окончания культивирования пробирки центрифугируют, отбирают плазму и определяют в них содержание IFNγ методом иммуноферментного анализа (ИФА). Результаты оцениваются с помощью программного обеспечения QFT 2.62, предоставляемого производителем. Результаты теста считаются положительными, если разность между антигениндуцированной и спонтанной продукций IFNγ более 0,35 МЕ/мл и разница между митогениндуцированной и спонтанной продукцией IFNγ более 0,5 МЕ/мл.

Основным недостатком этого метода является то, что он не позволяет проводить дифференциальную диагностику активного ТБ и латентной туберкулезной инфекции (ЛТБИ), что представляется актуальным в условиях широкого (по разным оценкам до 80%) распространения туберкулезного инфицирования.

Задачей, решаемой авторами, являлась разработка достаточно быстрого и надежного способа диагностики туберкулеза, позволяющего проводить дифференциальную диагностику активного туберкулеза и латентной туберкулезной инфекции. Указанная задача решалась путем установления круга белков, продуцируемых клетками крови у инфицированных туберкулезом больных в присутствии антигенов Mycobacterium tuberculosis, отбора специфичных цитокинов и определения пороговых значений, позволяющих диагностировать наличие у больного активной формы туберкулеза и латентную туберкулезную инфекцию.

Технический результат достигался культивированием крови больных с подозрением на туберкулез в присутствии коммерчески выпускаемой смеси белков ESAT-6, CFP-10, ТВ 7.7 (из набора "QuantiFERON-TB Gold In-Tube") в качестве антигенов, последующим определением в плазме крови интерферона-гамма (IFNγ), интерлейкина-6 (IL-6) и трансформирующего ростового фактора-альфа (TGFα), и диагностирования активной формы туберкулеза при достижении хотя бы одним из цитокинов порогового значения, которое составляет для: IFNγ_AG - 6,4 МЕ/мл, для TGFα_NIL - 17,0 пг/мл и для IL-6_AG - 2039 пг/мл, а при значениях ниже пороговых по всем трем показателям - латентную туберкулезную инфекцию.

Предложенные критерии подобраны на основании клинических исследований 53 пациентов, у которых установлено наличие заражения МБТ. В состав группы входили 27 больных с впервые выявленным, преимущественно инфильтративным туберкулезом легких, подтвержденным культуральным методом до начала специфической противотуберкулезной терапии (13 женщин и 14 мужчин в возрасте от 18 до 64 лет, средний возраст - 36 лет), и 26 лиц с латентной инфекцией (ЛТБИ), которые являлись сотрудниками стационаров противотуберкулезных учреждений (n=26).

Изучалась спонтанная (NIL) и антигениндуцированная (AG) продукция различных цитокинов, в частности эпидермального ростового фактора (EGF), макрофагального воспалительного протеина - 1β (MIP-β), эндотелиального фактора роста (VEGF), интерлейкина-2 (IL-2), интерлейкина-4 (IL-4), интерлейкина-6 (IL-6), интерлейкина-1альфа (IL-1α), интерферона-альфа2 (IFN-α2), трансформирующего ростового фактора-альфа (TGFα), фактора некроза опухоли-альфа (TNFα), а также растворимого рецептора интерлейкина-2-альфа(sIL-2Rα) и растворимой формы лиганда CD40 (sCD40L). Исследования проводились с использованием магнитных частиц "Milliplex Mag" и анализатора "MagPix" ("Millipore", США) по технологии хМар.

Для статистических расчетов использовали значения спонтанной (NIL) продукции исследуемых биомаркеров, антигениндуцированной (AG) продукции и разности между ними (AG-NIL). Статистическую обработку проводили с помощью программы SPSS (версия 15.0). Для сравнения групп использовали критерий Манна-Уитни.

В таблице 1 приведены показатели, характеризующие различия в концентрациях цитокинов для сравниваемых групп.

Таблица 1 Сравнительная характеристика показателей спонтанной и стимулированной секреции цитокинов у больных с активной и латентной формами ТБ Показатель Больные с активной формой ТБ (n=27), Me (min, max) Лица с латентной формой ТБ (n=26), Me (min, max) р* Пороговое значение Чувствительность, % Специифичность, % AUC** IFNγ_AG, МЕ/мл 6.4 (1.6-10.2) 1.7 (1.0-3.6) 0.008 4.3 56 81 0.71 IFNγ_AG-NIL
МЕ/мл 5.3 (1.2-10.0) 1.6 (0.7-3.5) 0.014 3.9 56 81 0.70 TGFα_NIL, пг/мл 12.7 (10.0-18.4) 9.6 (5.6-11.7) 0.002 12.2 60 81 0.75 TGFα_AG, пг/мл 17.3 (15.1-20.5) 12.5 (8.0-15.1) 0.000 15.6 67 81 0.80 IFNα2_AG, пг/мл 7.4 (3.0-11.5) 3.0 (3.0-3.0) 0.041 6.0 56 81 0.66 TNFα_AG, пг/мл 141.7 (86.0-360.2) 94.9 (39.7-195.8) 0.039 223.2 37 81 0.67 sIL2-Rα_NIL, пг/мл 18.6 (3.0-46.9) 3.0 (3.0-11.0) 0.006 13.7 63 81 0.72 sIL2-Rα_AG, пг/мл 30.0 (5.9-76.7) 3.0 (3.0-13.2) 0.005 26.3 56 81 0.73 sIL2-Rα_AG-NIL, пг/мл 6.7 (0.0-13.0) 0.0 (0.0-13.1) 0.041 4.2 52 81 0.66 IL-_NIL, пг/мл 627.7 (214.8-1640.8) 212.9 (125.3-827.2) 0.037 887.2 45 81 0.67 IL-_АG, пг/мл 1463.0 (650.7-2973.6) 604.7 (306.3-1023.4) 0.018 257.0 56 81 0.69 Примечание: *р - достоверность различия между группой больных и контактных лиц, рассчитанная с использованием критерия Манна-Уитни. **AUC - площадь под характеристической ROC-кривой.

