Изобретение относится к пищевой, косметической, биотехнологической и медицинской промышленности, в частности используется для приготовления кисломолочных, ферментированных и неферментированных пищевых продуктов, гигиенических и косметических средств, биологически активных добавок и бактерийных препаратов.
В связи с неблагоприятными экологическими условиями, стрессами, длительной антибактериальной, лучевой и химиотерапией, дисбиозами, возникающими вследствие перенесенных заболеваний, увеличивается количество людей, страдающих нарушениями нормальной микрофлоры организма. Для лечения и профилактики этих нарушений все большее внимание уделяется как препаратам, обладающим пробиотическим действием, так и пищевым продуктам, содержащим бифидобактерии.
В кишечнике человека в основном встречаются 5 видов бифидобактерий - B.bifidum, B.longum, B.adolescentis, B.breve и B.infantis. Из них с наибольшей частотой в биоценозе обнаруживаются виды B.bifidum и B.longum. Вид B.adolescentis чаще встречается у взрослых людей, а виды B.breve и B.infantis - преимущественно у детей грудного возраста.
Известны зарубежные моно- и комплексные препараты-эубиотики и кисломолочные продукты, включающие в свой состав бифидобактерии видов B.bifidum, B.lonqum, B.adolescentis, B.breve (патент 2336886, патент 2411008, Франция; патент 637297, Швейцария; патент 2134179, патент 2421066, ФРГ; патент 05227946, патент 0430642, Япония; патент 4645667, США, патент 6063935, Япония, патент 5922375, США, патент 5902743, США, патент 6746672, США, патент 6548057, США). У нас в стране для приготовления бактерийных препаратов, биологически активных добавок, продуктов лечебно-диетического питания применяют отечественные штаммы бифидобактерий видов B.bifidum 1,791,792; B.lonqum В379М, Я-2, Я-4; B.adolescentis MC-42, Г 7513; В.breve 79-119; B.infantis 79-43 (авторское свидетельство №343588, патент РФ 1347221, патент РФ 849779, патент РФ 2108383, патент РФ 2152993, патент 863639, патент РФ 2120991, патент РФ 2078814, патент РФ 2111248).
Качество лечебных продуктов и препаратов во многом обусловлено свойствами штамма-продуцента - его специфической активностью и технологичностью. Большой ассортимент биологически активных и технологичных штаммов бифидобактерий делает возможной разработку новых моно- и комплексных продуктов лечебного питания и бакпрепаратов, способных обеспечивать высокую колонизационную резистентность кишечника человека, восстановить его нормальную микрофлору и снизить заболеваемость различными кишечными инфекциями.
Задачей настоящего изобретения является получение штамма микроорганизмов вида В.adolescentis 79-84 с высокой биологической активностью, устойчивостью к условиям внешней среды, обладающего стабилизирующим кислотообразованием во всем температурном диапазоне развития клеток, сквашивающего молоко и размножающегося на искусственных питательных средах различного состава.
Штамм Bifidobacterium adolescentis 79-84 выделен из содержимого кишечника здорового ребенка грудного возраста и депонирован в Государственной коллекции нормальной микрофлоры (ГКНМ) ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н.Габричевского Роспотребнадзора под №250.
Заявляемый штамм может быть использован при производстве кисломолочной продукции, ферментированных пищевых продуктов, например: квас, пиво и т.п., неферментированных пищевых продуктов, например: соки, напитки и т.п., заквасок для приготовления кисломолочной продукции и биологически активных добавок к пище. Штамм Bifidobacterium adolescentis 79-84 может использоваться также для производства гигиенических и косметических средств, например: кремов, лосьонов, салфеток, мыла, присыпок, тампонов, питательных масок, гелей, женских прокладок, косметического молочка, различных пудр и т.д.
Кроме того, штамм Bifidobacterium adolescentis 79-84 может быть использован при производстве бактериальных препаратов, в виде свечей, пероральных и других средств.
Техническим результатом заявленного изобретения является получение штамма Bifidobacterium adolescentis 79-84, который может быть использован в качестве биологически активного вещества в составе кисломолочных, ферментированных и неферментированных пищевых продуктов, заквасок, гигиенических и косметических средств, биологически активных добавок и бактерийных препаратов. Штамм Bifidobacterium adolescentis 79-84 обладает биологически и технологически значимыми свойствами, такими как кислотообразующая активность, способность наращивать микробную биомассу в различных питательных средах. Штамм Bifidobacterium adolescentis 79-84 антагонистически активен по отношению к патогенным и условно-патогенным микроорганизмам. Это позволит использовать его в качестве биологически активного компонента в составе различных пробиотических средств, обеспечивающих нормализацию микробиоценозов организма человека, в т.ч. желудочно-кишечного и мочеполового трактов, кожных и слизистых покровов, и расширит арсенал аналогичных средств.
