ВАКЦИНА ПРОТИВ ВИРУСНОЙ ДИАРЕИ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА Российский патент 2012 года по МПК A61K39/15 C12N7/00 A61P31/14 

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии и может быть использовано при разработке и изготовлении средств специфической профилактики вирусной диареи (ВД) крупного рогатого скота (КРС).

ВД (болезнь слизистых оболочек, мукозальная болезнь, инфекционная диарея КРС, инфекционный энтерит КРС, диарея новорожденных телят) - остропротекающая болезнь КРС, преимущественно молодых животных, характеризующаяся эрозивно-язвенным воспалением слизистых оболочек пищеварительного тракта, ринитом, увеличением лимфатических узлов, высокой лихорадкой, общим угнетением, лейкопенией, постоянной или перемежающейся диареей, эрозивным и язвенным стоматитом с обильным слюноотделением, появлением слизисто-гнойных истечений из носовой полости, абортами, мертворождениями, диареями новорожденных телят и иммунодефицитным состоянием.

ВД КРС является одной из наиболее распространенных вирусных инфекций. Заболевание зарегистрировано во многих странах мира, в том числе и в России. Заболевание наносит большой экономический ущерб скотоводству. Убытки животноводческим хозяйствам от ВД КРС складываются из падежа и вынужденного убоя молодняка, потери упитанности, снижения молочной продуктивности, абортов, рождения нежизнеспособных телят и др.

ВД чаще всего проявляется в виде эпизоотических вспышек среди молодняка на животноводческих фермах и комплексах. Заболеваемость колеблется от 10 до 100%, летальность - от 5 до 95%. Это зависит от вирулентности штамма вируса, резистентности организма животных, уровня иммунитета, зоогигиенических условий содержания животных.

Основным источником и резервуаром возбудителя ВД КРС являются персистентно инфицированные животные, которые при клинически здоровом состоянии организма выделяют вирус, заражая восприимчивое поголовье КРС.

Вакцинопрофилактика ВД занимает ведущее место в комплексе противоэпизоотических мер, направленных на борьбу с этим заболеванием.

Для специфической профилактики ВД КРС применяют живые и инактивированные вакцины.

В настоящее время живые вакцины широко испытаны с хорошими результатами, однако они имеют ряд недостатков. В связи с наличием реактогенности их не рекомендуют для вакцинации стельных животных, так как при внутриутробной передаче вирус может попасть в плод, который естественно более восприимчив к инфекции, что может закончиться абортом или рождением персистентно инфицированного теленка. Живые вакцины обладают определенным иммунодепрессивным действием, что может привести к активации других агентов бактериальной и вирусной природы. Кроме того, вакцинный вирус может значительное время персистировать в организме привитых животных, что приводит к широкому распространению вируса во внешней среде, создает опасность его реверсии и препятствует проведению диагностических мероприятий. Кроме того, аттенуированные штаммы возбудителя ВД КРС индуцируют, как правило, состояние иммунодепрессии у стельных коров и персистентно инфицированных телят. По этой причине в поствакцинальный период у животных отмечают повышение частоты секундарных, иногда летально протекающих инфекций.

Наряду с вирус-вакцинами против ВД КРС широко используют инактивированные вакцины как сорбированные, так и эмульсионные (1-6).

Известна вакцина против ВД КРС сорбированная инактивированная, содержащая активное вещество в виде авирулентного и очищенного антигенного материала из штамма «Орегон C-24V» вируса ВД КРС, полученного в чувствительной биологической системе, и целевую добавку в виде адъюванта-сорбента гидроокиси алюминия (ГОА) в эффективном соотношении (1).

Известна вакцина против ВД КРС инактивированная сорбированная, содержащая активное вещество в виде авирулентного и очищенного антигенного материала из штамма «Singer» вируса ВД КРС, полученного в чувствительной биологической системе, и целевую добавку в виде адъюванта-сорбента ГОА в эффективном соотношении (1).

Известна вакцина против ВД КРС инактивированная сорбированная, содержащая активное вещество в виде авирулентного и очищенного антигенного материала из штамма «Нью-Йорк-1» вируса ВД КРС, полученного в чувствительной биологической системе, и целевую добавку в виде адъюванта-сорбента ГОА в эффективном соотношении (1).

Известна вакцина против ВД КРС инактивированная сорбированная, содержащая активное вещество в виде авирулентного и очищенного антигенного материала из штамма «Казахстанский» вируса ВД КРС, полученного в чувствительной биологической системе с инфекционной активностью 5,5÷6,0 lg ТЦД₅₀/см³ до инактивации, и целевую добавку в виде адъюванта-сорбента ГОА в эффективном соотношении (7).

Наиболее близкой предлагаемому изобретению по совокупности существенных признаков является вакцина против ВД КРС инактивированная сорбированная, содержащая активное вещество в виде авирулентного и очищенного антигенного материала из штамма «Орегон C-24V» вируса ВД КРС, полученного в монослойной перевиваемой культуре клеток КСТ с инфекционной активностью не менее 7,0 lg ТЦД₅₀/см³ до инактивации, и целевую добавку в виде адъюванта-сорбента ГОА в эффективном соотношении (8, 9).

Недостатки известных вакцин инактивированных сорбированных против ВД КРС, в том числе и вакцины-прототипа, состоят в том, что они обеспечивают эффективную защиту животных только от заражения гомологичным вирусом.