Для оценки диагностической ценности анализируемых цитокинов с помощью программы SPSS 15.0 был проведен анализ характеристической кривой (receiver-operating-characteristic curve-ROC) при фиксированном значении специфичности (81%). Были рассмотрены графические изображения характеристических кривых и значения площади под кривой - AUC (Area Under Curve). Данные анализа показали, что самостоятельно ни один из выделенных показателей не обладает высокой чувствительностью, что исключает возможность их изолированного использования с диагностической целью. В результате был применен метод построения деревьев решений в программе JMP 9.0, на основе полученных результатов которого было установлено, что совместное определение трех маркеров: IFNγ_AG, TGFα_NIL и IL-6_AG при пороговых значениях соответственно 6,4 МЕ/мл; 17,0 пг/мл и 2039 пг/мл является достаточным для отбора лиц в группу больных с активным ТБ и латентной туберкулезной инфекцией (ЛТБИ). Использование данной комбинации биомаркеров позволяет достигнуть 96,3% (26 из 27) селективности выявления случаев активного туберкулеза (Значение площади под ROC кривой в данном случае достигает 0,9.).

На фиг.1 приведена кривая операционной характеристики при использовании комбинации трех биомаркеров (IFNγ_AG, TGFα_NIL и IL-6_AG) для разделения лиц, инфицированных МБТ с активной и с латентной туберкулезной инфекцией.

Предлагаемый способ осуществляют следующим образом. Образцы цельной крови лиц (1000 мкл), инфицированных МБТ, стабилизированной гепарином (50 ед/мл), культивируют при 37°С в течение 18-24 часов в присутствии смеси антигенов микобактерий - белков ESAT-6, CFP-10, ТВ 7.7 и в нулевой контрольной пробирке (без антигенов). После окончания культивирования пробы центрифугируют, отделяют супернатант и определяют в нем количество IFNγ_AG, TGFα_NIL и IL-6_AG с помощью мультиплексного или иммуноферментного анализа по стандартным методикам. Затем сравнивают полученные значения содержаний цитокинов с пороговыми: 6,4 МЕ/мл для IFNγ_AG-NIL, 17,0 пг/мл для TGFα_NIL и 2039 пг/мл для IL-6_AG. При достижении пороговых значений хотя бы одним из показателей делают вывод о наличии активной формы ТБ, при значениях ниже пороговых по трем показателям одновременно - констатируют латентную туберкулезную инфекцию.

Сущность и преимущества способа иллюстрируются следующими примерами.

Пример 1. Больная Ф. Диагноз: инфильтративный туберкулез легких в фазе распада. Результат посева мокроты положительный. Результат теста на инфицирование М. tuberculosis (QuantiFERON-TB Gold in-tube): положительный.

В ходе проведения исследований были получены следующие концентрации биомаркеров:

IFNγ_AG - 24 МЕ/мл, TGFα_NIL - 14 пг/мл и IL-6_AG - 598 пг/мл.

Отмечено превышение уровня концентрации IFNγ по сравнению с

пороговым значением (6,4 МЕ/мл).

Заключение: активный туберкулезный процесс, что подтверждает клинический диагноз.

Пример 2. Больная Т. Диагноз: инфильтративный туберкулез верхней доли левого легкого в фазе распада. Результат посева мокроты положительный. Результат теста на инфицирование М. tuberculosis (QuantiFERON-TB Gold in-tube): положительный.

В ходе проведения исследований были получены следующие концентрации биомаркеров:

IFNγ_AG - 22, 6 МЕ/мл, TGFα_NIL - 9,75 пг/мл и IL-6_AG - 10000 пг/мл.

Сравниваем полученные значения с пороговыми:.

По двум показателям (IFNγ_AG, IL-6_AG) наблюдаем превышение пороговых значений (IFNγ - 6,4 МЕ/мл, 2039 пг/мл для IL-6).

Заключение: активный туберкулезный процесс.

Пример 3. Больная С. Диагноз: инфильтративный туберкулез легких в фазе распада и обсеменения. Результат посева мокроты положительный. Результат теста на инфицирование М. tuberculosis (QuantiFERON-TB Gold in-tube): положительный.