Культурально-морфологические свойства штамма
Клетки представляют собой гр+ полиморфные палочки с бифуркацией или утолщением на 1-2х концах, в жидких питательных средах растут по всей высоте объема, кроме зоны аэробиоза. Отдельно выросшие колонии на печеночной питательной среде имеют удлиненную форму колоний. Логарифмическая фаза роста заканчивается к 12-24 часам культивирования.
Физико-биохимические свойства штамма
Бесспоровый, неподвижный анаэроб. Оптимальная температура выращивания 37-39 градусов по Цельсию. Каталазу не образует, желатину не разжижает. Сбраживает глюкозу с образованием уксусной и L+ молочной кислот, без образования газа, закисляя среду выращивания до рН 4,4-3,9. Ферментирует лактозу, арабинозу, ксилозу, целлобиозу, инулин, мелибиозу, мелецитозу, раффинозу, салицин, не ферментирует маннит, маннозу, сорбит, инозит. Штамм сквашивает молоко к 16-18 ч культивирования.
Штамм Bifidobacterium adolescentis 79-84 обладает антагонистической активностью по отношению к патогенной и условно-патогенной микрофлоре (Таблица 1).
Штамм активно наращивает микробную массу при росте на гидролизатно-молочной питательной среде (ГМ), Бифидум-среде (БФ), продуцируя кислоты (Таблица 2).
БИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ
Штамм максимально накапливает микробную массу к 12-24 ч часам культивирования, достигая в 1 мл lg 8-9 микробных клеток, продуцируя кислоты.
Таким образом, предлагаемый штамм В.adolescentis 79-84 технологичен, поскольку размножается в различных питательных средах с накоплением производственной биомассы с высокой концентрацией бифидобактерий; обладает кислотообразующей активностью, а также антагонистической активностью в отношении к патогенным и условно-патогенным микроорганизмам.
Кисломолочные, ферментированные, неферментированные пищевые продукты, гигиенические, косметические средства, биологически активные добавки и бактерийные препараты, содержащие штамм В. adolescentis 79-84, могут найти применение в пищевой, медицинской, биотехнологической и косметической промышленности.
Способность штамма В.adolescentis 79-84 наращивать биомассу в различных питательных средах, кислотообразующая активность, антагонистическая активность по отношению к патогенной и условно-патогенной микрофлоре, а также другие полезные для организма человека свойства, характерные для вида В.adolescentis, делают возможным использование штамма в составе различных корригирующих средств лечебно-профилактического назначения.
Пример 1. Использование штамма В.adolescentis 79-84 в составе биологически активных добавок
1 пассаж: лиофилизированный штамм В.adolescentis 79-84 в количестве 0,1 г сухой биомассы вносят в пробирки с питательной средой и титруют методом десятикратных разведений до 10-9. Инкубируют при температуре 37-38 градусов по Цельсию до образования видимого роста в последних разведениях.
2 пассаж: выросшую культуру из 10-7-9 разведений в объеме до 10% вносят в питательную среду и культивируют при температуре 37-38 градусов по Цельсию в течение 12-24 ч до образования густого роста с видимой зоной аэробиоза.
3 пассаж: полученную биомассу в количестве до 10% объема вносят в среду накопления и культивируют 12-24 ч при 37-38 градусах по Цельсию до получения биомассы с содержанием живых бифидобактерий не менее 108/мл.
В результате получают биологически активную добавку, которая представляет собой жидкий концентрат с высоким, не менее 108/мл, содержанием бифидобактерий. При выслушивании концентрата с защитными средами (сахарозо-желатиновая среда, обезжиренное молоко или другие) получают сухую биологически активную добавку с содержанием бифидобактерий не менее 107/мл.
Пример 2. Использование штамма В.adolescentis 79-84 для приготовления ферментированных и неферментированных пищевых продуктов
1 пассаж: лиофилизированный штамм В.adolescentis 79-84 в количестве 0,1 г сухой биомассы вносят в пробирки с питательной средой и титруют методом десятикратных разведений до 10-9. Инкубируют при 37-38 градусах по Цельсию до образования видимого роста в последних разведениях.
2 пассаж: выросшую культуру из 10-7-9 разведений в объеме до 10% вносят в питательную среду и культивируют при температуре 37-38 градусов по Цельсию в течение 12-24 ч до образования густого роста с хорошо видимой зоной аэробиоза.
3 пассаж: полученную биомассу в количестве до 10% объема вносят в среду накопления и культивируют 12-24 ч при 37-38 градусах по Цельсию до получения биомассы с содержанием живых бифидобактерий не менее 108/мл.