Задача, на решение которой направлено настоящее изобретение, заключается в расширении арсенала вакцинных препаратов против ВД КРС инактивированных сорбированных, полученных на основе новых производственных штаммов вируса ВД КРС, обладающих высокой биологической, антигенной и иммуногенной активностью в нативном виде, сохраняющих антигенную и иммуногенную активность после инактивации и пригодных для изготовления высокоиммуногенных, безвредных и ареактогенных вакцинных препаратов, создающих эффективную защиту восприимчивых животных от гомологичного возбудителя ВД КРС.

Технический результат от использования предлагаемого изобретения заключается в расширении арсенала высокоиммуногенных, безвредных и ареактогенных вакцинных препаратов против ВД КРС сорбированных инактивированных, способных защитить поголовье КРС от гомологичного возбудителя ВД КРС.

Указанный технический результат достигнут созданием вакцины против ВД КРС сорбированной инактивированной, охарактеризованной следующей совокупностью признаков.

Предлагаемая вакцина содержит активное вещество в виде авирулентного и очищенного антигенного материала из штамма «NADL-ВНИИЗЖ» (авторское наименование) вируса ВД КРС, полученного в чувствительной биологической системе, целевые добавки в виде адъюванта-сорбента ГОА и адъюванта сапонина в эффективном соотношении.

Источником для получения производственного штамма «NADL-ВНИИЗЖ» вируса ВД КРС послужил референсный штамм «NADL» вируса ВД КРС, полученный ФГУ «ВНИИЗЖ» 11.08.2004 г. из коллекции типовых культур АТСС (США).

Производственный штамм «NADL-ВНИИЗЖ» получен путем многократных последовательных пассажей на чувствительных биологических системах культивирования.

Штамм «NADL-ВНИИЗЖ» адаптирован к перевиваемой культуре клеток млекопитающих, выбранной из группы, содержащей монослойную перевиваемую культуру клеток почки сайги (ПС), монослойную перевиваемую культуру клеток почки теленка (Таурус-2) и монослойную перевиваемую культуру клеток почки теленка (RBT), имеет стабильные биологические свойства, которые позволяют использовать его в качестве производственной расплодки для получения антигенного материала для вакцины против ВД КРС инактивированной сорбированной.

Штамм «NADL-ВНИИЗЖ» вируса ВД КРС депонирован 4 августа 2009 года во Всероссийскую государственную коллекцию штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве, Федерального государственного учреждения «Всероссийский государственный центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» (ФГУ «ВГНКИ») под регистрационным номером (ссылкой) - производственный штамм «NADL-ВНИИЗЖ» - ДЕП вируса диареи КРС.

По сравнению с исходным штаммом штамм «NADL-ВНИИЗЖ» имеет генетические и фенотипические особенности. В отличие от штамма «NADL» штамм «NADL-ВНИИЗЖ» репродуцируется в перевиваемых культурах клеток RBT, ПС и Таурус-2, обладает инфекционной, антигенной и иммуногенной активностью в нативном виде и сохраняет высокую антигенную и иммуногенную активность после инактивации.

Для получения антигенного материала из штамма «NADL-ВНИИЗЖ» вируса ВД КРС в качестве чувствительной биологической системы используют преимущественно перевиваемую культуру клеток Таурус-2.

При необходимости для получения антигенного материала из штамма «NADL-ВНИИЗЖ» вируса ВД КРС можно использовать также перевиваемые культуры клеток ПС и RBT.

Полученный вируссодержащий материал очищают от балластных примесей центрифугированием или любым другим известным методом.

Для инактивации вируса используют аминоэтилэтиленимин (АЭЭИ), который добавляют в очищенную вируссодержащую суспензию до концентрации (%): 0,1÷0,2. Инактивацию вируса ведут при 37°С в течение 24 часов. По окончании инактивации АЭЭИ нейтрализуют внесением тиосульфата натрия в суспензию антигена.

Предлагаемая вакцина содержит авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма «NADL-ВНИИЗЖ» вируса ВД КРС, полученного преимущественно в перевиваемой культуре клеток Таурус-2 с инфекционной активностью не менее 6,0 lg ТЦД₅₀/см³ и активностью в реакции иммуноферментного анализа (ИФА) не менее 6,6 log₂ до инактивации, в количестве (мас.%): 50,0÷80,0.

При необходимости предлагаемая вакцина может содержать авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма «NADL-ВНИИЗЖ» вируса ВД КРС, полученного в перевиваемой культуре клеток RBT с инфекционной активностью не менее 6,0 lg ТЦД₅₀/см³ и активностью в ИФА не менее 6,6 log₂ до инактивации, в количестве (мас.%): 50,0÷80,0.

При необходимости предлагаемая вакцина может содержать авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма «NADL-ВНИИЗЖ» вируса ВД КРС, полученного в перевиваемой культуре клеток ПС с инфекционной активностью не менее 6,0 lg ТЦД₅₀/см³ и активностью в ИФА не менее 6,6 log₂ до инактивации, в количестве (мас.%): 50,0÷80,0.

В качестве целевой добавки предлагаемая вакцина содержит адъювант-сорбент ГОА в количестве (мас.%): 19,6÷49,6.

При необходимости в качестве целевой добавки предлагаемая вакцина может содержать дополнительно адъювант сапонин в количестве 0,4 мас.%.

Предлагаемое изобретение включает следующую совокупность существенных признаков, обеспечивающих получение технического результата во всех случаях, на которые испрашивается правовая охрана:

1. Вакцина против ВД КРС сорбированная инактивированная.