В ходе проведения исследований были получены следующие концентрации биомаркеров:

IFNγ_AG - 6,89 МЕ/мл, TGFα_NIL - 22,2 пг/мл и IL-6_AG - 755 пг/мл

По двум показателям (IFNγ_AG, TGFα_NIL) наблюдаем превышение пороговых

значений (IFNγ - 6,4 МЕ/мл, 17,0 пг/мл для TGFα).

Заключение: активный туберкулезный процесс.

Пример 4. Сотрудник противотуберкулезного диспансера Т. Результат теста на инфицирование М. tuberculosis (QuantiFERON-TB Gold in-tube): положительный.

Результаты рентгенологического обследования: изменений в легочной ткани не выявлено. Жалоб нет. Клинические признаки туберкулеза отсутствуют. В ходе проведения исследований были получены следующие концентрации биомаркеров:

IFNγ_AG - 4,9 МЕ/мл, TGFα_NIL - 11,6 пг/мл и IL-6_AG - 220 пг/мл.

Сравниваем полученные значения с пороговыми: IFNγ - 6,4 МЕ/мл, 17,0

пг/мл для TGFα и 2039 пг/мл для IL-6.

Заключение: латентная инфекция М. tuberculosis без признаков заболевания.

Пример 5. Сотрудник противотуберкулезного диспансера М. Результат теста на инфицирование М. tuberculosis (QuantiFERON-TB Gold in-tube): положительный. Результаты рентгенологического обследования: изменений в легочной ткани не выявлено. Жалоб нет. Клинические признаки туберкулеза отсутствуют.

В ходе проведения исследований были получены следующие концентрации биомаркеров:

IFNγ_AG - 3,1 МЕ/мл, TGFα_NIL - 0,1 пг/мл и IL-6_AG - 162 пг/мл.

Полученные значения ниже пороговых по всем трем показателям.

Заключение: латентная инфекция М. tuberculosis без признаков заболевания.

Пример 6. Больная Т. Диагноз: инфильтративный туберкулез верхней доли правого легкого. Результат посева мокроты положительный. Результат теста на инфицирование М. tuberculosis (QuantiFERON-TB Gold in-tube): положительный.

В ходе проведения исследований были получены следующие концентрации биомаркеров:

IFNγ_AG - 2,22 МЕ/мл, TGFα_NIL - 25,28 пг/мл и IL-6_AG - 3998 пг/мл.

По двум показателям (TGFα_NIL, IL-6_AG) наблюдали превышение пороговых значений (TGFα_NIL - 17 пг/мл, 2039 пг/мл для IL-6).

Заключение: активный туберкулезный процесс.

Преимуществами предлагаемого способа по сравнению с традиционными методами является то, что при анализе небольшого количества периферической крови достигается высокая диагностическая значимость в дифференциации между лицами с активным туберкулезом и лицами с латентной туберкулезной инфекцией. Риск для пациента от применения данного способа сведен к минимуму, так как не требует введения инородных агентов в организм пациента. Способ не влияет на здоровье пациентов и позволяет ускорить, стандартизировать и автоматизировать процесс получения окончательного результата диагностики. Несомненным преимуществом является удобство для пациента, так как для оценки результатов не требуется повторного посещения врача.

Изобретение относится к медицине, а именно к фтизиатрии и иммунологии, и может быть использовано для определения активности туберкулезного процесса. Для этого проводят инкубацию цельной крови пациента крови с микобактериальными антигенами, представляющими собой смесь белков ESAT-6, CFP-10, ТВ 7.7, центрифугирование пробы с отделением плазмы и определение в супернатантах содержания антигениндуцированного гамма-интерферона (IFNγ), антигениндуцированного интерлейкина - 6 (IL-6) и спонтанной продукции трансформирующего ростового фактора-α (TGFα). При уровне IFNγ≥6,4 МЕ/мл, или IL-6≥2039 пг/мл, или TGFα≥17,0 пг/мл констатируют активную туберкулезную инфекцию. При значениях ниже пороговых по всем трем показателям - латентную инфекцию. Использование данного способа позволяет проводить дифференциальную диагностику между лицами с активным туберкулезом и латентной туберкулезной инфекцией. 6 пр., 1 ил., 1 табл.

Способ диагностики туберкулеза легких, включающий в себя взятие периферической крови пациента, инкубацию цельной крови с микобактериальными антигенами, представляющими собой смесь белков ESAT-6, CFP-10, ТВ 7.7, и без них, центрифугирование пробы с отделением плазмы, определение в супернатантах гамма-интерферона, отличающийся тем, что в супернатантах лиц, инфицированных микобактериями, кроме антигениндуцированной продукции гамма-интерферона определяют содержание антигениндуцированного интерлейкина-6 и спонтанную продукцию трансформирующего ростового фактора-альфа и при уровне гамма-интерферона ≥6,4 МЕ/мл, или интерлейкина-6 ≥2039 пг/мл, или трансформирующего ростового фактора-альфа ≥17,0 пг/мл констатируют активную туберкулезную инфекцию, а при значениях ниже пороговых по всем трем показателям - латентную инфекцию.