СПОСОБ И УСТРОЙСТВО ДЛЯ АНАЛИЗА ЧАСТИЦ В ЖИДКОМ ОБРАЗЦЕ Российский патент 2012 года по МПК G01N33/49 

Область техники

Настоящее изобретение относится к способу и устройству для анализа изображения частиц в жидком образце, удерживаемом в устройстве удержания образца.

Уровень техники

Анализ частицы в жидком образце, например определение концентрации и типа частиц, имеет большое значение в различных областях промышленности, например сельском хозяйстве, медицине и т.д.

Традиционный способ исследования частиц в жидком образце является визуальным, возможно, с помощью микроскопа, если частицы малы. Концентрация частиц обычно получается посредством ручной процедуры микроскопического наблюдения образца в особой счетной камере, например камере Бюркера. Счетная камера снабжена решеткой, делящей камеру на строго заданные малые объемы. Можно позволять частицам оседать на дне счетной камеры, чтобы можно было сфокусировать микроскоп на все частицы в камере и, таким образом, облегчать отсчет. Таким образом, образец должен оседать несколько минут прежде, чем можно было осуществлять отсчет. Тогда отсчет частиц может определяться отсчетом количества частиц на ячейку решетки. Аналитик вручную получает отсчет частиц, и ему нужно иметь опыт в осуществлении анализа, чтобы иметь возможность осуществлять надежный анализ.

Этот анализ занимает много времени. Кроме того, поскольку он осуществляется вручную, результаты анализа могут варьироваться в зависимости от лица, осуществляющего анализ. Анализ также имеет низкую точность, поскольку отсчитывается сравнительно немного частиц, и объемы существующих камер отсчета часто не точны.

В настоящее время известно несколько способов автоматического анализа для определения концентрации частиц в жидких образцах. Концентрации и размеры частиц, в особенности для биологических частиц, например клеток, можно определять согласно принципу Культера, который основан на измерении импеданса. Способ отсчета лейкоцитов по принципу Культера описан в US 5262302. Измерительное устройство согласно принципу Культера дорого стоит и потому требует значительных инвестиций. Таким образом, госпиталь или лаборатория будут не склонны тратиться на приобретение более одного устройства. Отсюда следует, что анализ придется осуществлять централизованно, и пациент будет вынужден ждать результатов анализа.

В WO 98/50777 раскрыт способ оценивания количества соматических клеток в молоке. Способ содержит этапы, на которых помещают объем образца в отделение для образца и передают электромагнитные сигналы, поступающие из отделения для образца, на матрицу детекторных элементов. Интенсивности зарегистрированных электромагнитных сигналов обрабатываются, и результаты коррелируются с количеством клеток, присутствующих в образце.

В международной заявке WO 2008/010761 раскрыты устройство и способ для подсчета и классификации частиц в образце. Способ содержит этапы получения, по меньшей мере, одного увеличенного цифрового изображения образца, идентификации частиц, которые отображаются в фокусе в изображении, и определения типов и количеств этих частиц. Когда частицами являются животные клетки, оптические явления на краях клеток, обусловленные цитоплазмой и клеточной мембраной, действующими как линза, используются для идентификации, какие клетки отображаются в фокусе. Также раскрыто, что изображения можно получать в разных фокальных плоскостях в образце. Однако не указано, как быть на большом удалении от этих фокальных плоскостей.

Таким образом, желательно ускорить и упростить существующие способы автоматического анализа частиц в жидком образце, например в биологическом образце. Было бы особенно преимущественно обеспечить быстрый, простой и сравнительно недорогой способ анализа, позволяющий проводить анализ на месте медицинского обслуживания.

Сущность изобретения

Задачей изобретения является обеспечение простого анализа, позволяющего определять объемный отсчет частиц, например лейкоцитов, тромбоцитов или бактерий в образце, например образце крови, и идентифицировать различные частицы.

Таким образом, согласно аспекту настоящего изобретения предусмотрен способ анализа частиц в жидком образце, причем образец удерживается в устройстве удержания образца, способ содержит этапы, на которых получают, посредством устройства получения изображения, множество изображений образца в разных фокальных плоскостях в устройстве удержания образца и анализируют изображения, посредством анализатора изображений, для идентификации частиц образца, которые отображаются в фокусе в любом из анализируемых изображений, и для идентификации, для каждой из идентифицируемых частиц, в каком из анализируемых изображений идентифицирована частица, и анализа тех частиц, которые идентифицированы как отображаемые в фокусе в любом одном из анализируемых изображений, с использованием соответствующего изображения, в котором соответствующая частица идентифицирована как отображаемая в фокусе; в котором множество изображений получают в разных, по существу, параллельных, фокальных плоскостях, каковые плоскости разнесены друг от друга на некоторое расстояние, причем расстояние меньше 10 микрон; причем на этапе идентификации частиц, которые отображаются в фокусе, для каждой частицы: находят изображение, в котором можно различить частицу; определяют наибольшее различие в интенсивности света между областью изображения, занятой частицей, и областью изображения, где нет различимых частиц; определяют соответствующие различия в интенсивности света в других изображениях, где различима та же частица; и идентифицируют изображение, где различие в интенсивности света максимально; из чего заключают, что частица находится в фокусе в этом идентифицированном изображении.