2. Активное вещество в виде авирулентного и очищенного антигенного материала из штамма «NADL-ВНИИЗЖ» вируса ВД КРС в эффективном количестве.

3. Целевые добавки.

Признаками изобретения, характеризующими предложенную вакцину и совпадающими с признаками прототипа, в том числе родовое понятие, отражающее назначение, являются:

1. Вакцина против ВД КРС сорбированная инактивированная.

2. Активное вещество.

3. Целевые добавки.

По сравнению с вакциной-прототипом существенным отличительным признаком предлагаемой вакцины является то, что в качестве активного вещества она содержит авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма «NADL-ВНИИЗЖ» вируса ВД КРС в эффективном количестве.

Предлагаемое изобретение характеризуется также другими отличительными признаками, выражающими конкретные формы выполнения или особые условия его использования:

1. Авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма «NADL-ВНИИЗЖ» вируса ВД КРС, полученного в перевиваемой культуре клеток млекопитающих, в эффективном количестве.

2. Авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма «NADL-ВНИИЗЖ» вируса ВД КРС, полученного в перевиваемой культуре клеток Таурус-2, в эффективном количестве.

3. Авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма «NADL-ВНИИЗЖ» вируса ВД КРС, полученного в перевиваемой культуре клеток Таурус-2 с инфекционной активностью не менее 6,0 lg ТЦД₅₀/см³ и активностью в ИФА не менее 6,6 log₂ до инактивации, в количестве (мас.%): 50,0÷80,0.

4. Авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма «NADL-ВНИИЗЖ» вируса ВД КРС, полученного в перевиваемой культуре клеток ПС, в эффективном количестве.

5. Авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма «NADL-ВНИИЗЖ» вируса ВД КРС, полученного в перевиваемой культуре клеток ПС с инфекционной активностью не менее 6,0 lg ТЦД₅₀/см³ и активностью в ИФА не менее 6,6 log₂ до инактивации, в количестве (мас.%): 50,0÷80,0.

6. Авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма «NADL-ВНИИЗЖ» вируса ВД КРС, полученного в перевиваемой культуре клеток RBT, в эффективном количестве.

7. Авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма «NADL-ВНИИЗЖ» вируса ВД КРС, полученного в перевиваемой культуре клеток RBT с инфекционной активностью не менее 6,0 lg ТЦД₅₀/см³ и активностью в ИФА не менее 6,6 log₂ до инактивации, в количестве (мас.%): 50,0÷80,0.

8. Из целевых добавок адъювант-сорбент ГОА.

9. ГОА в количестве (мас.%): 19,6÷49,6.

10. Из целевых добавок дополнительно адъювант сапонин.

11. Сапонин в количестве 0,4 мас.%.

12. Авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма «NADL-ВНИИЗЖ» вируса ВД КРС, полученного в перевиваемой культуре клеток млекопитающих, взятой из группы, содержащей культуру клеток Таурус-2, культуру клеток ПС и культуру клеток RBT, с инфекционной активностью не менее 6,0 lg ТЦД₅₀/см³ и активностью в ИФА не менее 6,6 log₂ до инактивации, и целевые добавки ГОА и сапонин в соотношении, мас.%:

Антигенный материал 50,0÷80,0 ГОА 19,6÷49,6 Сапонин 0,4

Предлагаемая вакцина расширяет арсенал высокоиммуногенных, безвредных и ареактогенных вакцин против ВД КРС сорбированных инактивированных, обеспечивающих эффективную защиту поголовья КРС от заражения гомологичным возбудителем ВД КРС.

Достижение технического результата от использования предлагаемого изобретения объясняется тем, что вакцина содержит авирулентный и очищенный антигенный материал из нового штамма «NADL-ВНИИЗЖ» вируса ВД КРС, репродуцированного в культурах клеток Таурус-2, ПС и RBT с высокой инфекционной активностью до инактивации и обладающего высокой антигенной активностью и иммуногенностью после инактивации.

Экспериментально подтверждена возможность его использования для изготовления вакцины против ВД КРС сорбированной инактивированной, обеспечивающей эффективную защиту КРС против гомологичного возбудителя заболевания.

Штамм «NADL-ВНИИЗЖ» вируса ВД КРС характеризуется следующими признаками и свойствами.

Морфологические признаки

Штамм «NADL-ВНИИЗЖ» вируса ВД КРС относится к семейству Flaviviridae, роду Pestivirus и обладает морфологическими признаками, характерными для возбудителя ВД КРС; сферический вирион диаметром 40÷60 нм состоит из нуклеокапсида икосаэдрической симметрии, содержащего позитивную одноцепочечную РНК.

Антигенные свойства

По своим антигенным свойствам штамм «NADL-ВНИИЗЖ» относится к первому генотипу.

Вирус стабильно нейтрализуется гомологичной антисывороткой.

Вирус реагирует с антителами переболевших или иммунизированных животных в реакции иммуноферментного анализа (ИФА) и реакции микронейтрализации (РМН). При вакцинации лабораторных и естественно-восприимчивых животных инактивированный вирус индуцирует образование вирусспецифических и вируснейтрализующих антител в организме морских свинок в титрах от 10,9 до 11,2 log₂ в ИФА и 7,0 log₂ в РМН, у кроликов - от 10,8 до 11,4 log₂ (ИФА) и от 6,0 до 7,1 log₂ (РМН), у телят и коров - от 10,2 до 10,7 log₂ (ИФА) и от 7,6±0,40 до 7,3±0,31 log₂ (РМН).

