ШТАММ "NADL-ВНИИЗЖ" ВИРУСА ВИРУСНОЙ ДИАРЕИ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА DIARRHEA VIRUS BOVINUM ДЛЯ ИЗГОТОВЛЕНИЯ БИОПРЕПАРАТОВ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ, СПЕЦИФИЧЕСКОЙ ПРОФИЛАКТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ ВИРУСНОЙ ДИАРЕИ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА Российский патент 2012 года по МПК C12N7/00 A61K39/12 

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии, в частности, к новому штамму вируса вирусной диареи (ВД) крупного рогатого скота (КРС), который можно использовать при разработке и изготовлении средств диагностики, специфической профилактики и лечения ВД КРС.

ВД (болезнь слизистых оболочек, мукозальная болезнь, инфекционная диарея КРС, инфекционный энтерит КРС, диарея новорожденных телят) - остропротекающая болезнь КРС, преимущественно молодых животных, характеризующаяся эрозивно-язвенным воспалением слизистых оболочек пищеварительного тракта, ринитом, увеличением лимфатических узлов, высокой лихорадкой, общим угнетением, лейкопенией, постоянной или перемежающейся диареей, эрозивным и язвенным стоматитом с обильным слюноотделением, появлением слизисто-гнойных истечений из носовой полости, абортами, мертворождениями, диареями новорожденных телят и иммунодефицитным состоянием.

ВД КРС является одной из наиболее распространенных вирусных инфекций. Заболевание зарегистрировано во многих странах мира, в том числе и в России. Заболевание наносит большой экономический ущерб скотоводству. Убытки животноводческим хозяйствам от вирусной диареи складываются из падежа и вынужденного убоя молодняка, потери упитанности, снижения молочной продуктивности, абортов, рождения нежизнеспособных телят и др.

ВД чаще всего проявляется в виде эпизоотических вспышек среди молодняка на животноводческих фермах и комплексах. Заболеваемость колеблется от 10 до 100%, летальность - от 5 до 95%. Это зависит от вирулентности штамма вируса, резистентности организма животных, уровня иммунитета, зоогигиенических условий содержания животных.

Возбудителем ВД КРС является РНК-геномный вирус, относящийся к семейству Flaviviridae, роду Pestivirus. Согласно классификации, основанной на ПЦР-анализе, штаммы вируса ВД КРС предложено разделить на 2 генотипа, антигенно различающихся между собой. Референсные штаммы (Singer, Oregon C24V, NADL, New York) отнесены к первому генотипу (BVDV-1), а представители новой группы штаммов вируса ВД КРС (Waters, 890), выделенные в начале 90-х г.г. прошлого века при вспышках ВД КРС в США и Канаде и имеющие генетические отличия от референсных штаммов, отнесены ко второму серотипу (BVDV-2).

Основным источником и резервуаром возбудителя ВД КРС являются персистентно инфицированные животные, которые при клинически здоровом состоянии организма выделяют вирус, заражая восприимчивое поголовье КРС.

В связи с этим важнейшими условиями борьбы с этим заболеванием являются своевременная и правильная диагностика, проведение мер специфической профилактики и лечения, что в свою очередь предполагает получение в достаточном количестве вирусного антигена.

Для специфической профилактики ВД КРС применяют живые и инактивированные вакцины. Указанные вакцины готовят обычно из актуальных производственных штаммов возбудителя ВД, антигенные свойства которых соответствуют антигенным свойствам эпизоотических штаммов вируса (1-4).

Известен ряд штаммов вируса ВД КРС, используемых для изготовления диагностических и вакцинных препаратов против ВД КРС.

Известен штамм ВК-1 (В-1) №28 вируса ВД КРС, полученный в первичнотрипсинизированной культуре клеток почки теленка (ПТ) или ее субкультуре с инфекционной активностью 4,0÷6,5 lg ТЦД₅₀/см³ и используемый для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики ВД КРС (5÷7).

Известен штамм «Oregon C24V» вируса ВД КРС, полученный в чувствительной биологической системе культивирования и используемый для изготовления инактивированной вакцины против ВД КРС (8).

Известен штамм «Singer» вируса ВД КРС, полученный в чувствительной биологической системе культивирования и используемый для изготовления живой вакцины против ВД КРС (8).

Известен штамм «Siwer» вируса ВД КРС, полученный в чувствительной биологической системе культивирования и используемый для изготовления инактивированной вакцины против ВД КРС (8).

Известен штамм «Казахстанский» вируса ВД КРС, полученный в чувствительной биологической системе культивирования и используемый для изготовления инактивированной вакцины против ВД КРС (8).

Известен штамм «СР7» вируса ВД КРС, полученный в чувствительной биологической системе культивирования и используемый для изготовления вакцинных препаратов против ВД КРС (9).

Наиболее близким предлагаемому изобретению по совокупности существенных признаков является штамм «NADL» вируса ВД КРС, полученный в перевиваемой культуре клеток носовых перегородок (ВТ) КРС с титром инфекционной активности 6,75 lg ТЦД₅₀/0,2 см³ и используемый для изготовления биопрепаратов для диагностики, специфической профилактики и лечения ВД КРС (10).

Недостатки вышеуказанных штаммов вируса ВД КРС, в том числе и штамма - прототипа, состоят в том, что приготовленные на их основе вакцины обеспечивают эффективную защиту животных только от заражения гомологичным вирусом.

Задача, на решение которой направлено настоящее изобретение, заключается в расширении арсенала штаммов вируса ВД КРС, обладающих высокой инфекционной, антигенной и иммуногенной активностью в нативном виде и сохраняющих антигенную и иммуногенную активность после инактивации, обеспечивая тем самым получение чувствительных и высокоспецифичных диагностикумов и вакцинных препаратов, создающих эффективную защиту поголовья КРС от эпизоотического возбудителя ВД КРС, циркулирующего на территории РФ.

