Способ определения @ -Токоферола Советский патент 1987 года по МПК G01N30/00 

1

Изобретение относится к химическим методам, определения витаминов группы Е (токоферолов) с применением хроматографических методов очистки, в частности тонкослойной хроматографии (тех),

Способ заключается в том, что проявление пластинок проводят путем их обработки раствором желеэоаммоний- ных квасцов, высушивания и обработки раствором батофенантролина, а в качестве элюента используют смесь, состоящую из фосфорной кислоты, серной кислоты и метанола при следующем соотношении компонентов, об.%: Фосфорная кислота 5-7 Серная кислота 0,1-0,3 МетанолОстальное

13

Наиболее существенными отличитель- 20 теплого воздуха и опрыскивают 0,5%ными признаками предлагаемого способа являются следующие,

1,Проявление пластинок проводят путем их обработки раствором железо- аммонийных квасцов, высушивания и обработки раствором батофенантролина ,

2,В качестве элюента используют смесь, состоящую из фосфорной кислоты, серной кислоты и метанола при следующем соотношении компонентов, об.%:

Фосфорная кислота 5-7 Серная кислота 0,1-0,3 МетанолОстальное

Предлагаемый способ позволяет вдвое повысить чувствительность определений и дает возможность определят синтетические антиокислители феноль- ного ряда, сантохин и дилудин,

Определение витамина Е проводят следующим образом,

П р-и м е р 1, Определение витамина Е в желтке куриных яиц.

Навеску желтка куриного яйца (0,1-0,2 г) переносят , в колбочку для омыления, добавляют 50 мл этанола, 100 мг пирогаллола и 2 г гранулированного едкого натра, присоединяют обратный холодильник и омыляют на глицериновой бане 20 мин при 90-95 С. Затем охлаждают и трижды экстрагируют неомьшяемую фракцию гексаном порциями по 50 мл. Затем гексановый экстракт отмывают до нейтральной реакции по универсальной индикаторной бумажке, высущивают безводным сульфатом натрия и выпаривают в токе азота на роторном испарителе. Далее

g

103322232

сухой остаток растворяют в 0,2 мл хлороформа и количественно переносят на стартовую линию хроматографичес- кой пластинки в виде полосы длиною 80 мм. Рядом наносят свидетель - примерно 0,5-1 мкг о/-токоферола, Хроматографическое разделение токоферолов на подготовленных пластинках осуществляют в камере, насыщенной парами хлороформа, через которую, в течение 15 мин продувают азот. Когда фронт растворителя приблизится к верхнему краю пластинки, необ- 15 ходимо извлечь ее из камеры и высушить в токе азота при 35-40°С, Затем обильно опрыскивают пластинку 0,5%-ным раствором железоаммонийных квасцов в этаноле, высушивают в токе

ным раствором батофенантролина в этаноле.

Обработанную пластинку выдерживают в,горизонтальном положении 35 5 мин. При этом образуется розово- красное пятно витамина Е на белом бесцветном.фоне пластинки. Затем подсушивают пластинку при 20-25 С, определяют локализацию с -токоферола

0 по свидетелю и количественно переносят окрашенный участок адсорбента в пробирку с притертой пробкой.

Затем в пробирку приливают 3 мл элюирующей смеси, состоящей из метаg нола, фосфорной и- серной кислот в объемном соотношении 93,8:6:0,2, энергично встряхивают 1 5-20 с и фильтруют через обеззоленный фильтр (красная лента),.Сполоснув пробирку 1 мл

0 этой же смеси, переносят ее на тот же фильтр, Полученньй розовый фильтрат фотометрируют при 492 нм по сравнению с элюирующей смесью, Содержание витамина Е рассчитывают по ка5 либровочному графику, построенному по d -токоферолу,

П р и м е р 2, Определение изомеров витамина Е в травяной муке из люцерны.

Навеску травяной муки 0,05-0,1 г омыляют спиртовой щелочью и дальнейшие операции проводят так же, как описано в примере 1, По окончании хроматографии проявляют пластинки так же, как и при анализе желтка куриных яиц, Положение oi-токоферола определяют по свидетелю, а токоферолов - щ) величине R., Все дальнейшие процедуры такие же, как

0

5

и при определении витамина Е в примере 1, При отсутствии специальных сви- деталей допустимо определение концентрации изомеров витамина Е по калибровочному графику, построенному по csi-токоферолу,

Примерз. Определение санто- хина в кормах.

Навеску корма (1 г) заливают 30 мл хлороформа и взбалтывают на шюттель-аппарате в течение 1.5 мин. Затем фильтруют через слой безводного сульфата натрия. Корм дважды промывают по О МП хлороформа и переносят на ту же воронку с сульфатом натрия. Затем полученный экстракт упаривают на роторном испарителе досуха и растворяют в 1 мл хлороформа. На стартовую линию хроматографичес- кой пластинки наносят 0,05 мл полу-- ченного раствора в виде полосы длиной 60-80 мм, рядом наносят в виде точки свидетель - 0,01 мл раствора сантохина в хлороформе (100 мкг/мл).

