СПОСОБ ОЧИСТКИ АПОЛИПОПРОТЕИНА А-1 Российский патент 2012 года по МПК C07K1/18 C07K14/775 

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к получению протеинов и, в частности, к получению ароА-1.

Уровень техники

Липопротеин высокой плотности (HDL) является важным липопротеином крови. Он участвует в процессе, называемом обратный транспорт холестерина (RCT), посредством которого холестерин из клеток тканей может транспортироваться в печень, где метаболизируется до безвередной субстанции, тем самым сдерживая возникновение и развитие атеросклероза (AS). Аполипопротеин А-1 (ароА-1) является основной формой аполипопротеина в липопротеине высокой плотности (HDL). Он тесно связан с физиологической функцией HDL в крови. Он является главным участником в HDL антиатеросклеротическом действии. Кроме того, согласно последним данным исследований, недостаток в ароА-1 может вызвать развитие атеросклероза и усиливать воспалительный процесс. Также ароА-1 снижает содержание липопротеинов низкой плотности (LDL) и очищает бляшки. В дополнение, согласно последним данным исследований, ароА-1 является перспективным для применения в лекарственных средствах с противовоспалительным действием или действием, направленным на печень.

Для очистки ароА-1 обычно используются способы, такие как скоростное ультрацентрифугирование, осаждение органическим растворителем и высокоэффективная жидкостная хроматография (HPLC). Однако существуют некоторые существенные недостатки в этих способах, такие как низкий выход, высокая стоимость, небезопасность и небольшой объем производства. Эти способы не пригодны для промышленного получения ароА-1.

С другой стороны, при получении одной из фракций после фракционирования плазмы фракция плазмы IV всегда исключается, поскольку пригодный продукт не может быть очищен для коммерческого применения. В соответствии с настоящим изобретением обеспечивается способ очистки, пригодный для крупносерийного производства, в результате которого из фракции плазмы IV получают ароА-1 с высокой чистотой.

Раскрытие изобретения

Согласно настоящему изобретению было обнаружено, что мочевина может сильно влиять на действие ароА-1 при ионообменной хроматографии. Если ароА-1 не связан с мочевиной, то он очень легко адсорбируется на анионообменной колонке и относительно тяжело элюируется из колонки. Однако, если ароА-1 связан с мочевиной, то он очень легко элюируется из анионообменной колонки. Таким образом, по настоящему изобретению ароА-1 очищали с помощью двух анионообменных колонок, используя два разных профиля элюции.

Настоящее изобретение обеспечивает способ очистки аполипопротеина А-1, включая следующие стадии: а) фракцию плазмы крови IV (полученную по способу низкотемпературного фракционирования этанолом) смешивают с 1-8 М раствором мочевины, формируя предварительный раствор, содержащий фракцию IV; b) предварительный раствор, полученный в стадии а), загружают в первую колонку для анионной хроматографии, и затем элюируют 1-8 М раствором мочевины с получением ароА-1 протеина; с) раствор ароА-1 протеина из стадии b) загружают во вторую колонку для анионной хроматографии, и затем элюируют 0-1 М раствором мочевины с получением чистого ароА-1 протеина. Этот способ имеет преимущества, такие как высокий выход, низкая стоимость и пригодность для промышленного производства. Кроме того, этот способ использует фракцию плазмы IV в качестве исходного материала, вследствие чего существует возможность применения источников плазмы.

Чистый ароА-1, полученный в данном изобретении, является перспективным для применения в лечении атеросклероза, противовоспалительном лечении, антитоксическом лечении, лекарствах, направленных на лечение печени, и др.

Подробное описание чертежей

Фиг.1 представляет схему, показывающую способ получения ароА-1 из фракции плазмы крови IV.

Фиг.2 показывает процесс элюции первой ионообменной хроматографии в примере 1.

Фиг.3 показывает результат электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (SDS-PAGE) образца, полученного при первой ионообменной хроматографии в примере 1.

Фиг.4 показывает результат электрофореза SDS-PAGE образца, полученного при второй ионообменной хроматографии в примере 1.

Фиг.5 показывает результат электрофореза SDS-PAGE образца, полученного в примере 4.

Фиг.6 показывает результат электрофореза SDS-PAGE образца, полученного в примере 2.

Фиг.7 показывает результат электрофореза SDS-PAGE образца, полученного в примере 3.

Раскрытие предпочтительного воплощения изобретения

Воплощение способа настоящего изобретения проиллюстрировано на фиг.1, которая представляет схему, показывающую способ получения ароА-1 из фракции плазмы крови IV.