Указанная задача решена получением штамма «NADL-ВНИИЗЖ» (авторское наименование) вируса ВД КРС, используемого для изготовления биопрепаратов для диагностики, специфической профилактики и лечения ВД КРС.

Источником для получения производственного штамма «NADL-ВНИИЗЖ» вируса ВД КРС послужил референсный штамм «NADL» вируса ВД КРС, полученный ФГУ «ВНИИЗЖ» 11.08.2004 г. из коллекции типовых культур АТСС США.

Производственный штамм «NADL-ВНИИЗЖ» получен путем многократных последовательных пассажей на чувствительных биологических системах культивирования.

Штамм «NADL-ВНИИЗЖ» адаптирован к монослойным перевиваемым культурам клеток почки сайги (ПС), почки теленка Таурус-2 и почки теленка RBT, имеет стабильные биотехнологические свойства, которые позволяют использовать его в качестве производственной расплодки для получения антигенного материала для инактивированной вакцины против ВД КРС, диагностических антигенов и сывороток, а также препаратов антител, используемых для лечения больных телят.

Полученный штамм «NADL-ВНИИЗЖ» вируса ВД КРС депонирован 4 августа 2009 года во Всероссийскую государственную коллекцию штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве, Федерального государственного учреждения «Всероссийский государственный центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» (ФГУ «ВГНКИ») под регистрационным номером (ссылкой) - производственный штамм «NADL-ВНИИЗЖ» - ДЕП вируса диареи КРС.

По сравнению с исходным штаммом штамм «NADL-ВНИИЗЖ» имеет генетические и фенотипические особенности. В отличие от штамма «NADL» штамм «NADL-ВНИИЗЖ» культивируется в культурах клеток RBT, ПС и Таурус-2, обладает биологической, антигенной и иммуногенной активностью в нативном виде и после инактивации.

Экспериментально подтверждена возможность его использования для приготовления диагностических, вакцинных и лечебных препаратов. Штамм «NADL-ВНИИЗЖ» обеспечивает получение инактивированной вакцины против ВД КРС, создающей эффективную защиту КРС против указанного возбудителя.

Сущность изобретения пояснена на графическом изображении, на котором представлена дендрограмма, отражающая филогенетические отношения штамма «NADL-ВНИИЗЖ» с референсными штаммами вируса ВД КРС (основана на сравнении нуклеотидных последовательностей 5'-нетранслируемой области 193-341 н.); а также нуклеотидной последовательностью 5'-нетранслируемой области генома вируса ВД КРС штамма «NADL-ВНИИЗЖ».

Штамм «NADL-ВНИИЗЖ» вируса ВД КРС характеризуется следующими признаками и свойствами.

Морфологические признаки

Штамм «NADL-ВНИИЗЖ» вируса ВД КРС относится к семейству Flaviviridae, роду Pestivirus и обладает морфологическими признаками, характерными для возбудителя ВД КРС: сферический вирион диаметром 40-60 нм состоит из нуклеокапсида икосаэдрической симметрии, содержащего позитивную одноцепочечную РНК.

Антигенные свойства

По своим антигенным свойствам штамм «NADL-ВНИИЗЖ» относится к первому генотипу.

Вирус стабильно нейтрализуется гомологичной антисывороткой.

Вирус реагирует с антителами переболевших или иммунизированных животных в реакции иммуноферментного анализа (ИФА) и реакции микронейтрализации (РМН). При вакцинации лабораторных и естественно-восприимчивых животных инактивированный вирус индуцирует образование вирусспецифических и вируснейтрализующих антител в организме морских свинок в титрах от 10,9 до 11,2 log₂ в ИФА и 7,0 log₂ в РМН, у кроликов - от 10,8 до 11,4 log₂ (ИФА) и от 6,0 до 7,1 log₂ (РМН), у телят и коров - от 10,2 до 10,7 log₂ (ИФА) и от 7,6±0,40 до 7,3±0,31 log₂ (РМН).

Генотаксономическая характеристика

Геном штамма NADL-ВНИИЗЖ» вируса ВД КРС представлен позитивной одноцепочечной РНК размером около 12500 нуклеотидов с единственной открытой рамкой считывания. Открытая рамка считывания начинается с 386 нуклеотида. Вся информация о протеинах содержится в одной рамке считывания.

Выделено и охарактеризовано 10 протеинов: 4 структурных и 6 неструктурных. Одноцепочечная РНК связана с капсидным протеином р14/С, окруженным наружными гликопротеинами (gp25/E1, gp53/E2, gp48/E0), и липидной оболочкой.

Наружный гликопротеин gp53/E2 индуцирует в организме животных выработку вируснейтрализующих антител в высоких титрах. Протеин gp48/E0 способен индуцировать у инфицированных животных высокий уровень антител, но с низкой вируснейтрализирующей активностью. У инфицированных животных антитела к gp25/E1 вырабатываются в низких титрах.

Методом ОТ-ПЦР был амплифицирован участок генома вируса диареи КРС, включающий 149 и.о. 5'-нетранслируемой области.

В результате проведенных исследований было установлено, что штамм «NADL-ВНИИЗЖ» вируса диареи КРС является близкородственным референтному штамму «NADL», от которого отличается на анализируемом участке одним нуклеотидом.

Такие единичные замены в структуре белка, предположительно привели к существенным изменениям в антигенных свойствах вируса.

Биотехнологическая характеристика

Штамм «NADL-ВНИИЗЖ» вируса ВД КРС репродуцируется в перевиваемых культурах клеток почки теленка (MDBK, Таурус-2, ПТ, RBT), перевиваемой линии культуры клеток ПС, перевиваемой линии культуры клеток слизистой кишечника КРС (FBI) и внутривидовой гибридной перевиваемой линии культуры клеток почки эмбриона свиньи со спленоцидами свиньи (А₄С₂).