Получая множество изображений в разных фокальных плоскостях, можно охватить больший объем образца, где частицы все еще отображаются в фокусе. Таким образом, можно также использовать более крупное устройство удержания образца, где глубина образца, перпендикулярно фокальным плоскостям, может быть увеличена. Если анализ включает в себя определение концентрации, этого можно добиться также для частиц более низкой концентрации, поскольку анализируемый объем увеличивается.

Нет необходимости ожидать осаждения образца до получения изображений. Образец можно изображать со взвешенными частицами.

Получая множество изображений в разных фокальных плоскостях и определяя, какие частицы отображаются в фокусе в каком изображении, также можно определить, насколько глубоко в образце находится каждая из частиц. Таким образом, можно, например, отделять друг от друга две или более перекрывающиеся частицы, поскольку они находятся на разных глубинах в образце.

Кроме того, получая множество изображений в разных фокальных плоскостях и определяя, какие частицы отображаются в фокусе в каком изображении, можно определить размеры частиц перпендикулярно фокальной плоскости, поскольку можно будет подсчитать, в скольких изображениях, взятых в разных, но соседних фокальных плоскостях, каждая частица находится в фокусе. Однако это, конечно, зависит от частиц, достаточно больших по сравнению с расстоянием между фокальными плоскостями.

Меньшее расстояние между фокальными плоскостями позволяет изображать частицы с улучшенной фокусировкой, даже при более высоком увеличении. Таким образом, более мелкие частицы также можно изображать для анализа, когда расстояние между фокальными плоскостями сокращается. Кроме того, частицы можно изображать и анализировать с большей степенью детализации, поскольку преимущества получения совокупности изображений в разных фокальных плоскостях, рассмотренных выше, усиливаются с уменьшением расстояния.

Перехода от одной фокальной плоскости к другой можно добиться, например, перемещением линзы или другого светопреломляющего элемента, расположенного между образцом и устройством получения изображения. Для сдвига фокальной плоскости на столь малое расстояние, предусмотренное настоящим изобретением, можно использовать, например, пьезоэлектрический двигатель для перемещения линзы. Такой двигатель также имеет преимущества возможности перемещать линзу быстро и с высокой точностью.

Фокальные плоскости, по существу, параллельны друг другу и перпендикулярны оптической оси, проходящей от устройства получения изображения сквозь образец.

Анализатор изображений анализирует множество изображений, идентифицируя частицы, например клетки, которые отображаются в фокусе. Это позволяет получать изображение сравнительно толстого образца, вместе с тем отсчитывая или иначе анализируя только частицы, находящиеся в фокусе. Гарантируя отсчет только частиц, находящихся в фокусе, т.е. когда частицы отображаются с достаточной степенью детализации, можно осуществлять идентификацию типов частиц в образце, что можно одновременно использовать для определения статистически достоверного объемного отсчета частиц в образце.

Преимущества сокращения расстояния между фокальными плоскостями усиливаются за счет еще большего сокращения расстояния. Таким образом, расстояние предпочтительно меньше 5 микрон, более предпочтительно меньше 2 микрон, особенно 1.8 микрон или менее, в частности 1.6 микрон или менее.

При идентификации, какие частицы отображаются в фокусе в каких изображениях, разные изображения, полученные в разных фокальных плоскостях, предпочтительно сравнивать друг с другом. Конкретная частица обычно различима в нескольких разных изображениях, имеющих разные фокальные плоскости, причем фокальные плоскости изображений соседствуют друг с другом (т.е. разнесены на расстояние меньше 10 микрон). Чтобы идентифицировать, в каком изображении эта конкретная частица изображается в наилучшем фокусе, в качестве критерия выбора можно использовать контрастность соответствующих изображений. Таким образом, определяется наибольшее различие в интенсивности света между областью изображения, занятой частицей, и областью изображения, где нет различимых частиц, т.е. фоном. Другие изображения, где различима одна и та же частица, изучаются таким же образом. Таким образом, можно идентифицировать изображение, демонстрирующее наибольшую контрастность в отношении конкретной частицы, и частица рассматривается как находящаяся в фокусе в этом идентифицированном изображении. Такую же процедуру можно затем повторить для всех частиц, различимых в любом из полученных изображений.

Кроме того, дополнительно или альтернативно, идентификацию, какие частицы отображаются в фокусе в каком из полученных изображений, можно производить на основании дисперсии пикселя или выборки. Дисперсия пикселя может быть смещенной (S² _N) или скорректированной по смещению (S² _N-1). Скорректированная по смещению дисперсия пикселя вычисляется согласно следующей формуле:

где N - количество пикселей, x _i - интенсивность света пикселя i и - средняя интенсивность света.

При использовании дисперсии пикселя для идентификации, в каком из полученных изображений частица отображается в фокусе, задается область, содержащая частицу, а также частицы окружение (фон) ближайшее. Затем дисперсия пикселя определяется для этой заданной области. Дисперсия пикселя также определяется для соответствующей области других полученных изображений. Изображение, идентифицированное как имеющее наивысшую дисперсию пикселя, представляет собой изображение, в котором частица рассматривается как находящаяся в фокусе. Затем процедуру можно повторять для других частиц, различимых в любом из полученных изображений.