(1) Предварительная подготовка фракции плазмы крови IV

Описываемую фракцию IV получают с помощью способа низкотемпературного фракционирования этанолом (Cohn, Е. J.; Strong, L.E.; Huges, W.L.; et al., Preparation and properties of serum and plasma proteins IV. A system for the separation into fractions of the protein and lipoprotein components of biological tissues and fluids. Amer Chem Soc, 1946, 68:459-475). Фракцию IV растворяют в буфере, к раствору добавляют определенное количество и тщательно перемешивают. В этом способе ароА-1 связан с мочевиной, и такая комбинация является обратимой. Концентрация добавляемой мочевины составляет 1-8 М, предпочтительно 3-7 М и более предпочтительно 5-6 М. Массовое соотношение фракции IV и мочевины составляет 1:30-300, предпочтительно 1:90-240, и более предпочтительно 1:150-210.

Буфер, который обычно используется в данном случае, выбирают из следующих: Tris буфер, фосфатный буфер или HEPES буфер, предпочтительно Tris буфер. pH буфера составляет 7,2-8,5, предпочтительно 7,5-8, и более предпочтительно 7,8.

В другом примере фракцию IV при низкой температуре (0-4°С).

В другом примере подготовительный раствор центрифугируют для удаления и затем фильтруют. Скорость центрифугирования составляет 6000-10000 об/мин, предпочтительно 8000 об/мин, размер пор фильтрационной мембраны составляет 0,2-0,6 мкм, предпочтительно 0,45 мкм.

(2) Первая DEAE анионообменная хроматография

Раствор, полученный в стадии (1), загружают в DEAE (диэтиламиноэтанол) анионообменную колонку, и протеин в растворе, включая ароА-1, присоединяется в колонке. В частности, содержащий ароА-1 раствор, полученный в стадии (1), растворяют водой 1-10 кратно, и предпочтительно 3-7 кратно. После растворения раствор загружают в анионообменную колонку при скорости потока 0,5-1,5 мл/мин, предпочтительно 0,8-1,2 мл/мин.

Затем протеин элюируют посредством двух стадий элюции. В первой стадии для элюирования колонки используется буфер со слабой проводимостью. В этот период времени ароА-1 слабо соединяется с колонкой, и протеин, содержащий по большей части ароА-1, может быть элюирован первым. Во второй стадии для элюирования колонки используется буфер с высокой проводимостью, и элюирует протеин, содержащий главным образом примеси.

Элюент, который элюирует ароА-1, содержит 1-8 М мочевину, предпочтительно 3-7 М, и более предпочтительно 5-6 М. Проводимость составляет 1-4 мс/см, предпочтительно 2-3,8 мс/см, и более предпочтительно 2,5-3,6 мс/см. Соли в элюенте могут включать, но не ограничиваясь, NaCl, КСl, MgCl₂ и СаСl₂. NaCl является предпочтительным.

Элюент, который элюирует примеси, содержит 0-1 М мочевину; 0 М является предпочтительным. Проводимость составляет 4,5-100 мс/см. Соли в элюенте могут включать, но не ограничиваясь, NaCl, КСl, MgCl₂ и СаСl₂. NaCl является предпочтительным.

Буфер, который обычно используется в данном случае, выбирают из следующих: Tris буфер, фосфатный буфер или HEPES буфер, предпочтительно Tris буфер. pH буфера составляет 7,2-8,5, предпочтительно 7,5-8, и более предпочтительно 7,8.

Скорость потока в колонке раствора, содержащего подготовительную фракцию, на стадии 1 составляет 0,5-1,5 мл/мин, предпочтительно 0,8-1,2 мл/мин. Соотношение объемов фракции IV и колонки составляет 1:5-50, предпочтительно 1:15-40, и более предпочтительно 1:20-30.

(3) Вторая DEAE анионообменная хроматография

АроА-1 раствор, полученный в первой DEAE анионообменной хроматографии стадии 1, содержащий ароА-1, мочевину и следовое количество примесей, разбавляли водой с получением раствора с низкой проводимостью и затем загружали во вторую DEAE колонку.

Протеин связывется во второй DEAE колонке, и мочевина остается в растворе и элиминируется как элюат. Затем протеин элюируется посредством двух стадий. В первой стадии для элюирования колонки используется буфер со слабой проводимостью. АроА-1 сильно соединяется с колонкой, и примеси элюируются из колонки. Во второй стадии для элюирования колонки используется буфер с высокой проводимостью, и элюируется чистый ароА-1.