Получение ферментированного или неферментированного пищевого продукта: выросшую биомассу вносят в пищевое сырье (молоко, соки, пиво, квас и пр.) в количестве до 10% от объема, перемешивают и разливают в емкости. В результате получают продукт с концентрацией живых бифидобактерий не менее 106/мл.
Пример 3. Использование штамма В.adolescentis 79-84 для приготовления кисломолочного продукта
1 пассаж: лиофилизированный штамм вносят в среду культивирования и титруют методом десятикратных разведений до 10-9. Инкубируют при 37-38 градусах по Цельсию до образования видимого роста в последних разведениях. Или сухую лиофилизированную биомассу бифидобактерий вносят в количестве 1-2 дозы в пробирку с 30 мл питательной среды. Культивируют при температуре 37-38 градусов по Цельсию до получения биомассы с содержанием живых бифидобактерий не менее 107/мл.
2 пассаж: выросшую культуру штамма В. adolescentis 79-84 из последних разведений или из пробирки с выросшей биомассой вносят в среду накопления объемом до 10% и культивируют при температуре 37-38 градусов по Цельсию до получения биомассы с содержанием бифидобактерий не менее 108/мл.
3 пассаж: полученную биомассу штамма В.adolescentis 79-84 в объеме до 10% вносят в стерильное молоко, культивируют до образования сгустка (кисломолочный продукт). Количество пассажей №2 может быть увеличено в зависимости от объема производства.
Пример 4. Использование штамма В.adolescentis 79-84 для получения бактерийных препаратов
Культуру штамма 1-го или 2-го пассажа (пример 1) вносят в питательную среду, культивируют при температуре 37-38 градусов по Цельсию до получения биомассы бифидобактерий с содержанием живых клеток не менее 108 в 1 мл. К полученной биомассе добавляют защитные среды высушивания (сахарозо-желатиновая среда, обезжиренное молоко). Полученную суспензию разливают в ампулы, флаконы и другие емкости, замораживают при температуре минус 35-45 градусов по Цельсию лиофилизируют из замороженного состояния в вакуум-сушильных аппаратах. Полученный препарат содержит не менее 107 живых клеток и бифидобактерий. Данное содержание бифидобактерий согласуется с научно-технической документацией на аналогичный бифидосодержащий препарат - "Бифидумбактерин сухой" и является достаточным для использования полученного средства в качестве препарата-эубиотика.
Пример 5. Использование штамма Bifidobacterium adolescentis 79-84 для получения гигиенических и косметических средств
Культуру штамма 1-го или 2-го пассажа (пример 1) вносят в питательную среду, культивируют при температуре 37-38 градусов по Цельсию до получения биомассы бифидобактерий с содержанием живых клеток не менее 108 в 1 мл, высушивают методом распыления или лиофилизации.
Полученную сухую биомассу бифидобактерий штамма Bifidobacterium adolescentis 79-84 вводят в состав питательного крема в количестве не более 1% к объему.
Безвредность: при введении трем беспородным белым мышам дозы per os микробной культуры штамма в количестве 5×107 КОЕ на животное гибели, отклонений в состоянии здоровья мышей в период наблюдения не отмечено.
Штамм Bifidobacterium adolescentis 79-84 выделен из содержимого кишечника здорового взрослого человека, размножается в различных питательных средах с накоплением производственной биомассы с высокой концентрацией бифидобактерий. Штамм Bifidobacterium adolescentis 79-84 обладает кислотообразующей активностью, антагонистической активностью в отношении к патогенным и условно-патогенным микроорганизмам, заквашивает молоко. Штамм депонирован в Государственной коллекции микроорганизмов нормальной микрофлоры (ГКНМ) ФГУН «МНИИЭМ им. Г.Н.Габричевского Роспотребнадзора», регистрационный номер №250. Это позволяет использовать штамм Bifidobacterium adolescentis 79-84 для получения кисломолочных, ферментированных и неферментированных пищевых продуктов, заквасок, гигиенических и косметических средств, биологически активных добавок и бактерийных препаратов, что обеспечивает нормализацию микробиоценозов организма человека, в т.ч. желудочно-кишечного и мочеполового трактов, кожных и слизистых покровов, а также расширить арсенал аналогичных средств. 2 табл., 5 пр.
Штамм Bifidobacterium adolescentis 79-84, используемый для получения бифидосодержащей продукции, депонирован в Государственной коллекции микроорганизмов нормальной микрофлоры (ГКНМ) ФГУН «МНИИЭМ им. Г.Н.Габричевского Роспотребнадзора», регистрационный № 250.