Таким образом, согласно аспекту настоящего изобретения также предусмотрен способ анализа частиц в жидком образце, причем образец удерживается в устройстве удержания образца, способ содержит этапы, на которых получают, посредством устройства получения изображения, множество изображений образца в разных фокальных плоскостях в устройстве удержания образца и анализируют изображения, посредством анализатора изображений, для идентификации частиц образца, которые отображаются в фокусе в любом одном из анализируемых изображений, и для идентификации, для каждой из идентифицируемых частиц, в каком из анализируемых изображений идентифицирована частица, и анализа тех частиц, которые идентифицированы как отображаемые в фокусе в любом одном из анализируемых изображений, с использованием соответствующего изображения, в котором соответствующая частица идентифицирована как отображаемая в фокусе; в котором множество изображений получают в разных, по существу, параллельных, фокальных плоскостях, каковые плоскости разнесены друг от друга на некоторое расстояние, причем расстояние меньше 10 микрон; причем на этапе идентификации частиц, которые отображаются в фокусе, для каждой частицы находят изображение, в котором можно различить частицу; задают область этого найденного изображения, каковая область содержит частицу и ее ближайшее окружение; определяют дисперсию пикселя этой заданной области; определяют дисперсию пикселя соответствующей области других изображений, где различима та же частица; и идентифицируют изображение, где дисперсия пикселя максимальна; из чего заключают, что частица находится в фокусе в этом идентифицированном изображении.

Вышеприведенное рассмотрение, относящееся к способу, отвечающему изобретению, который включает в себя определение различий в отношении интенсивности, также, в применимых частях, относится к способу, отвечающему изобретению, который включает в себя определение дисперсии пикселя. Приведена ссылка на это рассмотрение. Нижеследующее рассмотрение относится к необязательным признакам обоих способов, отвечающих изобретению.

Конкретную частицу можно идентифицировать как одну и ту же частицу в совокупности изображений на основании того, что она имеет, по существу, одно и то же пространственное положение во всех изображениях, где частица различима, поскольку изображения получаются с разными фокальными плоскостями вдоль оптической оси от устройства получения изображения сквозь образец, но не сдвигаются в сторону. Таким образом, изображения представляют, по существу, одну и ту же область образца, но на разных глубинах в образце. Поскольку частицы находятся в жидком образце и, таким образом, могут немного перемещаться в течение времени, желательно получать изображения в течение сравнительно короткого времени. Предпочтительно получать, по меньшей мере, два изображения, более предпочтительно, по меньшей мере, 5 изображений и, наиболее предпочтительно, по меньшей мере, 10 изображений за секунду. Это также ускоряет анализ в целом.

Любой из способов, отвечающих изобретению, может дополнительно содержать этапы, на которых накладывают друг на друга множество изображений и, таким образом, получают объединенное изображение, содержащее все частицы, отображаемые в фокусе в разных фокальных плоскостях. Таким образом, полный анализируемый объем образца можно представить в одном двухмерном изображении, где частицы образца могут отображаться в фокусе независимо от того, насколько глубоко в объеме образца в действительности располагается каждая из них при создании изображения.

Предпочтительно получать множество изображений последовательно, по одному изображению для каждой фокальной плоскости, причем фокальная плоскость перемещается на конкретное расстояние, меньше 10 микрон, между соседними изображениями. Этот способ получения изображения является быстрым и может осуществляться посредством простого устройства.

Получая большее количество изображений, можно охватывать больший объем образца. Как отмечено выше, чем больше объем, тем точнее можно определить, например, концентрацию, а также можно определять концентрацию частиц с более низкой концентрацией. Согласно настоящему изобретению удобно получать, по меньшей мере, 10, предпочтительно, по меньшей мере, 20, более предпочтительно, по меньшей мере, 50, еще более предпочтительно, по меньшей мере, 100 и наиболее предпочтительно, по меньшей мере, 200, изображений.

Кроме того, чтобы иметь возможность анализировать большой объем образца, устройство удержания образца может быть способно представлять жидкий образец для создания изображений таким образом, чтобы образец имел глубину, перпендикулярную фокальным плоскостям, и при этом достаточно большую. Глубина составляет предпочтительно, по меньшей мере, 100 микрон, более предпочтительно, по меньшей мере, 200 микрон и еще более предпочтительно, по меньшей мере, 500 микрон.

Удобно, устройство удержания образца предназначено для представления образца для создания изображений таким образом, чтобы глубина образца составляла 1 миллиметр или менее. Отсюда следует, что устройство удержания образца может иметь камеру размером 1 миллиметр или менее, благодаря чему жидкий образец может поступать в камеру посредством капиллярного действия. Таким образом, жидкий образец может всасываться непосредственно в камеру через впускной канал, соединяющий камеру периферией устройства, исключая необходимость в пипетках, насосах или других подобных приспособлениях. В частности, даже кровь может всасываться в камеру непосредственно из проколотого пальца пациента. Конечно, другие размеры камеры могут быть больше и в зависимости от того, насколько большая область образца изображается устройством получения изображения, в действительности может оказаться желательным, чтобы другие размеры были больше.

Настоящее изобретение представляет особый интерес для биологических анализов. Таким образом, жидкий образец может представлять собой биологический образец, например молоко, мочу, цереброспинальную жидкость или, в частности, кровь, например цельную кровь или плазму.