Проводимость элюента, который элюирует примеси, составляет 1-20 мс/см, предпочтительно 7-15 мс/см, более предпочтительно 9-12 мс/см. 0-1 М мочевина может присутствовать в элюенте, и 0 М является предпочтительным. Соли в элюент могут включать, но не ограничиваясь, NaCl, КСl, MgCl₂ и СаСl₂. NaCl является предпочтительным.

Проводимость элюента, который элюирует ароА-1, составляет 50-100 мс/см, предпочтительно 70-95 мс/см, и более предпочтительно 80-90 мс/см. 0-1 М мочевина может присутствовать в элюенте, и 0 М является предпочтительным. Соли в элюенте могут включать, но не ограничиваясь, NaCl, КСl, MgCl₂ и СаСl₂. NaCl является предпочтительным.

В другом примере после связывания ароА-1 и следового количества примесей во второй DEAE колонке применяется градиент проводимости 3 мс/см/мин для элюирования протеина. Проводимость элюента возрастает от 1 до 100 мс/см. Чистый ароА-1 элюирует при проводимости между 30 и 60 мс/см и его собирают.

Буфер, который обычно используется в данном случае, выбирают из следующих: Tris буфер, фосфатный буфер или HEPES буфер, предпочтительно Tris буфер. pH буфера составляет 7,2-8,5, предпочтительно 7,5-8, более предпочтительно 7,8.

В данном изобретении также обеспечиваются способы постпроцессинга для обработки чистого ароА-1 раствора, полученного в (3). Способы включают стадию ультрафильтрации, стадию добавления стабилизатора и стадию лиофилизации. В итоге получают лиофилизированный ароА-1 после стадий постпроцессинга.

Ультрафильтрация, которая наиболее часто используется в данной области, используется для приведения ароА-1 раствора в необходимое состояние, устанавливая соответствующее рН и концентрацию протеина. Для ультрафильтрации используют ультрафильтрационную мембрану Millipore PES с предельной молекулярной массой 5000, рабочая температура составляет 4°С и рабочее давление находится под 0,3 МПа.

Добавляемый стабилизатор выбирают из часто используемого в данной области, включая, но, не ограничиваясь, гидроксипропилцеллюлозу, гидроксипропилметилцеллюлозу, гликолят щелочной целлюлозы, сахарозу, сорбиерит и др.

Применяют способ лиофилизации, который часто используется в данной области, а именно: продукт замораживают ниже -36°С в течение 3-4 часов и затем лиофилизируют под вакуумом 7-9 Па. Температура в холодной ловушке составляет около -55°С, и затем, во второй период, температура равна 40°С и время составляет около 15 часов.

Хроматографические колонки, применяемые в данном изобретении, могут выбираться среди часто используемых колонок в данной области, и среда для хроматографии может быть средой для QAE (четвертичный амин) или DEAE анионообменной хроматографии, предпочтительно DEAE.

Изобретение в дальнейшем иллюстрируется подробно в следующих примерах. Необходимо понимать, что эти примеры применяются для объяснения изобретения, но не для ограничения объема изобретения. Для тех экспериментов в следующих примерах, если условие не определено, это означает, что условие является рутинным или рекомендовано производителем. Если же определено, то соотношения, указанные ниже, являются массовыми соотношениями.

Если указано другое, определения технических и научных терминов являются теми, которые обычно подразумеваются специалистом в данной области техники.

ПРИМЕР 1. Очистка АроА-1

Исходные материалы включают: 0,2 г фактора плазмы IV, две 5 мл DEAE анионообменные колонки (от GE Healthcare) и оборудование для очистки и определения проводимости, а именно АКТА EXPLORER 100 (от GE Healthcare).

(1) Предварительная обработка фактора плазмы IV

0,2 г фракции IV растворяют в 100 мл Tris буфера (pH 7,8, 4°С). К раствору добавляют мочевину до тех пор, пока конечная концентрация не достигнет 6 моль/л, и тщательно перемешивают. Раствор центрифугируют при 8000 об/мин с удалением осадка, затем фильтруют с помощью 0,45 мкм фильтра.