Генотаксономическая характеристика

Геном штамма «NADL-ВНИИЗЖ» вируса ВД КРС представлен позитивной одноцепочечной РНК размером около 12500 нуклеотидов с единственной открытой рамкой считывания. Открытая рамка считывания начинается с 386 нуклеотида. Вся информация о протеинах содержится в одной рамке считывания.

Выделено и охарактеризовано 10 протеинов: 4 структурных и 6 неструктурных. Одноцепочечная РНК связана с капсидным протеином р14/С, окруженным наружными гликопротеинами (gp25/Е1, gp53/Е2, gp48/Е0), и липидной оболочкой.

Наружный гликопротеин gp53/Е2 индуцирует в организме животных выработку вируснейтрализующих антител в высоких титрах. Протеин gp48/Е0 способен индуцировать у инфицированных животных высокий уровень антител, но с низкой вируснейтрализирующей активностью. У инфицированных животных антитела к gp25/Е1 вырабатываются в низких титрах.

Методом ОТ-ПЦР был амплифицирован участок генома вируса диареи КРС, включающий 149 н.о. 5'-нетранслируемой области.

В результате проведенных исследований было установлено, что штамм «NADL-ВНИИЗЖ» вируса диареи КРС является близкородственным референтному штамму «NADL», от которого отличается на анализируемом участке одним нуклеотидом.

Такие единичные замены в структуре белка предположительно привели к существенным изменениям в антигенных свойствах вируса.

Биотехнологическая характеристика

Штамм «NADL-ВНИИЗЖ» вируса ВД КРС репродуцируется в перевиваемых культурах клеток почки теленка (MDBK, Таурус-2, ПТ, RBT), перевиваемой линии культуры клеток ПС, перевиваемой линии культуры клеток слизистой кишечника КРС (FBI) и внутривидовой гибридной перевиваемой линии культуры клеток почки эмбриона свиньи со спленоцидами свиньи (A₄C₂).

При 37°С в течение 72÷96 часов инкубирования вирус накапливается в титрах 6,0÷7,0 lg ТЦД₅₀/см³. Штамм «NADL-ВНИИЗЖ» вируса ВД КРС является стабильным и сохраняет свои свойства на протяжении 10 пассажей (срок наблюдения).

Физические свойства

Плавучая плотность вирионов в градиенте сахарозы находится в диапазоне 1,12÷1,13 г/см³, коэффициент седиментации вирионной РНК составляет 138S.

Устойчивость к внешним факторам

Штамм «NADL-ВНИИЗЖ» вируса ВД КРС наиболее устойчив при рН 7,4. Вирус хорошо сохраняется в нативном виде при 4°С, минус 20°С и минус 40°С. Вирус чувствителен к эфиру, хлороформу, трипсину, кислому значению рН (3,0) и дезоксихалату натрия; при 37°С погибает через 5 дней.

Инактивированный вирус ВД КРС штамма «NADL-ВНИИЗЖ» устойчив при хранении при 4°С как в нативном состоянии, так и в составе инактивированной вакцины.

Лиофилизация почти не влияет на его активность, однако многократное замораживание и оттаивание снижают вирулентность и иммуногенность вируса.

Дополнительные признаки и свойства

Антигенная активность - обладает антигенностью в составе инактивированной вакцины и препарата для гипериммунизации доноров диагностических и лечебных сывороток.

Реактогенность - реактогенными свойствами не обладает.

Стабильность - сохраняет исходные биологические (антигенные) свойства при пассировании в культуре клеток Таурус-2, RBT, ПС в течение 10 серийных пассажей.

Патогенность - не патогенен для морских свинок, кроликов и белых мышей.

Вирулентность - выражена.

Контагиозность - выражена.

Онкогенность - отсутствует.

Свободен от контаминации бактериями, микоплазмами и посторонними вирусами.

Исходя из полученных данных, можно утверждать, что штамм «NADL-ВНИИЗЖ» по антигенному и иммунологическому спектрам является оригинальным штаммом вируса ВД КРС.

Сущность предлагаемого изобретения пояснена примерами его исполнения, которые не ограничивают объем изобретения.

Пример 1

Источником для получения производственного штамма «NADL-ВНИИЗЖ» вируса ВД КРС послужил референсный штамм «NADL» вируса ВД КРС, полученный ФГУ «ВНИИЗЖ» 11.08.2004 г. из коллекции типовых культур АТСС США. Вакцинный штамм получен ФГУ «ВНИИЗЖ» путем культивирования в перевиваемых культурах клеток Таурус-2, RBT и ПС.

Результаты исследований по адаптации вируса ВД КРС штамма «NADL-ВНИИЗЖ» к перевиваемым культурам клеток Таурус-2, RBT и ПС представлены в таблицах 1, 2 и 3.

Полученный вирус был подвергнут всестороннему контролю в соответствии с руководством МЭБ по стандартным диагностическим методам и вакцинам (1996) и на уровне восьмого пассажа заложен на хранение в качестве матровой расплодки. Вирус матровой расплодки с титром инфекционной активности 6,5÷7,0 lg ТЦД₅₀/см³ представлен в виде лиофилизированной культуральной жидкости и хранится при температуре минус 40°С.