При 37°С в течение 72÷96 часов инкубирования вирус накапливается в титрах 6,0÷7,0 lg ТЦД₅₀/см³. Штамм «NADL-ВНИИЗЖ» вируса ВД КРС является стабильным и сохраняет свои свойства на протяжении 10 пассажей (срок наблюдения).

Физические свойства

Плавучая плотность вирионов в градиенте сахарозы находится в диапазоне 1,12÷1,13 г/см³, коэффициент седиментации вирионной РНК составляет 138S.

Устойчивость к внешним факторам

Штамм «NADL-ВНИИЗЖ» вируса ВД КРС наиболее устойчив при рН 7,4. Вирус хорошо сохраняется в нативном виде при 4°С, минус 20°С и минус 40°С. Вирус чувствителен к эфиру, хлороформу, трипсину, кислому значению рН (3,0) и дезоксихалату натрия; при 37°С погибает через 5 дней.

Инактивированный вирус ВД КРС штамма «NADL-ВНИИЗЖ» устойчив при хранении при 4°С как в нативном состоянии, так и в составе инактивированной вакцины.

Лиофилизация почти не влияет на его активность, однако многократное замораживание и оттаивание снижают вирулентность и иммуногенность вируса.

Дополнительные признаки и свойства

Антигенная активность - обладает антигенностью в составе инактивированной вакцины и препарата для гипериммунизации доноров диагностических и лечебных сывороток.

Реактогенность - реактогенными свойствами не обладает.

Стабильность - сохраняет исходные биологические (антигенные) свойства при пассировинии в культуре клеток Таурус-2, RBT, ПС в течение 10 серийных пассажей.

Патогенность - не патогенен для морских свинок, кроликов и белых мышей.

Вирулентность - выражена.

Контагиозность - выражена.

Онкогенность - отсутствует.

Свободен от контаминации бактериями, микоплазмами и посторонними вирусами.

Исходя из полученных данных можно утверждать, что штамм «NADL-ВНИИЗЖ» по антигенному и иммунологическому спектрам является оригинальным штаммом вируса ВД КРС.

Использование диагностических и вакцинных препаратов из штамма «NADL-ВНИИЗЖ» обеспечивает высокую эффективность мер борьбы с ВД КРС.

Сущность предлагаемого изобретения пояснена примерами его использования, которые не ограничивают объем изобретения.

Пример 1

Для выявления генома вируса ВД КРС штамма «NADL-ВНИИЗЖ» выделяли суммарную РНК, которую использовали для реакции ОТ и ПЦР. Был амплифицирован участок 5'-нетранслируемой области генома вируса диареи КРС длиной 174 нуклеотида. Была определена последовательность участка амплифицированного фрагмента длиной 149 нуклеотидов (193-341 н. согласно нумерации нуклеотидов генома штамма «NADL»). Сравнение данного участка с аналогичными участками генома референсных штаммов ВД КРС, полученных из биоинформационной системы GenBank, позволило установить, что максимальное сходство проявляется со штаммом «NADL». На изученном участке генома штамм «NADL» отличается от штамма «NADL-ВНИИЗЖ» одним нуклеотидом в позиции 200 (G->A).

Пример 2

Получение штамма «NADL-ВНИИЗЖ» в культуре клеток.

В настоящее время культура клеток является основной биологической системой для репродукции вируса ВД КРС и получения вируссодержащей суспензий, используемых при изготовлении вакцинных и диагностических препаратов. При выращивании культур клеток в качестве компонента ростовой среды используют сыворотку крови телят, взрослого КРС и эмбрионов КРС (фетальная). Такие сыворотки содержат, как правило, антитела ко многим респираторным и кишечным вирусам и могут быть контаминированы этими возбудителями.

Исходя из этого были проведены исследования по изучению наличия вирусспецифических антител в сыворотках, используемых для культивирования культур клеток.

Результаты исследований сывороток крови на наличие антител к вирусу ВД КРС, приведенные в табл.1, свидетельствуют, что все коммерческие серии препарата содержали антитела, а сыворотки северных оленей и фетальная были свободны от них.

На первом этапе было изучено влияние сывороток крови на накопление вируса ВД при адаптации к культуре клеток ПС. Результаты этих исследований представлены в табл.2.

Из данных, приведенных в табл.2, видно, что при культивировании клеток в среде Игла, содержащей 10% сыворотки крови северных оленей, вирус ВД КРС накапливался к 5÷6 пассажу в высоких титрах: с инфекционной активностью на культуре клеток ПС 6,7÷6,8 lg ТЦД₅₀/см³ антигенной активностью в ИФА 7,3÷7,4 log₂. Тогда как в среде Игла, содержащей коммерческую сыворотку крови КРС, накопление антигена ВД КРС было значительно ниже: инфекционная активность была максимальной на уровне 7 пассажа и составляла 3,5 lg ТЦД₅₀/см³, антигенная активность - 4,3 log₂.

При культивировании клеток в среде Игла, содержащей 10% фетальной сыворотки крови, возбудитель ВД КРС также накапливался в стабильно высоких титрах с инфекционной активностью в культуре клеток ПС 6,5÷6,6 lg ТЦД₅₀/см³ (к 6÷7 пассажу) и антигенной активностью в ИФА 7,0÷7,1 log₂.

Таким образом, предложенный метод культивирования вируса ВД КРС штамма «NADL-ВНИИЗЖ» в перевиваемой культуре клеток ПС с применением сыворотки крови северных оленей и фетальной сыворотки использован для получения вируссодержащей суспензии ВД КРС.