(2) Первая DEAE анионообменная хроматография

Первую DEAE колонку уравновешивают Tris буфером (pH 7,8), содержащим 6 моль/л мочевины. Раствор из стадии (1) загружают в DEAE колонку при скорости потока 1 мл/мин. Используют Tris буфер (pH 7,8, проводимость 3,5 мс/см) с концентрацией мочевины 6 моль/л для элюирования колонки. АроА-1 элюируется. Объем элюции составляет 20 мл. Используют четыре разных Tris буферов (каждый с pH 7,8, и с проводимостями 4,3 мс/см, 5,4 мс/см, 6,7 мс/см и 59,2 мс/см, соответственно) для элюирования колонки, и элюируются примеси. Результаты процесса элюции и SDS-PAGE электрофореза показаны на фиг.2 и 3, соответственно. Х-координата на фиг.2 представляет объем элюции в процессе хроматографии, и y-координата - концентрацию протеина в элюате. Числа 1-9 показывают зоны, откуда взят образец. Образец определяли с помощью электрофореза SDS-PAGE на фиг.3. Стрелка показывает положение ароА-1 протеина.

(3) Вторая DEAE анионообменная хроматография

АроА-1, элюированный в стадии (2) (pH 7,8, проводимость 3,5 мс/см), содержащий ароА-1, мочевину и следовое количество примеси, разбавляли водой 5-кратно и загружали в DEAE колонку при скорости потока 10 мл/мин. АроА-1 и следовое количество примеси связывались в колонке, и мочевина оставалась в растворе и вытекала в качестве элюата.

Tris буфер без мочевины (pH 7,8, проводимость 11,7 мс/см) используют для элюирования колонки и элюируют примеси из колонки. Затем используют Tris буфер без мочевины (pH 7,8, проводимость 85,2 мс/см) для элюирования колонки, в результате элюируется ароА-1.

Результаты SDS-PAGE электрофореза показывают, что на данной стадии получается чистый ароА-1 (Фиг.4). Образец 1 представляет собой протеин в растворе элюата колонки в течение процесса элюции. Образец 2 представляет собой протеиновый маркер. Числа 3-5 показывают образец, собранный в течение первого процесса элюции, который содержит, главным образом, примеси. Числа 6-10 определяют образец, собранный в течение второго процесса элюции, который содержит по большей части ароА-1. Образцы 6 и 7 разбавляли 5-кратно, а образец 8-10-кратно. Стрелка показывает положение ароА-1 протеина.

ПРИМЕР 2. Очистка АроА-1

0.2 г фракции плазмы IV и оборудование являются такими же, как в примере 1.

(1) предварительная подготовка фракции плазмы крови IV

0,2 г фракции IV растворяют в 100 мл Tris буфера (pH 7,8, 4°С). Мочевину добавляют к раствору до тех пор, пока конечная концентрация не достигнет 6 моль/л, и раствор тщательно перемешивают. Раствор центрифугируют при 8000 об/мин с удалением осадка и затем фильтруют фильтром с 0,45 мкм.

(2) Первая DEAE анионообменная хроматография

Первую DEAE колонку уравновешивают Tris буфером (pH 7,8), содержащим 1 моль/л мочевины. Раствор из стадии (1) загружают в первую DEAE колонку при скорости потока 1 мл/мин. Для элюирования колонки используют Tris буфер (pH 7,8, проводимость 3,5 мс/см) с мочевиной в концентрации 1 моль/л. Элюируется АроА-1. Объем элюции составляет 20 мл. Для элюирования колонки используют Tris буфер (pH 7,8, 59,2 мс/см, соответственно), при этом элюируются примеси.

(3) Вторая DEAE анионообменная хроматография

Процедура аналогична указанной в примере 1. Результаты очистки представлены на фиг.5. Образец 1 представляет собой супернатант фракции плазмы IV после процесса предварительной подготовки. Образцы 4-8 являются ароА-1, собранным в процессе очистки. Образец 10 представляет примеси, собранные в течение процесса очистки. Стрелка показывает положение ароА-1 протеина.

ПРИМЕР 3. Очистка ароА-1

0.2 г фракции плазмы IV и оборудование являются такими же, как в Примере 1.

(1) предварительная подготовка фракции плазмы крови IV

0,2 г фракции IV растворяют в 100 мл Tris буфера (pH 7,8, 4°С). Мочевину добавляют к раствору до тех пор, пока конечная концентрация не достигнет 6 моль/л, и раствор тщательно перемешивают. Раствор центрифугируют при 8000 об/мин с удалением осадка и затем фильтруют фильтром с 0,45 мкм.