Частицы также могут быть биологическими, например эйкариотическими клетками, предпочтительно клетками млекопитающих, более предпочтительно клетками человека, например человеческими лейкоцитами. Однако, поскольку настоящее изобретение позволяет в достаточной степени анализировать даже более мелкие частицы, благодаря малому расстоянию между разными фокальными плоскостями, частицы альтернативно могут иметь максимальный диаметр меньше 20, удобно меньше 10, предпочтительно меньше 5 и более предпочтительно меньше 2, микрон. Примерами таких малых биологических частиц, представляющих большой интерес для анализа посредством настоящего изобретения, являются, например, бактерии, вирусы и тромбоциты.

Как отмечено выше, в порядке примера анализа, способ, отвечающий изобретению, можно использовать для определения концентрации частиц в образце. Количество идентифицированных частиц сопоставляется с изображаемым объемом образца. Этот объем задается изображаемой площадью образца, умноженной на изображаемую глубину образца. Отображаемая площадь определяется выбором устройства получения изображения, в сочетании с любым увеличением или уменьшением. Отображаемая глубина является функцией количества изображений и расстояния между соседними изображениями. Этот анализ, конечно, может зависеть от расстояния, которое достаточно мало, или от частиц, которые достаточно велики, для всех частиц, подлежащих отсчету в изображаемом объеме, подлежащих изображению в фокусе в, по меньшей мере, одном из изображений. Другой анализ, который позволяет проводить настоящее изобретение, представляет собой определение разных типов частиц. Разные типы частиц можно определять по их соответствующим физическим признакам. Такими признаками могут быть, например, размер, цвет, опалесценция и/или форма частиц. Предпочтительно анализ частиц согласно настоящему изобретению включает в себя определение типов и количеств частиц, чтобы можно было определять соотношения между разными типами частиц в образце. Таким образом, анализ частиц, которые были идентифицированы как отображаемые в фокусе, может содержать определение типов и количеств частиц, причем типы различаются по физическим признакам частиц, что позволяет определять соотношения между разными типами частиц в образце.

Частицы, подлежащие анализу, можно окрашивать посредством окрашивающего агента до получения изображений. Отсюда следует, что частицы можно легче отличать от фоновой жидкости. Если, например, частицы являются эйкариотическими клетками, можно применять окрашивающий агент, избирательно окрашивающий ядра клеток. Для дополнительного повышения различимости в полученных изображениях образец можно затем облучать светом конкретной длины волны, которая поглощается окрашивающим агентом, благодаря чему ядра клеток будут отчетливо изображаться как темные области или точки на более светлом фоне. Альтернативно окрашивающий агент может представлять собой, например, флуоресцентный краситель или антитело с флуоресцентной меткой или фрагмент антитела, специфически привязанный к частицам, подлежащим анализу. Затем образец можно облучать электромагнитной волной, которая поглощается флуорофором красителя или антитела, и устройство получения изображения можно приспособить для регистрации именно той электромагнитной волны, которая затем излучается флуорофором, благодаря чему окрашенные частицы будут изображаться как светлые области или точки на более темном фоне.

Окрашивающий агент может присутствовать в высушенном виде в устройстве удержания образца до ввода жидкого образца в устройство удержания образца. Таким образом, окрашивающий агент может быть включен в устройство удержания образца в ходе его изготовления. Окрашивающий агент может быть нанесен в высушенном виде, например, на стенку камеры устройства, в каковую камеру затем вводится жидкий образец, растворяя окрашивающий агент, до получения изображений образца в камере устройства удержания образца согласно настоящему изобретению. Вместо или помимо окрашивающего агента в устройство удержания образца могут быть включены другие реагенты или химикаты, например гемолизирующий агент для разложения эритроцитов в образце цельной крови или агент смачивания, например для облегчения всасывания жидкого образца в устройство удержания образца посредством капиллярного действия. Благодаря включению всех химикатов, необходимых для анализа согласно способу, отвечающему изобретению, устройство удержания образца дает возможность непосредственно получать образец в камере устройства и обеспечивать его для анализа. Подготовка образца не требуется. Фактически, если камера является капиллярной, как рассмотрено выше, образец крови может всасываться в камеру непосредственно из проколотого пальца пациента или любой образец может всасываться в камеру непосредственно из трубки или ячейки или контейнера любого другого типа. Снабжение устройства удержания образца реагентом позволяет осуществлять в устройстве удержания образца реакцию, которая подготавливает образец для анализа. Реакция запускается, когда образец вступает в контакт с реагентом. Таким образом, не требуется вручную подготавливать образец, что делает анализ особо пригодным для осуществления непосредственно в смотровом кабинете, например, пока пациент ждет.

Поскольку реагент обеспечивается в высушенном виде, устройство удержания образца может представлять собой готовый к использованию комплект, который можно транспортировать и хранить в течение долгого времени без ущерба работоспособности устройства удержания образца. Таким образом, устройство удержания образца с реагентом можно изготавливать и подготавливать задолго до осуществления анализа образца.