В последующем определяли чувствительность монослойных культур клеток, ПС, Таурус-2, ПТ, А₄С₂, MDBK, FBI, KST, Ch-91, РК-15, СПЭВ, ПСГК, ППК, VERO, Mark-145, ВНК-21 к вирусу ВД КРС штамма «NADL-ВНИИЗЖ». Вирус адаптировали к каждой культуре клеток в течение 4-5 пассажей. Для опытов использовали культуры с полностью сформированным монослоем. Культивирование осуществляли в стеклянных матрасах объемом 50 см³. Перед заражением культуры клеток ростовую среду сливали, монослой отмывали раствором Хенкса. Культуру клеток инфицировали вирусом с множественностью заражения 0,1÷0,5 ТЦД₅₀/кл и оставляли на контакт в термостате при 37±0,5С° в течение 1 часа. После контакта добавляли соответствующую для каждой культуры клеток поддерживающую питательную среду без сыворотки (Игла, ПСП). За культурой клеток (обычно 96÷120 часов) ежедневно велось наблюдение (микроскопия). При поражении 50÷60% монослоя вирус замораживали при температуре минус 40±1°С. В качестве контроля оставляли по одному матрасу с каждой незараженной культуры клеток. Оттаявшую суспензию повторно замораживали-оттаивали и после оттаивания отбирали пробы для определения наличия вируса в ИФА. Определение активности вируса проводили методом титрования в культуре клеток ПС. Для следующего пассажа в качестве матровой расплодки использовали пробы с наибольшим титром. Результаты изучения чувствительности перевиваемых культур клеток к вирусу ВД КРС штамма «NADL-ВНИИЗЖ» представлены в табл.3.

Как следует из данных табл.3, нам удалось адаптировать вирус ВД КРС к следующим культурам клеток: ПС, Таурус-2, RBT, ПТ, MDBK, FBI, Ch-91 и А₄С₂. Наиболее технологичными и высокопродуктивными оказались перевиваемые культуры клеток ПС, Таурус-2 и RBT. В этих клетках уже к 5 пассажу за 96÷120 часов вирус накапливался на уровне 6,5÷7,0 lg ТЦД₅₀/см³. Культура клеток А₄С₂ (перевиваемая линия культуры клеток гибрида почки эмбриона свиньи со спленоцитами свиньи) была нами выбрана как гетерологичная. Титр вируса в этой культуре клеток составлял 5,8÷6,2 lg ТЦД₅₀/см³.

Клеточные линии FBI, KST, Ch-91 оказались менее чувствительными к вирусу ВД КРС штамма «NADL-ВНИИЗЖ». Накопление вируса в этих культурах клеток составляло 3,0÷5,5 lg ТЦД₅₀/см³. К культурам клеток РК-15, СПЭВ, ПСГК, ППК-66б, Vero, Mark-145, BHK-21 адаптировать вирус в течение 5 пассажей нам не удалось.

В дальнейшем проведена адаптация вируса ВД КРС штамма «NADL-ВНИИЗЖ» к монослойным перевиваемым культурам клеток ПС и Таурус-2.

Полученные результаты позволили рекомендовать вирус, репродуцированный в культуре клеток ПС, Таурус-2 и RBT, для изготовления инактивированной вакцины.

Изготовление инактивированных вакцин требует большого объема вирусного сырья и вопрос повышения урожайности вируса всегда остается актуальным. Кроме того, важной остается задача повышения чувствительности клеток к вирусу, что позволяет устранить вероятность его модификации, так как в клетках с низкой чувствительностью только небольшая часть вирусной популяции способна репродуцироваться при условиях, отличающихся от оптимальных.

Для определения влияния рН на репродукцию вируса по окончании культивирования клеток меняли ростовую среду на поддерживающую со значениями 6,3÷6,5; 6,9÷7,1; 7,2÷7,4; 7,9÷8,1. Затем отключали термостат и выдерживали культуры клеток в течение 18÷20 ч. Перед заражением клеток сливали поддерживающую среду и вносили вирус в дозе 0,1÷0,5 ТЦД₅₀/кл. После часового контакта заливали поддерживающую среду со стандартным значением рН 7,2÷7,4. Результаты оценивали визуально по степени поражения монослоя, а также в ИФА и титрованием на культуре клеток ПС. Результаты влияния рН среды на репродукцию вируса ВД КРС представлены в табл.4.

Нами установлено, что экспозиция клеток в течение 18÷20 часов при кислом значении рН (6,3÷6,5) среды до инфицирования их вирусом сопровождается, начиная со 2 пассажа, возрастанием антигенной и инфекционной активности вируса до 6,6 log₂ и 6,0 lg ТЦД₅₀/см³ соответственно. С увеличением количества пассажей до 7 титр вируса увеличивается до 8,9 log₂ в ИФА и 8,1 lg ТЦД₅₀/см³. При этом сокращается время культивирования до 72 часов. Эти показатели выше результатов, полученных при нейтральном значении рН (7,2÷7,4), на 1,5 log₂.

Таким образом, подготовительный этап перед заражением клеток вирусом с использованием слабокислой среды повышал чувствительность клеток к инфицированию и влиял на уровень накопления возбудителя.

В ходе проведенных исследований получен вирус, который был подвергнут всестороннему контролю в соответствии с руководством МЭБ по стандартным диагностическим тестам и вакцинам (2004 г.) и на уровне восьмого пассажа заложен на хранение в качестве матровой расплодки. Вирус матровой расплодки с титром инфекционной активности 6,5 lg ТЦД₅₀/см³ представлен в виде нативной суспензии культуральной жидкости и пораженного монослоя, хранится при температуре минус 40С°.

Полученному штамму вируса ВД КРС присвоено авторское наименование «NADL-ВНИИЗЖ».