Полученному штамму вируса ВД КРС присвоено авторское наименование «NADL-ВНИИЗЖ».

Пример 2

Для получения вакцины против ВД КРС сорбированной инактивированной матровый вирус штамма «NADL-ВНИИЗЖ» репродуцируют заражением монослоя перевиваемой культуры клеток Таурус-2 или RBT, или ПС, выращенных в 1,5 дм³ матрасах или вращающихся сосудах объемом 3 дм³. Охлажденную при 4°С вируссодержащую суспензию, соблюдая стерильные условия, освобождают от клеточного детрита известным способом, используя низкоскоростное центрифугирование (2500÷3000 об/мин в течение 30 минут) и сливают в емкость.

Освобожденная от детрита суспензия должна иметь вид прозрачной жидкости розового цвета. Затем из емкости отбирают пробу для производственного контроля вирусного сырья. Производственная серия вируса ВД КРС должна иметь инфекционную активность не меньше 6,0 lg ТЦД₅₀/см³ и активность в ИФА не меньше 6,6 log₂.

Инактивацию вирусного сырья осуществляют с помощью 6% раствора АЭЭИ, вносимого в вирусную суспензию до конечной концентрации 0,1÷0,2%. Для этого в суспензию, подогретую до 26-28°С, вносят при постоянном перемешивании раствор АЭЭИ и устанавливают рН суспензии в пределах 7,6÷7,8 5М раствором уксусной кислоты. Инактивацию вируса проводят при температуре (37,0±0,5)°С в течение 24 часов с периодическим перемешиванием суспензии (по 3÷5 мин через каждые 5÷6 часов).

По окончании инактивации антигенный материал охлаждают до температуры 2÷8°С и отбирают пробы для определения рН, стерильности и полноты инактивации.

Для нейтрализации АЭЭИ в суспензию антигенного материала добавляют 1М раствор тиосульфата натрия из расчета 10% к объему использованного АЭЭИ.

Полученный антигенный материал используют для изготовления сорбированной формы вакцины против ВД КРС.

В качестве адъюванта-сорбента в предлагаемой вакцине используют стерильный 3÷4% гель ГОА.

Концентрацию и объем ГОА в конечном препарате и прививной дозе определяют по известной формуле в зависимости от титра вируса в исходной суспензии. Оптимальное количество ГОА в вакцине может составлять (мас.%): 19,6÷49,6. Смесь суспензии с ГОА перемешивают в течение 1 часа и оставляют для седиментации. Затем в полуфабрикат вакцины дополнительно добавляют 10% водный раствор адъюванта сапонина из расчета 2,0 мг на дозу вакцины, доводя концентрацию сапонина в объеме препарата до 0,4 мас.%. Смесь перед расфасовкой выдерживают при температуре 2÷6°С в течение 120 часов при периодическом перемешивании.

Оптимальный компонентный состав (мас.%) полученной вакцины против ВД КРС приведен в таблице 4.

Содержание антигена в вакцине в указанных выше пределах является его эффективным количеством в препарате, обеспечивающим достижение технического результата.

Полученная вакцина представляет собой жидкость розового цвета с рыхлым осадком сорбента, который при встряхивании легко разбивается в гомогенную взвесь.

Вакцину контролируют на авирулентность и стерильность, а затем фасуют в стерильные флаконы.

Стерильность вакцины определяют в соответствии с ГОСТ 28085. Авирулентность препарата определяют методом трехкратных последовательных пассажей инактивированного антигена в перевиваемых культурах клеток по отсутствию ЦПД.

Определение безвредности вакцины проводят на белых мышах или на естественно восприимчивых животных - телятах 2÷3-месячного возраста. Для этого препарат вводят подкожно в область спины в дозе 0,1 см³ десяти белым мышам или внутримышечно в области средней трети шеи по 2 см³ двум телятам (две прививные дозы).

Вакцина считается безвредной, если лабораторные животные в течение 10 суток наблюдения остаются клинически здоровыми без каких-либо патологических изменений. На месте введения допускается местная тканевая реакция.

Антигенность каждой серии вакцины проверяют на кроликах. Для этого берут 7 кроликов массой 2,0÷2,5 кг. Вакцину вводят пяти кроликам подкожно в области спины по 2 см³. Перед вакцинацией и через 14 сут после двукратного введения вакцины с интервалом 20÷25 сут у кроликов берут кровь, выдерживают при температуре 37°С, отделяют сыворотку и исследуют в ИФА на наличие антител к вирусу ВД КРС.

Для постановки реакции в лунки планшетов вносят по 0,1 см³ раствора специфического вирусного антигена в 0,05 М карбонатно-бикарбонатном буфере (рН 9,5÷9,6) в рабочем разведении и инкубируют в течение 18-20 ч при 4,0°С. Методом встряхивания удаляют не связавшееся содержимое лунок планшета и 3 раза отмывают промывочным буфером.

В сенсибилизированные планшеты вносят блокирующий буфер в объеме 0,05 см³ на лунку. Инкубируют в течение 1 час при температуре 37,0°С в статическом состоянии. Отмывают 3 раза промывочным буфером.

В горизонтальный ряд вносят по 0,1 см³ исследуемых и контрольных сывороток в разведении 1:50 и готовят серию двукратных разведении исследуемых и контрольных сывороток от 1:50 до 1:6400. Инкубируют при (37,0±0,5)°С в течение 1 час и отмывают 3 раза промывочным буфером.