Устройство удержания образца может быть утилизируемым, т.е. предназначенным для одноразового использования. Если устройство удержания образца предназначено для одноразового использования, его можно изготавливать без учета какой-либо возможности очистки устройства удержания образца и, возможно, повторного нанесения реагента. Кроме того, устройство удержания образца можно штамповать из пластмассы, что снижает его себестоимость. Таким образом, использование утилизируемого устройства удержания образца может быть экономически целесообразным.

Устройство получения изображения может представлять собой цифровую камеру. Такое устройство получения изображения позволяет одновременно получать всю область изображения, после чего изображение можно непосредственно передавать на анализатор изображений для анализа цифрового изображения. Камера может относиться, например, к типу ПЗС или КМОП.

В зависимости, например, от размеров изображаемых частиц и разрешения устройства получения изображения, может быть выгодно получать увеличенные или уменьшенные изображения жидкого образца. Увеличения или уменьшения можно добиться посредством светопреломляющего элемента, например линзы, расположенной так, что она пересекает оптическую ось между образцом и устройством получения изображения. Удобно использовать увеличение, например увеличение 2-50x, предпочтительно 2-30x, более предпочтительно 2-20x, наиболее предпочтительно 3-10x. Однако для анализа очень маленьких частиц, например бактерий, вирусов или тромбоцитов, может быть предпочтительно еще более высокое увеличение, например 10-50x, более предпочтительно 10-35x, наиболее предпочтительно 10-20x. Даже при использовании очень высокого увеличения изображения все же могут охватывать достаточно большой объем, поскольку многие изображения получены в разных фокальных плоскостях в образце. Таким образом, изображаемый объем образца может задаваться изображаемой площадью образца, умноженной на глубину образца, охваченного множеством изображений.

Как отмечено выше, применяемое оптическое увеличение или уменьшение связано с разрешением устройства получения изображения. Это разрешение составляет, удобно, по меньшей мере, 3 Мпикселя, предпочтительно, по меньшей мере, 5 Мпикселей, в частности 6 Мпикселей или более.

Согласно другому аспекту настоящего изобретения предусмотрено измерительное устройство для анализа частиц в жидком образце, причем устройство содержит устройство получения изображения, анализатор изображений, держатель, предназначенный для поддержки устройства удержания образца, удерживающего жидкий образец, и светопреломляющий элемент, расположенный между устройством получения изображения и держателем, в котором фокальная плоскость может скачкообразно перемещаться в устройстве удержания образца, когда оно поддерживается держателем, что позволяет устройству получения изображения получать множество изображений образца в разных фокальных плоскостях в устройстве удержания образца, причем разные фокальные плоскости, по существу, параллельны друг другу и разнесены друг от друга на некоторое расстояние, причем расстояние меньше 10 микрон, в котором анализатор изображений предназначен для анализа, по меньшей мере, одного полученного изображения для идентификации, какие из частиц отображаются в фокусе, и анализа тех частиц, которые идентифицированы как отображаемые в фокусе; причем идентификация частиц, которые отображаются в фокусе, осуществляется для каждой частицы путем нахождения изображения, в котором можно различить частицу; определения наибольшего различия в интенсивности света между областью изображения, занятой частицей, и областью изображения, где нет различимых частиц; определения соответствующих различий в интенсивности света в других изображениях, где различима та же частица; и идентификации изображения, где различие в интенсивности света максимально, что позволяет сделать вывод, что частица находится в фокусе в этом идентифицированном изображении.

Альтернативно настоящее изобретение предусматривает измерительное устройство для анализа частиц в жидком образце, причем устройство содержит устройство получения изображения, анализатор изображений, держатель, предназначенный для поддержки устройства удержания образца, удерживающего жидкий образец, и светопреломляющий элемент, расположенный между устройством получения изображения и держателем, в котором фокальная плоскость может скачкообразно перемещаться в устройстве удержания образца, когда оно поддерживается держателем, что позволяет устройству получения изображения получать множество изображений образца в разных фокальных плоскостях в устройстве удержания образца, причем разные фокальные плоскости, по существу, параллельны друг другу и разнесены друг от друга на некоторое расстояние, причем расстояние меньше 10 микрон, в котором анализатор изображений предназначен для анализа, по меньшей мере, одного полученного изображения для идентификации, какие из частиц отображаются в фокусе, и анализа тех частиц, которые идентифицированы как отображаемые в фокусе; причем идентификация частиц, которые отображаются в фокусе, осуществляется для каждой частицы путем нахождения изображения, в котором можно различить частицу; задания области этого найденного изображения, каковая область содержит частицу и ее ближайшее окружение; определения дисперсии пикселя этой заданной области; определения дисперсии пикселя соответствующей области других изображений, где различима та же частица; и идентификации изображения, где дисперсия пикселя максимальна, что позволяет сделать вывод, что частица находится в фокусе в этом идентифицированном изображении.

Нижеследующее рассмотрение относится к обоим альтернативным измерительным устройствам.

Устройство содержит держатель, предназначенный для приема устройства удержания образца, описанного выше, в отношении способа, отвечающего изобретению, которое удерживает жидкий образец, изображения которого получаются согласно настоящему изобретению.

Фокальная плоскость может скачкообразно перемещаться через жидкий образец вдоль оптической оси устройства, проходящей от устройства получения изображения через держатель, так что каждый шаг меньше 10 микрон, что позволяет получать изображение после каждого шага.