тех проводят в камере, насыщенной парами хлороформа. После того, как фронт растворителя поднимется по пластинке доверху, ее извлекают из камеры, подсушивают и далее обрабатывают , как описано в примере 1, Санто- хин проявляется в виде розово-красно- го пятна на белом фоне. Далее окрашенный участок силикагеля соскабливают и обрабатывают, как описано в примере 1, Содержание сантохина в корме определяют по калибровочному графику,

П р и м е р 4. Определение сантохина в премиксе.

Осуществляют так же, как в примере 3, но после экстракции полученный раствор не упаривают, а в мерной колбе доводят хлороформом до 100 мл. Из них 0,05 МП наносят на стартовую линию хроматографической пластинки и обрабатывают, как описано в примере 3,

П р и м е р 5, Определение дилу- дина в корме.

Осуществляют так же, как в примере 3, но на хроматографическую пластинку наносят 0,1 мл полученного раствора, Хроматограмму проявляют, как и в примере 1, но розово-красное пятно дилудина появляется на пластинке не сразу, а через 3-5 мин после опрыскивания хроматограммы раствором

батофенантролина. Все последующие

5

0

операции проводят аналогично приме- . РУ 3,

П р и м е р.6. Определяют витамин Е в желтке яиц, как описано в примере 1 , но используют элюирующую смесь с различным соотношением фосфорной кислоты, серной кислоты и метанола. Определение оптимального состава элюирующей смеси при определении витамина Е и синтетических антиокислителей показано в табл.1,

I , .

Полученные данные позволяют заключить, что допустимым соотношением компонентов в элюирующей смеси являются:

Фосфорная кислота 5-7 Серная кислота0,1-0,3

МетанолОстальное

При использовании разработанной элюирующей смеси достигается количественное элюирование цветного комплекса, образованного батофенантро- 5 лином и железоаммонийными квасцами под воздействием витамина Е или синтетических антиокислителей. При использовании цветной элюирующей смеси цветной комплекс элюируется с -, пластинки не полностью. Экспериментально также установлено, что использование в составе элюирующей смеси других спиртов (этанол, бутанол, пропанол и др,), взамен метанола не I ,

позволяет полностью элюировать цветной комплекс. Кроме того, использование серной Кислоты в количествах меньше 0,1 об.% также значительно снижает эффективность элюирующей смеси, а увеличение ее количества, в элюенте более 0,3 об,% также нецелесообразно, так как значительно повышается кислотность среды и устойчивость окраски раствора снижается, g Замена серной кислоты соляной или другими минеральными кислотами также приводит к снижению эффективности элюирующей смеси,

Орто-фосфорная кислота введена в состав элюирующей смеси в качестве стабилизатора окраски. Оптимальным ее количеством в элюирующей смеси. является 6 об,%. Поскольку при умень- щении ее количества ниже 5 об,% или при увеличении более 7 об,.% стабильность окраски элюата падает, то до- - . пустимыми пределами использования фосфорной кислоты в элюирующей смеси является 5-7 об,%.

0

5

0

0

5

Пример. Определяют витамин Е и синтетические антиокислители в корме предлагаемым способом. Аналогично проводят анализ этого же образца известным способом С этой целью отбирают 1 кг измельченной пшеницы j в которую вводят по 10 мг д -токофершт-ацетата, сантохина, дилу дина бутилоксианизола (БОА) и бути- локситолуола (БОТ). При этом витамин Е и синтетические окислители сначала растворяют в 100 мл хлороформа и пульверизатором распыляют на измельченную пшеницу, одновременно перемешивая ее. Затем увлажненную хлороформом пшеницу просушивают в вытяжном шкафу до полного удаления запаха хлороформа. После этого отбирают по 1 г измельченной пшеницы для определения витамина Е и для определения синтетических антиокислителей.

Определение витамина Е проводят аналогично примеру 1, Синтетические .антиокислители определяют аналогично примеру 3, При этом рядом с полоской экстракта на пластинку наносят в вид точек метчики - по мкг сантохина дилудина БОТ и БОА. После окончания хроматографии цветную реакцию на пластинке проводят аналогично примеру I о На пластинке сначала появляются розово-красные пятна сантохина И БОА, через 3-5 мин полностью прояв- ляется дилудин, а еще через 5-7 мин - розово-красное пятно БОТ, Все дальнейшие операции проводят, как описано -в примере 1 „ а содержание о -токоферола и синтетических антиокислителей определяют по калибровочным графикам. Сравнительная характеристика предлагаемого и известного способов при определении витамина,Е и синтетических антиокислителей в кормах представлена в табл,2.