В отмытые лунки вносят по 0,05 см³ антивидового конъюгата против lgG кролика в рабочем разведении, инкубируют 1 ч при 37,0°С и отмывают лунки тем же раствором.

Затем в каждую лунку вносят по 0,05 см³ готового раствора субстрат - хроматогена (ABTS). Инкубируют 15÷20 мин при комнатной температуре, реакцию останавливают 1% раствором ДСН (0,05 см³).

Реакцию учитывают с помощью спектрофотометра, регистрируя оптическую плотность (ОП) при длине волны 405 нм.

Определяют среднее значение ОП для лунок с контрольной отрицательной сывороткой. Титром сыворотки считают ее максимальное разведение, величина оптической плотности в котором в 2 раза превосходит оптическую плотность в лунках с контрольной отрицательной сывороткой.

Серию вакцины считают прошедшей контроль на антигенную активность, если титр специфических антител к вирусу ВД КРС в ИФА не ниже 1:50.

Из полученного антигенного материала приготовили 4 серии вакцины против ВД КРС сорбированной инактивированной, отличающихся содержанием активного вещества и адъюванта сорбента ГОА в препарате.

Серия №1 предлагаемой вакцины содержит, мас.%:

Авирулентный и очищенный антигенный   материал из штамма «NADL-ВНИИЗЖ»   вируса ВД КРС, полученного в перевиваемой   культуре клеток Таурус-2 с инфекционной активностью   6,5 lg ТЦД₅₀/см³ и активностью в ИФА 6,6 log₂   до инактивации (далее «Антигенный материал) 50,0 ГОА 49,6 Сапонин 0,4

Серия №2 предлагаемой вакцины содержит, мас.%:

Антигенный материал 70,0 ГОА 29,6 Сапонин 0,4

Серия №3 предлагаемой вакцины содержит, мас.%:

Антигенный материал 80,0 ГОА 19,6 Сапонин 0,4

Серия №4 предлагаемой вакцины содержит, мас.%:

Антигенный материал 60,0 ГОА 39,6 Сапонин 0,4

Пример 3

Проведены испытания антигенной активности серии №1 предлагаемой вакцины против ВД КРС, изготовленной так, как описано в примере 2, и содержащей, мас.%:

Антигенный материал 50,0 ГОА 49,6 Сапонин 0,4

Антигенную активность полученного препарата определяли на морских свинках массой 0,45÷0,50 кг.

Результаты исследований представлены в таблице 5. Согласно данным таблицы 5 видно, что вакцина против ВД КРС сорбированная инактивированная из штамма «NADL-ВНИИЗЖ» обладает высокой антигенной активностью.

Пример 4

Проведены испытания антигенной активности серии №2 предлагаемой вакцины против ВД КРС, изготовленной так, как описано в примере 2, и содержащей, мас.%:

Антигенный материал 70,0 ГОА 29,6 Сапонин 0,4

Антигенную активность полученного препарата определяли на кроликах массой 2,0÷2,5 кг.

Результаты исследований представлены в таблице 6. Согласно данным таблицы 6 видно, что вакцина против ВД КРС инактивированная сорбированная из штамма «NADL-ВНИИЗЖ» обладает высокой антигенной активностью.

Пример 5

Проведены испытания антигенной активности серии №3 предлагаемой вакцины против ВД КРС, изготовленной так, как описано в примере 2, и содержащей, мас.%:

Антигенный материал 80,0 ГОА 19,6 Сапонин 0,4

С целью изучения антигенной активности вакцины против ВД КРС сорбированной инактивированной из штамма «NADL-ВНИИЗЖ» в производственных условиях ее применили в неблагополучном по ВД КРС хозяйстве ОАО ПСХ «Лучинское» Собинского района Владимирской области для профилактики этого заболевания. До вакцинации в хозяйстве отмечали массовые заболевания телят 1÷3-месячного возраста со следующей клинической картиной: угнетение, ухудшение аппетита, серозные истечения из носа, кашель и диарея. Количество молодняка КРС в хозяйстве составляет 180 голов, гибель среди заболевшего молодняка достигала 15%.

Животных вакцинировали в дозе 2 см³. Сыворотку крови животных исследовали на наличие антител в ИФА. Отбор сывороток крови проводили по следующей схеме: до вакцинации, перед ревакцинацией (на 21 день) и после ревакцинации (на 35 день).

Результаты исследований представлены в таблице 7. Согласно данным таблицы 7 видно, что вакцина против ВД КРС сорбированная инактивированная из штамма «NADL-ВНИИЗЖ» обладает высокой антигенной активностью. Применение вакцины позволило снизить падёж молодняка в хозяйстве с 15% до 3%.

Пример 6

Проведены испытания антигенной активности серии №4 предлагаемой вакцины против ВД КРС, изготовленной так, как описано в примере 2, и содержащей, мас.%:

Антигенный материал 60,0 ГОА 39,6 Сапонин 0,4

Испытания препарата проведены в хозяйстве ЗАО «Суворовское» Суздальского района Владимирской области. Предлагаемую вакцину вводили глубокостельным коровам внутримышечно в область средней трети шеи: первая вакцинация - за 40÷45 дней до отела, вторая - через 20÷25 суток после первичной иммунизации.

Результаты исследований представлены в таблице 8. Согласно данным таблицы 8 видно, что вакцина против ВД КРС сорбированная инактивированная из штамма «NADL-ВНИИЗЖ» обладает высокой антигенной активностью.