Фокальную плоскость можно перемещать, например, путем перемещения светопреломляющего элемента, например линзы, вдоль оптической оси устройства, в то время как держатель и устройство получения изображения остаются на месте. Для перемещения фокальной плоскости на столь малое расстояние, предусмотренное настоящим изобретением, а также достаточно быстро и с достаточной точностью, воспроизводимостью и стабильностью, предпочтительно использовать пьезоэлектрический двигатель для перемещения светопреломляющего элемента.

Любое из устройств может дополнительно содержать источник электромагнитного излучения, предназначенный для облучения образца, удерживаемого в устройстве удержания образца. Можно использовать любой традиционный источник излучения, например светодиод, лазер или лампу накаливания. Источник света позволяет легче отличать частицы образца в изображениях. Если желательно облучать образец конкретной длиной волны, этого можно добиться традиционными средствами, например применяя лазер или светофильтр в комбинации с источником света.

Вышеприведенное рассмотрение, относящееся к способам, отвечающим изобретению, также, в применимых частях, относится к устройствам, отвечающим изобретению. Приведена ссылка на это рассмотрение.

Устройства и способы, отвечающие изобретению, обеспечивают, с точки зрения пользователей, очень простой анализ жидкого образца, например цельной крови. Для анализа не требуется сложного измерительного устройства или изощренных действий оператора. Поэтому его можно осуществлять в прямой связи, например, с обследованием пациента, без необходимости в квалифицированном специалисте. Нужно просто ввести анализируемый образец в устройство удержания образца, и чтобы он удерживался там. Затем образец можно анализировать согласно способу, отвечающему изобретению, предпочтительно с помощью устройства, отвечающего изобретению, в автоматическом режиме и в результате устройство может представлять результаты анализа.

Краткое описание чертежей

Перейдем к более подробному описанию изобретения в порядке примера со ссылкой на прилагаемые чертежи.

Фиг. 1 - схема устройства, отвечающего изобретению.

Фиг. 2 - логическая блок-схема способа, отвечающего изобретению.

Фиг. 3 - схематический вид в перспективе пьезоэлектрического двигателя, который можно использовать в предпочтительных вариантах осуществления способа или устройства, отвечающего изобретению.

Подробное описание предпочтительных вариантов осуществления

Согласно фиг. 1 устройство, отвечающее настоящему изобретению, содержит источник 434 света, устройство 410 удержания образца, оптическую систему 438 (с коэффициентом увеличения 5x, устройство получения изображения с разрешением 6 Мпикселей и возможностью перемещения фокальной плоскости) и диафрагму 450, направляющую свет на устройство 440 получения изображения. Устройство предназначено для получения нескольких цифровых изображений образца с использованием разных оптических настроек. Например, несколько цифровых изображений может изображать десять разных слоев 720a-j образца 710.

Со ссылкой на фиг. 2 описан способ объемного отсчета лейкоцитов. Способ содержит этап, на котором получают образец крови в устройстве удержания образца, этап 102. В устройстве удержания образца получают неразведенный образец цельной крови. Образец можно получать из капиллярной крови или венозной крови. Образец капиллярной крови может втягиваться в камеру устройства удержания образца непосредственно из проколотого пальца пациента. Образец крови входит в контакт с высушенным реагентом, содержащим гемолизирующий агент и окрашивающий агент, в устройстве удержания образца, инициируя реакцию. Эритроциты разлагаются, и окрашивающий агент накапливается в ядрах лейкоцитов образца. В течение нескольких минут после получения образца крови образец готов для анализа. Альтернативно образец крови получают и смешивают с гемолизирующим агентом и окрашивающим агентом до ввода в устройство удержания образца. Затем устройство удержания образца помещают в устройство, отвечающее изобретению, этап 104. Анализ можно инициировать нажатием кнопки устройства. Альтернативно анализ автоматически инициируется устройством в случае обнаружения присутствия устройства удержания образца.

Образец облучают, этап 106, и множество цифровых изображений, с разрешением 6 Мпикселей, получают на разных слоях образца, т.е. в разных фокальных плоскостях, на расстоянии 1.6 микрон друг от друга и с оптическим увеличением 5x, этап 108. Образец облучается электромагнитным излучением, длина волны которого соответствует пику поглощения окрашивающего агента. Отсюда следует, что цифровые изображения будут содержать черные или более темные точки в позициях ядер лейкоцитов.

Полученные цифровые изображения поступают на анализатор изображений, который осуществляет анализ изображения для совокупности цифровых изображений, этап 110. Анализатор изображений определяет концентрацию лейкоцитов, отсчитывая черные точки, идентифицирует, какие клетки находятся в фокусе в каком изображении и анализирует размер и форму определенного количества клеток в фокусе для классификации лейкоцитов и получения относительного содержания разных типов лейкоцитов в образце крови.