Штамм «NADL-ВНИИЗЖ» вируса ВД КРС депонирован 4 августа 2009 года во Всероссийскую государственную коллекцию штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве, ФГУ «ВГНКИ» под регистрационным номером (ссылкой) - производственный штамм «NADL-ВНИИЗЖ» - ДЕП вируса диареи КРС.

Пример 3

Штамм «NADL-ВНИИЗЖ» вируса ВД КРС используют для получения высокоактивной гипериммунной сыворотки, предназначенной для обнаружения вирусспецифического антигена в пробах патологического материала от больных ВД и павших животных, в инфицированных культурах клеток, а также для лечения заболевших животных.

Для получения гипериммунной сыворотки используют кроликов живой массой 2,5÷3,0 кг и морских свинок массой 0,4÷0,5 кг. Для получения гипериммунной сыворотки используют 5 кроликов и 10 морских свинок.

Для иммунизации животных используют вируссодержащую суспензию вируса ВД КРС штамма «NADL-ВНИИЗЖ» с титром инфекционной активности от 9,0 до 10,5 lg ТЦД₅₀/см³ и антигенной активностью в ИФА от 9,9 до 10,5 log₂. Исходную вируссодержащую суспензию трижды замораживают оттаивают, осветляют низкоскоростным центрифугированием в течение 30 минут. Для инактивации полученного вируса используют аминоэтилэтиленимин (АЭЭИ). АЭЭИ добавляют в вируссодержащую суспензию до конечной концентрации 0,1÷0,15%. Инактивацию вируса проводят при 37°С в течение 24 часов. Гипериммунизацию доноров проводят эмульсией, полученной смешиванием инактивированного антигена и масляного адъюванта в соотношении 1:1. Смесь гомогонезируют до получения стабильной эмульсии типа «вода-масло». В качестве маслянного адъюванта используют масляный адъювант Montanide ISA-70 производства фирмы "SEPPIC" (Франция, стандарт ИСО 9001).

Животным вводят подогретую на водяной бане до (+30°С)÷(+37°С) эмульсию.

Кроликов иммунизируют в дозе 2 см³ трехкратно по схеме:

1) в мякиши задних конечностей;

2) через 7÷10 дней после первой иммунизации в подколенные лимфоузлы;

3) через 21 день после первой - внутримышечно.

Через 10÷15 дней после окончания гипериммунизации доноров обескровливают и получают сыворотку для исследования на наличие антител. Титр антител определяют в ИФА.

Морских свинок иммунизируют полученной эмульсией в дозе 1 см³ в заднебедренную группу мышц. Инъекцию повторяют через 7, 14, 21 день, меняя при этом место введения.

Результаты проверки активности полученных гипериммунных сывороток представлены в табл.5. Приведенные в табл.5 данные свидетельствуют о высокой антигенной активности гипериммунной сыворотки, полученной на штамм «NADL-ВНИИЗЖ» вируса ВД КРС.

Пример 4

Для получения вакцины против ВД КРС инактивированной эмульсионной матровый вирус штамма «NADL-ВНИИЗЖ» репродуцируют заражением монослоя культуры клеток Таурус-2, RBT или ПС, выращенных в 1,5 дм³ матрасах. Охлажденную при 4 С° вируссодержащую суспензию, соблюдая стерильные условия, освобождают от клеточного детрита известным способом, используя низкоскоростное центрифугирование, и сливают в емкость. Осажденная от детрита суспензия должна иметь вид прозрачной жидкости розового или вишневого цвета. Затем из емкости отбирают пробу для производственного контроля вирусного сырья. Производственная серия вируса ВД КРС должна иметь инфекционную активность не менее 6,0÷7,0 lg ТЦД₅₀/см³ и антигенной активностью в ИФА не менее 6,4÷7,4 log₂.

Инактивацию вирусного сырья осуществляют с помощью 6% раствора АЭЭИ, вносимого в суспензию вируса ВД КРС до конечной концентрации 0,1÷0,15% при температуре 36÷37°С в течение 24 ч с периодическим помешиванием.

Инактивированный антиген смешивают с масляным адъювантом в соотношении 3:7 в течение 10÷15 мин при температуре 10÷15°С. При этом получают однородную эмульсию белого цвета типа «вода-масло». В качестве масляного адъюванта используют масляный адъювант Montanide ISA-70 производства фирмы "SEPPIC" (Франция, стандарт ИСО 9001).

Полученную вакцину контролируют на авирулентность и стерильность, а затем фасуют в стерильные флаконы.

Стерильность вакцины определяют в соответствии с ГОСТ 28085-89. Авирулентность препарата определяют методом трехкратных последовательных пассажей инактивированного антигена в перевиваемых культурах клеток по отсутствию ЦПД.

Полученная вакцина представляет собой эмульсию белого или бело-розового цвета слегка вязкой консистенции. При хранении допускается незначительное отслоение минерального масла в верхней и уплотнение эмульсии в нижней части флакона. При тщательном взбалтывании эмульсия приобретает однородную структуру.

Определение безвредности вакцины проводят на белых мышах (18÷20 г), морских свинках (0,4÷0,5 кг), 30-дневных телятах и глубокостельных коровах (7,0÷8,5 месяцев стельности).

Для проверки безвредности вакцину вводят внутримышечно в области бедра в дозе 0,1 см³ 10 белым мышам или в дозе 2,0 см³ 10 морским свинкам.

Каждую пятую серию вакцины проверяют на естественно восприимчивых животных. Вакцину вводят внутримышечно в области средней трети шеи по две прививные дозы.

Вакцина считается безвредной, если естественно восприимчивые животные и лабораторные животные в течение 10 сут остаются клинически здоровыми, без каких- либо патологических изменений. На месте введения препарата допускается местная тканевая реакция.