(2) Первая DEAE анионообменная хроматография

Первую DEAE колонку уравновешивают Tris буфером (pH 7,8), содержащим 8 моль/л мочевины. Раствор из стадии (1) загружают в DEAE колонку при скорости потока 1 мл/мин. Для элюирования колонки используют Tris буфер (pH 7,8, проводимость 3,5 мс/см) с 8 моль/л мочевины. АроА-1 элюируется. Объем элюции составляет 20 мл. Для элюирования колонки используют Tris буфер (pH 7,8, проводимость 59,2 мс/см) и элюируются примеси.

(3) Вторая DEAE анионообменная хроматография

Процедуры аналогичны указанным в примере 1. Результаты очистки показаны на фиг.7.

ПРИМЕР 4. Очистка ароА-1 в лабораторных условиях

Исходные материалы включают: 60 г фракция плазмы IV, две 1500 мл ионообменные колонки (от Shanghai Jinhua Chromatography Equipment Cooperaration), среда для анионообменной хроматографии, а именно DEAE Sepharose FF (от GE Healthcare), насос и ультрафиолетовый детектор (от Shanghai Jinhua Chromatography Equipment Corporation), и оборудование для определения проводимости, а именно АКТА EXPLORER 100 (от GE Healthcare).

(1) предварительная подготовка фракции плазмы крови IV

60 г фракции IV растворяют в 100 мл Tris буфера (pH 7,8, 4°С). Мочевину добавляют к раствору до тех пор, пока конечная концентрация не достигнет 6 моль/л, и раствор тщательно перемешивают, центрифугируют при 8000 об/мин с удалением осадка и затем фильтруют 0,45 мкм фильтром.

(2) Первая DEAE анионообменная хроматография

Первую DEAE колонку уравновешивают Tris буфером (pH 7,8), содержащим 6 моль/л мочевины. Раствор из стадии (1) загружают в DEAE колонку при скорости потока 10 мл/мин. Для элюирования колонки используют Tris буфер (pH 7,8, проводимость 3,7 мс/см) с 8 моль/л мочевины. АроА-1 элюируется. Объем элюции составляет 10 мл. Для элюирования колонки используют Tris буфер (pH 7,8, проводимость 80,3 мс/см) и элюируются примеси.

(3) Вторая DEAE анионообменная хроматография

АроА-1, элюированный в стадии (2) (pH 7,8, проводимость 3,7 мс/см), содержащий ароА-1, мочевину и следовое количество примеси, разбавляли водой 5-кратно и загружали в DEAE колонку при скорости потока 10 мл/мин. АроА-1 и следовое количество примеси связывались в колонке, и мочевина оставалась в растворе и вытекала в качестве элюата.

Tris буфер без мочевины (pH 7,8, проводимость 12.2 мс/см) используют для элюирования колонки и из колонки элюируются примеси. Затем используют Tris буфер без мочевины (pH 7,8, проводимость 50,4 мс/см) для элюирования колонки, в результате элюируется ароА-1.

Результаты SDS-PAGE электрофореза показаны на фиг.5. Результаты показывают, что чистый ароА-1 также может быть получен в лабораторных условиях.

ПРИМЕР 5. Определение протеина ароА-1

АроА-1 протеин, очищенный в примере 1, определяют с помощью набора для определения ароА-1, полученного от Shanghai SUN Biotech Co. LTD.

10 мкл очищенного протеина добавляют к 1 мл ароА-1 антисыворотке, и затем инкубируют при температуре 37°С в течение 15 минут. После инкубации раствор определяют посредством определения абсорбции при длине волны 505 нм. Результаты показывают, что этим протеином является ароА-1.

ПРИМЕР 6. Определение протеина ароА-1

Используя способ, описанный в примере 5, ароА-1 протеины из примеров 2 и 3, соответственно, и ароА-1 протеин из примера 4 определяют с помощью набора для определения ароА-1 от Shanghai SUN Biotech Co. LTD.

Получены аналогичные результаты.

Для специалистов ясно и очевидно, что варианты и воплощения, проиллюстрированные и описанные здесь, могут выполняться, не выходя за сущность и объем настоящего изобретения. Соответственно, необходимо понимать, что вышеприведенное описание является только иллюстративным, и истинные сущность и объем изобретения будут определяться представленной далее формулой изобретения.