Согласно фиг. 3 пьезоэлектрический двигатель 1 содержит круглый по форме статор 3 и круглый по форме ротор 2, причем ротор 2 прижимается к поверхности статора 3, тем самым обеспечивая отвод механической энергии. В ходе работы двигателя генерируется бегущая волна на поверхности статора 3 в направлении, указанном стрелкой 6, причем поверхность ведет себя как гибкое кольцо и создает эллиптическое движение на границе раздела с ротором. Это эллиптическое движение поверхности контакта вращает ротор 2 в направлении, указанном стрелкой 7, и, таким образом, обеспечивает движение соединенного с ним ведущего вала. Направления, указанные стрелкой 6 и стрелкой 7, можно, что очевидно, реверсировать, как показано на фиг. 3. Зубья, присоединенные к статору 3, можно использовать для увеличения скорости вращения. Выход двигателя зависит, например, от трения на границе раздела между движущимся ротором и статором и от амплитуды и других характеристик бегущей волны в статоре 3.

Следует подчеркнуть, что описанные здесь предпочтительные варианты осуществления ни в коем случае не являются ограничительными и что в объеме защиты, заданном формулой изобретения, возможны многие альтернативные варианты осуществления.

Группа изобретений относится к исследованию частиц в жидком образце. При осуществлении вариантов способа образец удерживается в устройстве удержания образца, способ содержит этапы, на которых получают, посредством устройства получения изображения, множество изображений образца в разных фокальных плоскостях в устройстве удержания образца; анализируют изображения посредством анализатора изображений для идентификации, какие, если есть, из частиц образца отображаются в фокусе в каждом изображении, и анализа тех частиц, которые идентифицированы как отображаемые в фокусе; в котором множество изображений получают в разных, по существу, параллельных, фокальных плоскостях, каковые плоскости разнесены друг от друга на расстояние, причем указанное расстояние меньше 10 микрон. Также представлены устройства, предназначенные для использования согласно вышеуказанным вариантам способа. Достигается ускорение и упрощение исследования. 4 н. и 19 з.п. ф-лы, 3 ил.

1. Способ идентификации частиц в жидком образце, причем образец удерживается в устройстве удержания образца, способ содержит этапы, на которых:
получают посредством устройства получения изображения множество изображений образца, удерживаемого в устройстве удержания образца, в разных фокальных плоскостях; и
анализируют указанные изображения посредством анализатора изображений для идентификации частиц образца, которые отображаются в фокусе в любом одном из анализируемых изображений, и для идентификации для каждой из идентифицируемых частиц, в каком из анализируемых изображений идентифицирована частица, и анализа тех частиц, которые были идентифицированы как отображаемые в фокусе в любом одном из анализируемых изображений, с использованием соответствующего изображения, в котором соответствующая частица была идентифицирована как отображаемая в фокусе;
в котором множество изображений получают в разных параллельных фокальных плоскостях, которые разнесены друг от друга на расстояние, причем указанное расстояние меньше 10 мкм; причем на этапе идентификации частиц, которые отображаются в фокусе, для каждой частицы:
находят изображение, в котором частица является различимой;
определяют наибольшее различие в интенсивности света между областью изображения, занятой частицей, и областью изображения, где нет различимых частиц;
определяют соответствующие различия в интенсивности света в других изображениях, где различима та же частица; и
идентифицируют изображение, где различие в интенсивности света максимально;
из чего заключают, что частица находится в фокусе в этом идентифицированном изображении.

2. Способ идентификации частиц в жидком образце, причем образец удерживается в устройстве удержания образца, способ содержит этапы, на которых:
получают посредством устройства получения изображения множество изображений образца, удерживаемого в устройстве удержания образца в разных фокальных плоскостях; и
анализируют указанные изображения посредством анализатора изображений для идентификации частиц образца, которые отображаются в фокусе в любом одном из анализируемых изображений, и для идентификации для каждой из идентифицируемых частиц, в каком из анализируемых изображений идентифицирована частица, и анализа тех частиц, которые были идентифицированы как отображаемые в фокусе в любом из анализируемых изображений, с использованием соответствующего изображения, в котором соответствующая частица идентифицирована как отображаемая в фокусе;
в котором множество изображений получают в разных параллельных фокальных плоскостях, которые разнесены друг от друга на расстояние, причем указанное расстояние меньше 10 мкм; причем на этапе идентификации частиц, которые отображаются в фокусе, для каждой частицы:
находят изображение, в котором частица является различимой;
задают область этого найденного изображения, которая содержит
частицу и ее ближайшее окружение;
определяют дисперсию пикселя этой заданной области;
определяют дисперсию пикселя соответствующей области других
изображений, где различима та же частица; и
идентифицируют изображение, где дисперсия пикселя максимальна;
из чего заключают, что частица находится в фокусе в этом
идентифицированном изображении.

3. Способ по п.1 или 2, в котором расстояние меньше 5 мкм, предпочтительно меньше 2 мкм.

4. Способ по п.1 или 2, в котором способ дополнительно содержит этапы, на которых накладывают друг на друга множество изображений, и таким образом получают объединенное изображение, содержащее все частицы, отображаемые в фокусе в разных фокальных плоскостях.

5. Способ по п.1 или 2, в котором получают только по одному изображению для каждой фокальной плоскости.

6. Способ по п.1 или 2, в котором получают, по меньшей мере, 10, предпочтительно, по меньшей мере, 100 и более предпочтительно, по меньшей мере, 200 изображений.