Антигенную активность каждой серии вакцины проверяют на кроликах. Вакцину вводят двукратно с интервалом 20÷25 сут пяти кроликам подкожно в области спины в объеме по 2 см³. Перед вакцинацией и через 28 сут после двукратного введения вакцины с интервалом 20÷25 сут у кроликов берут кровь, выдерживают при температуре (37±0,5)°С, отделяют сыворотку и исследуют на наличие антител к вирусу ВД КРС в ИФА и РМН.

Результаты исследований представлены в табл.6, 7.

Из результатов, приведенных в табл.6, видно, что уровень антител в сыворотках крови морских свинок, привитых эмульсионной вакциной против ВД КРС, колебался от 10,9±0,11 log₂ до 11,2±0,12 (ИФА) и от 7,0±0,01 log₂ до 7,0±0,34 log₂ (РМН).

При изучении антигенной активности инактивированной вакцины против ВД КРС на кроликах (табл.7) было установлено, что средний уровень антител к ВД КРС в сыворотке крови кроликов, привитых эмульсионной вакциной, составлял 11,1±0,21 log₂ (ИФА) и 7,0±0,29 log₂ (РМН).

Результаты исследований количественного контроля антигенной активности вакцины, представленные в табл.8, свидетельствуют о том, что в прививном объеме (1,0 см³) эмульсионной инактивированной вакцины содержится 4,18 иммунизирующих доз.

Таким образом, в ходе проведенных исследований установлено, что вакцина против ВД КРС эмульсионная инактивированная из штамма «NADL-ВНИИЗЖ» обладает высокой антигенной активностью.

При изучении антигенной активности инактивированной эмульсионной вакцины против ВД КРС из штамма «NADL-ВНИИЗЖ» на КРС установлено, что в пробах сывороток крови телят, привитых эмульсионной инактивированной вакциной, средний уровень антител к вирусу ВД КРС в ИФА составлял 10,7±0,31 log₂, а в РМН - 7,6±0,4 log₂. Средний уровень антител у глубокостельных коров, привитых эмульсионной вакциной, составлял в ИФА 10,2±0,35 log₂, в РМН - 7,3±0,31 log₂ (табл.9).

Полученные данные позволяют судить о высокой антигенной активности вакцины против ВД КРС эмульсионной инактивированной, изготовленной на основе штамма «NADL-ВНИИЗЖ».

Пример 5

Проведены испытания эффективности вакцины против ВД КРС инактивированной эмульсионной, полученной на основе штамма «NADL-ВНИИЗЖ» так, как описано в примере 4, в неблагополучном по ВД КРС хозяйстве ОАО ПСХ «Лучинское» Собинского района Владимирской области.

До вакцинации в хозяйстве отмечали массовые заболевания телят 1÷3-месячного возраста со следующей клинической картиной: угнетение, ухудшение аппетита, серозные истечения из носа, кашель и диарея. Количество молодняка КРС в хозяйстве составляло 180 голов, гибель среди заболевшего молодняка достигала 15%. В патологическом материале был обнаружен геном возбудителя ВД КРС.

В хозяйстве были сформированы 2 группы телят по 14 и 10 голов соответственно в возрасте 14÷30 дней живой массой 40÷50 кг. Животным первой группы вводили вакцину против ВД КРС инактивированную эмульсионную из штамма «NADL-ВНИИЗЖ» в дозе 1 см³. Вторая группа животных служила контролем. За животными вели наблюдение в течение одного месяца. Сыворотку крови животных на наличие антител исследовали в ИФА. Отбор сывороток крови проводили до вакцинации, перед ревакцинацией (на 21 день) и после ревакцинации (на 35 день). При введении испытуемой вакцины выработка гуморальных антител повышалась ко дню ревакцинации у вакцинированных животных до 9,9 log₂. На 35 день после ревакцинации титр антител увеличивался до 11,6 log₂.

Полученные данные свидетельствуют о высокой антигенной активности эмульсионной вакцины и ее способности индуцировать гуморальные антитела к вирусу ВД КРС.

В контрольной группе животных титр антител к 21 дню снижался и составлял 3,6 log₂. В этот период животные заболевали ВД КРС, по этой причине происходило повышение титров антител до 5,6 log₂ на 35 день после начала опыта. Применение вакцины позволило снизить падеж молодняка в хозяйстве с 15% до 3%.

Пример 6

Проведены испытания эффективности вакцины против ВД КРС инактивированной эмульсионной, полученной на основе штамма «NADL-ВНИИЗЖ» так, как описано в примере 4, в неблагополучном по ВД КРС хозяйстве ЗАО «Суворовское» Суздальского района Владимирской области. С этой целью коровам вводили вакцину внутримышечно в область средней трети шеи: первый раз - за 40÷45 дней до отела, второй - через 20÷25 суток после первичной иммунизации. Сыворотку крови животных на наличие антител исследовали в ИФА. В сыворотках крови, отобранных за 10÷15 дней до отела, уровень антител к вирусу ВД регистрировали от 9,2 до 11,0 log₂ после вакцинации эмульсионной вакциной.

Пример 7

Проведены испытания эффективности вакцины против ВД КРС инактивированной эмульсионной, полученной на основе штамма «NADL-ВНИИЗЖ» так, как описано в примере 4, на телятах и глубокостельных коровах в различных хозяйствах ряда регионов Российской Федерации. Результаты опытов представлены в таблице 10. Данные, приведенные в таблице 10, свидетельствуют, что в сыворотках крови телят, иммунизированных инактивированной эмульсионной вакциной против ВД КРС, средний уровень антител к вирусу ВД КРС в ИФА составил 10,7±0,31 log₂, а в реакции микронейтрализации (РМН) - 7,6±0,4 log₂.