Способ очистки аполипопротеина А-1 включает смешивание фракции плазмы IV, полученной по способу низкотемпературного фракционирования этанолом с 1-8 М раствором мочевины для формирования подготовительного раствора фракции IV; загрузку подготовительного раствора в первую колонку для анионной хроматографии и последующее элюирование с 1-8 М раствором мочевины с получением раствора ароА-1 протеина; и загрузку раствора ароА-1 протеина во вторую колонку для анионной хроматографии и элюирование с 0-1 М раствором мочевины с получением чистого ароА-1 протеина. 25 з.п. ф-лы, 7 ил., 6 пр.

1. Способ очистки аполипопротеина А-1, включающий стадии:
a) смешивание фракции плазмы IV с раствором 1-8 М мочевины, формируя подготовительный раствор фракции IV;
b) загрузка подготовительного раствора, полученного на стадии а), в первую колонку для анионообменной хроматографии, и последующее элюирование с буфером I, содержащим 1-8 М мочевину, имеющим проводимость 1-4 мс/см, с получением элюента I, который главным образом содержит ароА-1 протеин;
c) загрузка элюента I во вторую колонку для анионной хроматографии, сначала элюирование буфером II, имеющим проводимость 1-15 мс/см, и затем элюирование буфером III, имеющим проводимость 30-100 мс/см, с получением чистого ароА-1 протеина.

2. Способ по п.1, в котором фракцию плазмы IV получают с помощью способа низкотемпературного фракционирования этанолом.

3. Способ по п.1, в котором буфер II включает 0-1 М мочевину.

4. Способ по п.1, в котором буфер III включает 0-1 М мочевину.

5. Способ по п.1, в котором концентрация мочевины в стадии а) и b) составляет 3-8 М.

6. Способ по п.1, в котором концентрация мочевины в стадии а) и b) составляет 5-7 М.

7. Способ по п.1, в котором проводимость буфера I составляет 2-4 мс/см, проводимость буфера II составляет 7-15 мс/см и проводимость буфера III составляет 70-95 мс/см.

8. Способ по п.1, в котором проводимость буфера I составляет 2,5-3,6 мс/см, проводимость буфера II составляет 9-12 мс/см, проводимость буфера III составляет 80-90 мс/см.

9. Способ по п.1, в котором каждая колонка для анионообменной хроматографии является одной из 1) высокоэффективной колонкой для ионообменной хроматографии и 2) низкоэффективной колонкой для ионообменной хроматографии.

10. Способ по п.1, в котором каждая колонка для анионообменной хроматографии является одной из 1) колонкой для QAE ионного обмена и 2) колонкой для DEAE ионного обмена.

11. Способ по п.1, в котором массовое соотношение фракции IV в стадии а) и мочевины составляет 1:30-300.

12. Способ по п.1, в котором массовое соотношение фракции IV в стадии а) и мочевины составляет 1:90-240.

13. Способ по п.1, в котором массовое соотношение фракции IV в стадии а) и мочевины составляет 1:150-210.

14. Способ по п.1, в котором буферы I, II, III стадий b) и с) содержат, по меньшей мере, одну соль, выбранную из группы, включающей NaCl, KCl, MgCl₂ и CaCl₂.

15. Способ по п.1, в котором буферы элюирования I, II, III стадий b) и с) содержат NaCl.

16. Способ по п.1, в.котором между стадиями а) и b) центрифугируют подготовительный раствор фракции IV с удалением осадков и затем фильтруют.

17. Способ по п.16, котором подготовительный раствор фракции IV центрифугируют при скорости 6000-10000 об/мин и фильтруют с помощью мембраны, имеющей размер пор 0,2-0,6 мкм.

18. Способ по п.1, в котором между стадиями а) и b) наибольшее количество примесей илюируют с помощью буфера IV, имеющего проводимость 4,5-70 мс/см.

19. Способ по п.18, в котором буфер IV содержит 0-1 М мочевину.

20. Способ по п.18, в котором буфер IV содержит, по меньшей мере, одну соль, выбранную из группы, включающей NaCl, KCl, MgCl₂ и CaCl₂.

21. Способ по п.18, в котором буфер IV содержит NaCl.

22. Способ по п.1, в котором рН буферов I, II и III составляет 7,2-8,5.

23. Способ по п.1, в котором буферы I, II и III содержат Tris буфер.

24. Способ по п.1, в котором рН буферов I, II и III составляет 7,5-8.

25. Способ по п.1, в котором рН буферов I, II и III составляет 7,8.

26. Способ по п.1, дополнительно содержащий после стадии с), по меньшей мере, одну ультрафильтрацию чистого ароА-1 протеин, добавление стабилизатора к чистому ароА-1 протеину и лиофилизацию чистого ароА-1 протеина.