Пример 7

Проведены испытания антигенной активности серии №2 предлагаемой вакцины против ВД КРС, изготовленной так, как описано в примере 2, и содержащей, мас.%:

Антигенный материал 70,0 ГОА 29,6 Сапонин 0,4

Антигенная активность вакцины против ВД КРС сорбированной инактивированной из штамма «NADL-ВНИИЗЖ» была изучена в серии сравнительных опытов на телятах и глубокостельных коровах в различных хозяйствах ряда регионов РФ.

Результаты исследований представлены в таблице 9. Результаты наблюдений за привитыми животными свидетельствуют о том, что предлагаемая вакцина не вызывает осложнений и индуцирует довольно хорошую устойчивость к заболеванию.

Источники информации

1. Сюрин В.Н., Самуйленко А.Я, Соловьев Б.В. и Фомина Н.В. Вирусные болезни животных. - М., ВНИТИБП, 1998. - С.135-158.

2. Кириленко А.Н., Крупальник В.Л. Инфекционные болезни молодняка сельскохозяйственных животных. - М.: Колос, 2000. - С.91÷97.

3. Lindenbach Brett D., Thiel Heinz-Jürgen and Rice Charles М. Pestiviruses // Virology. Vol.1. [Viruses] ed. B.N. Fields [et al]. 5 ^th ed. - Philadelphia, 2007. - P.1126÷1131.

4. Борознов С.Л. Желудочно-кишечные болезни телят: монография / С.Л.Борознов. - Витебск; ВГАВМ, 2009. - С.65÷68.

5. Патент РФ №1789219; А61K 39/118, 39/12; 23.01.1993 г.

6. Патент РФ №1835659; А61K 39/15, G01N 33/556; 27.05.1996 г.

7. Бахтуханов Ю.Х., Гизитдинов Н.Н., Изучение напряженности и продолжительности иммунитета у телят, привитых вакциной против вирусной диареи крупного рогатого скота // Профилактика и меры борьбы с инфекционными болезнями сельскохозяйственных животных в Казахстане. - Труды Казах. НИВИ. - Т. XVIII. - Алма-Ата. - 1979. - С.81÷83.

8. Патент РФ №2362585; А61K 39/295, C12N 7/00, А61Р 31/12; 27.07.2009 г.

9. Патент РФ №2372938; А61K 39/295, А61Р 31/12; 20.11.2009 г. (прототип).

Таблица 1 Результаты адаптации вируса ВД КРС штамма «NADL-ВНИИЗЖ» к культуре клеток Таурус-2 № пассажа Время культивирования (ч) Титр в культуре клеток (lg ТЦД₅₀/см³) Титр вируса в ИФА (log₂) 1-й 96-120 3,8 4,3 2-й 96-120 4,5 5,3 3-й 96-120 6,5 6,9 5-й 72-96 6,8 7,1 7-й 72-96 6,6 7,0

Таблица 2 Результаты адаптации вируса ВД КРС штамма «NADL-ВНИИЗЖ» к культуре клеток RBT № пассажа Время культивирования (ч) Титр в культуре клеток (lg ТЦД₅₀/см³) Титр вируса в ИФА (log₂) 1-й 96-120 6,5 7,0 2-й 96-120 6,0 6,9 3-й 72-96 6,8 7,1 5-й 72-96 6,8 7,2 7-й 72-96 6,4 6,6

Таблица 3 Результаты адаптации вируса ВД КРС штамма «NADL-ВНИИЗЖ» к культуре клеток ПС № пассажа Время культивирования (ч) Титр в культуре клеток (lg ТЦД₅₀/см³) Титр вируса в ИФА (log₂) 1-й 96-120 4,1 4,9 2-й 96-120 4,5 5,0 3-й 96-120 5,5 5,9 5-й 72-96 6,8 7,0 7-й 72-96 6,6 7,0

Таблица 4 Оптимальный компонентный состав (мас.%) сорбированной
инактивированной вакцины против ВД КРС, приготовленной из штамма «NADL-ВНИИЗЖ» Инградиенты Минимум Средний Максимум Антигенный материал 50 70 80 ГОА 49,6 29,6 19,6 Сапонин 0,4 0,4 0,4

Таблица 5 Антигенная активность вакцины против ВД КРС сорбированной инактивированной из штамма «NADL-ВНИИЗЖ» на морских свинках Количество животных Наименование материала Титр антител в ИФА (log₂) n=10 Сыворотка вакцинированных морских свинок 10,6±0,33 n=10 -“- 9,2±0,4

Таблица 6 Антигенная активность вакцины против ВД КРС сорбированной инактивированной из штамма «NADL-ВНИИЗЖ» на кроликах № п/п Наименование материала Титр антител в ИФА (log₂) 1 Сыворотка вакцинированных кроликов 9,4±0,23 2 -“- 10,6±0,16 3 -“- 9,8±0,26 4 -“- 8,6±0,33 среднее -“- 9,6±0,24

Таблица 7 Результаты испытания на 14÷30-дневных телятах вакцины против ВД КРС сорбированной инактивированной из штамма «NADL-ВНИИЗЖ» Иммунный статус Средний титр в ИФА (log₂) к вирусу ВД КРС До вакцинации 8,6±0,92 Перед ревакцинацией 9,1±0,57 После ревакцинации 10,2±0,35