Средний уровень антител у глубокостельных коров, привитых инактивированной эмульсионной вакциной против ВД КРС, составил в ИФА 10,2±0,35 log₂, в РМН - 7,3±0,31 log₂.

Таким образом, инактивированная эмульсионная вакцина против ВД КРС на основе штамма «NADL-ВНИИЗЖ» обладает высокой антигенной активностью, а титры антител, полученные в результате двукратной иммунизации животных, достигали достаточного уровня, чтобы защитить животных от инфекции и позволить профилактировать данное заболевание в хозяйствах.

Источники информации, принятые во внимание при составлении описания изобретения к заявке на выдачу патента РФ на изобретение «Штамм «NADL-ВНИИЗЖ» вируса вирусной диареи крупного рогатого скота Diarrhea virus bovinum для изготовления биопрепаратов для диагностики, специфической профилактики и лечения вирусной диареи крупного рогатого скота»

1. Сюрин В.Н., Самуйленко А.Я, Соловьев Б.В. и Фомина Н.В. Вирусные болезни животных. - М., ВНИТИБП, 1998. - С.135÷158.

2. Кириленко А.Н., Крупальник В.Л. Инфекционные болезни молодняка сельскохозяйственных животных. - М.: Колос, 2000. - С.91÷97.

3. Lindenbach Brett D., Thiel Heinz-Jürgen and Rice Charles М. Pestiviruses // Virology. Vol.1. [Viruses] ed. B.N. Fields [et al]. 5 th. ed. - Philadelphia, 2007. - P.1126÷1131.

4. Борознов С.Л. Желудочно-кишечные болезни телят: монография / С.Л.Борознов. - Витебск: ВГАВМ, 2009. - С.65÷68.

5. Пат. РФ №1789219; А61К 39/118, 39/12; 23.01.1993 г.

6. Пат. РФ №1835659; А61К 39/15, G01N 33/556; 27.05.1996 г.

7. Пат. РФ №2111011; А61К 39/295, А61К 39/15, А61К 39/155, 39/265; 20.05.1998 г.

8. Коромыслов Г.Ф. Иммунологические основы сохранения молодняка / Г.Ф.Коромыслов, Ю.Н.Федоров // Бюл. ВИЭВ. - М., 1988. - Вып.66. - С.3-4.

9. WO №2008034857; A61K 39/12, C12N 7/04; 27.03.2008 г.

10. Polak M.P. RT-PCR in diagnosis of BVBV infection / M.P.Polak, J.F.Zmudzinski // Bull. Vet. Inst. Pulawy. - 1999. - V.43, №2. - P.113÷118 (прототип).

Таблица 1 Уровень антител против вирусов в сыворотке крови северных оленей, коммерческой сыворотке КРС и фетальной сыворотке КРС Сыворотка крови Количество серий сывороток крови Титры антител к вирусам (log₂) ИРТ ПГ-3 рота корона ВД Северного оленя 15 - 2,9 - 3,0 - КРС 7 4,6 4,4 8,2 6,6 7,3 Остальная 4 - - - 4,0 -

Таблица 2 Зависимость репродукции вируса ВД КРС от вида сыворотки, используемой при культивировании культуры клеток ПС Пассаж Сыворотка животных северных оленей КРС фетальная Титр вируса lg ТЦД₅₀/см³ в ИФА, log₂ lg ТЦД₅₀/см³ в ИФА, log₂ lg ТЦЦ₅₀/см³ в ИФА, log₂ 1 4,8±0,23 5,0±0,35 н/и Отр. 4,2±0,30 н/и 2 4,4±0,30 5,8±0,32 н/и Отр. 4,1±0,14 5,5±0,35 3 5,8±0,30 6,5±0,24 Отр. 2,3±0,30 5,6±0,46 6,1±0,35 4 6,2±0,13 6,4±0,41 2,0±0,20 3,2±0,13 5,9±0,23 6,8±0,25 5 6,7±0,24 7,3±0,11 2,3±0,23 3,1±0,24 6,5±0,45 7,0±0,30 6 6,8±0,45 7,4±0,16 2,6±0,45 3,6±0,45 6,6±0,32 7,1±0,16 7 6,1±0,26 6,8±0,21 3,5±0,26 4,3±0,26 6,0±0,17 6,9±0,17 8 5,8±0,11 6,3±0,23 3,0±0,11 3,5±0,11 5,1±0,15 6,0±0,15 9 5,8±0,20 6,1±0,42 2,3±0,20 3,6±0,20 5,5±0,26 6,2±0,45 10 4,5±0,43 5,5±0,32 2,0±0.43 2,2±0,43 4,2±0,16 5,3±0,13

Таблица 3 Чувствительность перевиваемых культур клеток к вирусу ВД КРС штамма «NADL-ВНИИЗЖ» Культура клеток № пассажа Время культивирования (ч) Титр инфекционности (lg ТЦД₅₀/см³) ПС 5 96-120 6,5-6,7 Таурус-2 5 96 6,8-7,0 RBT 4 72-96 6,7-7,0 ПТ 5 120 6,4-6,7 А₄С₂ 5 72-96 5,8-6,2 MDBK 4 96 4,5-5,5 FBI 2 120 4,5-5,5 KST 2 120 4,0-5,0 Ch-91 4 120 3,0-4,0 РК-15 5 72 2,5-3,0 СПЭВ 5 120 0 ПСГК 5 120 0 ППК-666 5 96 0 Vero 5 96-120 0 Mark-145 5 96 0 BHK-21 5 72 0