Таким образомJ при сравнении обоих способов выявлено, что предлагаемый способ определения витаминов группы Е значительно превосходит известный как по чувствительности, так и по точности определений. При этом предлагаемый способ дает возможность количественного определения сантохина, дилудина и синтетических антиокислителей фенодьного ряда (БОА и БОТ) с высокой точностью и хорошей воспроизводимостью результатов.

Возможность селективного определения токоферолов и синтетических

антиокислителей позволяет использо- .. вать предлагаемый способ как для анализа органов и тканей животных, так

и для определения синтетических антиокислителей в кормах и пишевых продуктах.

При проявлении пластинок путем их обработки раствором железоаммонийных

0 квасцов, высушивания и обработки раствором батофенантролина чувствительность способа повышается в 2 раза. При этом, за счет того что фон практически всегда остается бесцвет5 .ным, повьш1ается точность определений. При замене- железоаммонийных квасцов на другие соли трехвалентного железаj например на хлорид железа, после . опрыскивания пластинка становится

0 желтовато-красного цвета. Это объясняется присутствием в солях трехвалентного железа следовых количеств

5

0

5

0

5

.2+

;

0

5

Ее - , особенно в старых реактивах после их хранения. На этом фоне железоаммонийные квасцы являются солью, где практически отсуствуют ионы , что дает возможность использовать эту соль в смеси с бато- фенантролином в качестве цветореа- гента при определении витамина Е и синтетических антиокислителей,

Использование элюирующей смеси, полученной известным способом, для элюирования цветного комплекса Fe с батофенантролином невозможно, так как окраска извлекается не полностью, а на 50-60%, Предлагаемый элюент из - влекает цветной комплекс количественно.

Формула изобретения

Способ определения о(-токоферо- ла, пpeдycмaтpивaюш iй омыление анализируемой пробы в присутствии пирогаллола при 90-95°С, экстракцию эфиром неомыляемой части пробы, высушивание эфирного экстракта выпаривание и растворение полученного остатка в хлороформе с пocлeдyIoш м тонкослойным хроматографическим разделением полученного раствора путем нанесения его на хроматографическую пластинку злтоирование адсорбированного слоя, смесью, содержаш;ей спирт и неорганическую кислоту, проявление пластинок обработкой их цветореагентом и фото- . метрирование элюента, отлич ающ и и с я тем, что, с целью повышения чувствительности способа, проявление пластинок ведут путем обработки их сначала раствором железо- аммонийных квасцов в этаноле с последующим высушиванием, затем раствором батофенантролина в этаноле, а элюиро- вание окрашенного адсорбированного слоя осуществляют смесью, содержащей

Компонент

Т а 8 л и 1

Содержание компонентов в элюнрующей смеси

Фосфорная кислота 01 2345 6 7В910

Серная кислота 0,2 0,2 0,20,2 0,2 0,2 0,2 0,20,20,20,2

Метанол 99,8 98,897,896,8 95,8 94,893,892,892,890,889,8

Определено

(-токоферола, % 60,0 80,086,492,0 96,1 99,8 ГОО99,597,195,093,2

Фосфорная кислота 66 6666 6 6666

Серная кислота О 0,05 0,10,15 0,20 0,25 0,30 0,350,400,450,50

Метанол 94,0 93,9593,9093,8593,8093,7593,7093,6593,6093,5593,50

Определено,

erf-токоферола, % 84,6 97,299,799,8 100 99,999,898,096,995,194,0

{/-токоферил- ацетата

сантохина

дилудина

БОА

БОТ

йС-токоферилв качестве неорганической кислоты фосфорную кислоту и серную кислоту, а в качестве спирта - метанол при следующем соотношении компонентов, об.%:

Фосфорная кислота Серная кислота Метанол

5-7

0,1-0,3 Остальное

I 2

Предлагаемый способ

Иарестный способ

Изобретение относится к химическим методам определения -токоферола с применением хроматографических методов очистки, в частности тонкослойной хроматографии (ТСХ), и может быть использовано в сельскохозяйственных, медицинских и фармацевтических лабораториях при определении содержания : -токоферола и синтетических антиокислителей фенольного ряда, а также саитохина и дилудина в кормах, пищевых продуктах, в органах и тканях животных, а также для контроля производства витамина Е и синтетических антиокислителей. Цель изобретения - повышение чувствительности способа определения о(-токоферола. Способ заключается в щелочном омылении образцов, экстракции неомыляемой части гексаном, тонкоелойнохроматографи- ческом разделении, проведении цветг ной реакции непосредственно на пластинке, элюировании цветного комплекса с пластинки и фотометрированш элюата. Проявление пластинок проводят путем их обработки раствором железоаммонийных квасцов, высушивания и обработки их раствором бато- фенантролина с последующим злюиро- ванием окрашенного адсорбированного слоя смесью, содержащей фосфорную кислоту, серную кислоту и метанол при следующем соотношении компонентов, об.%: фосфорная.кислота 5-7 серная кислота 0,1-0,3, метанол - остальное. 2 табл.. С «б (Л со со ГчЭ tsD ГО оо