7. Способ по п.1 или 2, в котором этап получения множества изображений содержит этап, на котором устройство удержания образца представляет жидкий образец для создания изображений таким образом, чтобы образец имел глубину, перпендикулярную фокальным плоскостям, по меньшей мере, 100 мкм, предпочтительно, по меньшей мере, 200 мкм, более предпочтительно, по меньшей мере, 500 мкм.

8. Способ по п.1 или 2, в котором этап получения множества изображений образца содержит этап, на котором устройство удержания образца представляет жидкий образец для создания изображений таким образом, чтобы образец имел глубину, перпендикулярную фокальным плоскостям, 1 мм или менее.

9. Способ по п.1 или 2, в котором жидкий образец является биологическим образцом.

10. Способ по п.1 или 2, в котором жидкий образец является образцом крови.

11. Способ по п.1 или 2, в котором частицы являются эукариотическими клетками, предпочтительно клетками млекопитающих, более предпочтительно клетками человека.

12. Способ по п.1 или 2, в котором частицы являются бактериями, вирусами или тромбоцитами.

13. Способ по п.1 или 2, в котором частицы имеют максимальный диаметр меньше 20, предпочтительно меньше 10, более предпочтительно меньше 2 мкм.

14. Способ по п.1 или 2, в котором на этапе анализа частиц, которые были идентифицированы как отображаемые в фокусе, определяют типы и количества частиц, причем типы различаются по физическим характеристикам частиц, что позволяет определять соотношения между разными типами частиц в образце.

15. Способ по п.1 или 2, в котором частицы, подлежащие анализу, окрашивают посредством окрашивающего агента до получения изображений.

16. Способ по п.15, в котором жидкий образец контактирует с окрашивающим агентом, причем окрашивающий агент пребывает в сухом виде в устройстве удержания образца, благодаря чему окрашивающий агент растворяется в образце.

17. Способ по п.15, в котором окрашивающий агент является флуоресцентным окрашивающим агентом.

18. Способ по п.1 или 2, в котором устройство получения изображения является цифровой камерой.

19. Способ по п.1 или 2, в котором изображения, полученные посредством устройства получения изображения, получают с увеличением жидкого образца, причем увеличение достигается посредством светопреломляющего элемента, такого как линза.

20. Способ по п.1 или 2, в котором изображаемый объем образца задается изображаемой площадью образца, умноженной на глубину образца, охваченного множеством изображений.

21. Измерительное устройство для идентификации частиц в жидком образце, причем устройство содержит устройство получения изображения, анализатор изображений, держатель, выполненный с возможностью поддержки устройства удержания образца, удерживающего жидкий образец, и светопреломляющий элемент, расположенный между устройством получения изображения и держателем;
в котором фокальная плоскость может скачкообразно перемещаться в устройстве удержания образца, когда оно поддерживается держателем, что позволяет устройству получения изображения получать множество изображений образца в разных фокальных плоскостях в устройстве удержания образца, причем разные фокальные плоскости параллельны друг другу и разнесены друг от друга на расстояние, причем указанное расстояние меньше 10 мкм;
в котором анализатор изображений выполнен с возможностью анализа, по меньшей мере, одного полученного изображения для идентификации, какие из частиц отображаются в фокусе, и анализа тех частиц, которые идентифицированы как отображаемые в фокусе;
причем для идентификации частиц, которые отображаются в фокусе, анализатор изображений выполнен с возможностью осуществления для каждой частицы:
нахождения изображения, в котором частица является различимой; определения наибольшего различия в интенсивности света между областью изображения, занятой частицей, и областью изображения, где нет различимых частиц;
определения соответствующих различий в интенсивности света в других изображениях, где различима та же частица; и
идентификации изображения, где различие в интенсивности света максимально;
что позволяет сделать вывод, что частица находится в фокусе в этом идентифицированном изображении.

22. Измерительное устройство для идентификации частиц в жидком образце, причем устройство содержит устройство получения изображения, анализатор изображений, держатель, выполненный с возможностью поддержки устройства удержания образца, удерживающего жидкий образец, и светопреломляющий элемент, расположенный между устройством получения изображения и держателем;
в котором фокальная плоскость может скачкообразно перемещаться в устройстве удержания образца, когда оно поддерживается держателем, что позволяет устройству получения изображения получать множество изображений образца в разных фокальных плоскостях в устройстве удержания образца, причем разные фокальные плоскости параллельны друг другу и разнесены друг от друга на расстояние, причем указанное расстояние меньше 10 мкм;
в котором анализатор изображений выполнен с возможностью анализа, по меньшей мере, одного полученного изображения для идентификации, какие из частиц отображаются в фокусе, и анализа тех частиц, которые идентифицированы как отображаемые в фокусе;
причем для идентификации частиц, которые отображаются в фокусе, анализатор изображений выполнен с возможностью осуществления для каждой частицы:
нахождения изображения, в котором частица является различимой; задания области этого найденного изображения, которая содержит частицу и ее ближайшее окружение; определения дисперсии пикселя этой заданной области;
определения дисперсии пикселя соответствующей области других
изображений, где различима та же частица; и
идентификации изображения, где дисперсия пикселя максимальна;
что позволяет сделать вывод, что частица находится в фокусе в этом идентифицированном изображении.

23. Устройство по п.21 или 22, в котором расстояние между фокальными плоскостями меньше 5 мкм, предпочтительно меньше 2 мкм.