Таблица 4 Влияние рН среды на репродукцию вируса ВД КРС в культуре клеток Таурус-2 рН поддерж. среды Методы определения Титр вируса Пассаж 1 2 3 5 7 6,3-6,5 lg ТЦД₅₀/см³ 4,1±0,24 6,0±0,34 7,3±0,22 7,9±0,18 8,1±0,26 ИФА (log₂) 4,8±0,23 6,6±0,14 7,8±0,23 8,6±0,16 8,9±0,18 6,9-7,1 lg ТЦД₅₀/см³ н/и 5,0±0,21 6,3±0,38 7,0±0,27 7,1±0,14 ИФА (log₂) 4,1±0,13 6,0±0,16 6,8±0,32 7,4±0,30 7,3±0,11 7,2-7,4 lg ТЦД₅₀/см³ 3,8±0,31- 4,5±0,31 6,5±0,30 6,8±0,26 6,6±0,15 ИФА (log₂) 4,3±0,16 5,3±0,11 6,9±0,16 7,1±0,22 7,0±0,11 7,9-8,1 lg ТЦД₅₀/см³ н/и 2,5±0,21 3,8±0,21- 4,6±0,25 4,7±0,24 ИФА (log₂) 2,0±0,31 3,3±0,16 4,8±0,20 5,3±0,26 5,3±0,14 Примечание: н/и - не исследовали

Таблица 5 Характеристика гипериммунных сывороток №№ п/п Активность сывороток крови в ИФА, log₂ морских свинок (n=10) кроликов (n=5) 1 11,7±0,16 12,1±0,14 2 12,5±0,14 11,2±0,26 3 13,7±0,10 13,4±0,12 4 12,9±0,41 12,5±0,12 среднее 12,7±0,9 12,3±0,87

Таблица 6 Антигенная активность вакцины против ВД КРС инактивированной эмульсионной из штамма «NADL-ВНИИЗЖ» на морских свинках Количество животных Средний уровень антител к вирусу ВД КРС в ИФА, log₂ в РМН, log₂ n=10 11,2±0,12 7,0±0,01 n=10 10,9±0,11 7,0±0,34

Таблица 7 Антигенная активность инактивированной эмульсионной вакцины против ВД КРС на кроликах № серии вакцины Титры антител к вирусу ВД КРС в ИФА, (log₂) КРС в РМН, (log₂) 1 10,8±0,11 6,5±0,34 2 10,9±0,28 6,0±0,30 3 11,3±0,32 7,1±0,24 4 11,4±0,15 6,5±0,28 среднее 11,1±0,21 7,0±0,29

Таблица 8 Результаты количественного контроля антигенной активности инактивированной эмульсионной вакцины против ВД КРС на морских свинках Наименование препарата ИмД₅₀ Количество иммунизирующих доз в прививном объеме вакцины Вакцина против вируса ВД КРС эмульсионная инактивированная 0,2389±0,01 4,18

Таблица 9 Уровень антител к вирусу ВД КРС у телят и глубокостельных коров, привитых инактивированной эмульсионной вакциной против ВД КРС, приготовленной на основе штамма «NADL-ВНИИЗЖ» №№ п/п Сыворотка крови животных Кол-во жив-х Титры антител к вирусу ВД КРС в ИФА, (log₂) в РМН, (log₂) 1 телят до вакцинации 60 6,3±0,91 2,9±0,62 2 телят после ревакцинации на 35 день 60 10,7±0,31 7,6±0,4 3 коров до вакцинации 58 7,0±0,62 3,5±0,53 4 коров за 10-15 дней до отела 58 10,2±0,35 7,3±0,31

Таблица 10 Уровень антител у телят и глубокостельных коров, привитых инактивированной эмульсионной вакциной против ВД КРС, приготовленной на основе штамма «NADL-ВНИИЗЖ» №№ п/п Сыворотка крови животных Кол-во жив-х Средний уровень антител в ИФА (log₂) Средний уровень антител в РМН (log₂) 1 телят до вакцинации 60 6,3±0,91   2 телят после ревакцинации на 35день 60 10,7±0,31   3 коров до вакцинации 58 7,0±0,62   4 коров за 10-15 дней до отела 58 10,2±0,35  

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии и биотехнологии. Получен новый производственный штамм «NADL-ВНИИЗЖ» вируса вирусной диареи крупного рогатого скота (ВД КРС). Штамм депонирован в коллекцию микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве, ФГУ «ВГНКИ» под регистрационным номером - производственный штамм «NADL-ВНИИЗЖ»-ДЕП вируса ВД КРС. Штамм репродуцируется перевиваемых культурах клеток почки теленка, перевиваемой линии клеток почки сайги, перевиваемой линии клеток слизистой кишечника КРС, внутривидовой гибридной перевиваемой линии клеток почки эмбриона свиньи со спленоцитами свиньи (А₄×С₂) при 37°С и в течение 72÷96 часов инкубирования вирус накапливается в них в титрах 6,0÷7,0 lg ТЦД₅₀/см³. Штамм является стабильным и сохраняет свои свойства на протяжении 10 пассажей. На основе штамма получены гипериммунные сыворотки крови к ВД КРС на кроликах и морских свинках, используемые для диагностики возбудителя и лечения заболевания животных. Инактивированная эмульсионная вакцина, приготовленная на основе штамма, защищает иммунизированных животных от прямого заражения вирулентным вирусом. Изобретение может быть использовано в ветеринарии. 1 ил., 10 табл., 7 пр.

Штамм «NADL-ВНИИЗЖ» вируса вирусной диареи крупного рогатого скота Diarrhea virus bovinum сем. Flaviviridae, рода Pestivirus, депонированный в коллекцию ФГУ «ВГНКИ» под регистрационным наименованием «NADL-ВНИИЗЖ»-ДЕП, для изготовления биопрепаратов для диагностики, специфической профилактики и лечения вирусной диареи крупного рогатого скота.