Таблица 8 Результаты испытания вакцины против ВД КРС сорбированной инактивированной из штамма «NADL-ВНИИЗЖ» на глубокостельных коровах Иммунный статус Средний титр в ИФА (log₂) к вирусу ВД КРС До вакцинации 0 Перед ревакцинацией 9,2±0,58 После ревакцинации 10,2±0,41

Таблица 9 Уровень антител к вирусу ВД КРС у телят и глубокостельных коров, привитых инактивированной сорбированной вакциной против ВД КРС из штамма «NADL-ВНИИЗЖ» № п/п Сыворотка крови животных Кол-во животных Титр антител в ИФА (log₂) 1 телят до вакцинации 57 7,1±0,81 2 телят после ревакцинации на 35 день 57 9,9±0,41 3 коров до вакцинации 53 8,6±0,67 4 коров за 10-15 дней до отела 53 10,7±0,41

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии и касается вакцины против вирусной диареи крупного рогатого скота (ВД КРС). Охарактеризованная вакцина содержит авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма «NADL-ВНИИЗЖ» вируса ВД КРС, депонированный в коллекцию ФГУ «ВГНКИ» под регистрационным номером «NADL-ВНИИЗЖ» - ДЕП, полученный в перевиваемой культуре клеток млекопитающих (перевиваемые культуры клеток Таурус-2, ПС и RBT) с инфекционной активностью не менее 6,0 lg ТЦД₅₀/см³ и активностью в ИФА не менее 6,6 log₂ до инактивации, в эффективном количестве и целевые добавки гидроокись алюминия (ГОА) и сапонин. Представленная вакцина обладает высокой антигенной и иммуногенной активностью и защищает иммунизированное поголовье КРС от заражения гомологичным возбудителем ВД КРС. 12 з.п. ф-лы, 9 табл., 7 пр.

1. Вакцина против вирусной диареи крупного рогатого скота (ВД КРС), содержащая активное вещество и целевые добавки, отличающаяся тем, что в качестве активного вещества она содержит авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма «NADL-ВНИИЗЖ» вируса ВД КРС, сем. Flaviviridae, рода Pestivirus, депонированного в коллекцию ФГУ «ВГНКИ» под регистрационным номером «NADL-ВНИИЗЖ» - ДЕП, в эффективном количестве.

2. Вакцина по п.1, отличающаяся тем, что она содержит авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма «NADL-ВНИИЗЖ» вируса ВД КРС, полученного в перевиваемой культуре клеток млекопитающих, в эффективном количестве.

3. Вакцина по п.2, отличающаяся тем, что она содержит авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма «NADL-ВНИИЗЖ» вируса ВД КРС, полученного в перевиваемой культуре клеток почки теленка Таурус-2, в эффективном количестве.

4. Вакцина по п.3, отличающаяся тем, что она содержит авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма «NADL-ВНИИЗЖ» вируса ВД КРС, полученного в перевиваемой культуре клеток Таурус-2 с инфекционной активностью не менее 6,0 lg ТЦД₅₀/см³ и активностью в реакции иммуноферментного анализа (ИФА) не менее 6,6 log₂ до инактивации, в количестве, мас.%: 50,0÷80,0.

5. Вакцина по п.2, отличающаяся тем, что она содержит авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма «NADL-ВНИИЗЖ» вируса ВД КРС, полученного в перевиваемой культуре клеток почки сайги ПС, в эффективном количестве.

6. Вакцина по п.5, отличающаяся тем, что она содержит авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма «NADL-ВНИИЗЖ» вируса ВД КРС, полученного в перевиваемой культуре клеток ПС с инфекционной активностью не менее 6,0 lg ТЦД₅₀/см³ и активностью в ИФА не менее 6,6 log₂ до инактивации, в количестве, мас.%: 50,0÷80,0.

7. Вакцина по п.2, отличающаяся тем, что она содержит авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма «NADL-ВНИИЗЖ» вируса ВД КРС, полученного в перевиваемой культуре клеток почки теленка RBT, в эффективном количестве.

8. Вакцина по п.7, отличающаяся тем, что она содержит авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма «NADL-ВНИИЗЖ» вируса ВД КРС, полученного в перевиваемой культуре клеток RBT с инфекционной активностью не менее 6,0 lg ТЦД₅₀/см³ и активностью в ИФА не менее 6,6 log₂ до инактивации, в количестве, мас.%: 50,0÷80,0.

9. Вакцина по п.1, отличающаяся тем, что из целевых добавок она содержит адъювант-сорбент гидроокись алюминия (ГОА).

10. Вакцина по п.9, отличающаяся тем, что она содержит ГОА в количестве, мас.%: 19,6÷49,6.

11. Вакцина по п.1, отличающаяся тем, что из целевых добавок она содержит дополнительно адъювант сапонин.

12. Вакцина по п.11, отличающаяся тем, что она содержит сапонин в количестве 0,4 мас.%.

13. Вакцина по любому из пп.1-12, отличающаяся тем, что в качестве активного вещества она содержит авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма «NADL-ВНИИЗЖ» вируса ВД КРС, полученного в перевиваемой культуре клеток млекопитающих, взятой из группы, содержащей культуру клеток Таурус-2, культуру клеток ПС и культуру клеток RBT, с инфекционной активностью не менее 6,0 lg ТЦД₅₀/см³ и активностью в ИФА не менее 6,6 log₂, и целевые добавки ГОА и сапонин в соотношении, мас.%:
Антигенный материал 50,0÷80,0 ГОА 19,6÷49,6 Сапонин 0,4