СПОСОБ ХРОМАТОГРАФИЧЕСКОГО ВЫДЕЛЕНИЯ И ОЧИСТКИ БЕЛКОВ, ПЕПТИДОВ И ИХ КОМПЛЕКСОВ Российский патент 1998 года по МПК C07K14/62 B01D15/08 

Изобретение относится к области хроматографического разделения биополимеров и может быть использовано, в частности, для хроматографического выделения и очистки инсулина человека.

В настоящее время одной из важных задач является проблема создания эффективного и безопасного способа получения инсулина человека. Стратегия решения этой проблемы во многом определяется аминокислотной последовательностью препроинсулина. Самый простой путь - ничего не изменяя, воспользоваться естественной первичной структурой препроинсулина. Недостатком такого подхода является неизбежность применения токсичного соединения (бромциана) для получения проинсулина. Другой путь - создание искусственного линкера между лидерной последовательностью и проинсулином, который можно легко "разрезать", например, трипсином. Такой подход позволяет отказаться от бромцианового гидролиза и сократить технологическую цепочку получения конечного продукта. Известен, например, способ гидролиза аминокислотной последовательности предшественника инсулина человека, включающий обработку клострипаином из Clostridium histolyticum в присутствии ионов кальция и сульфгидрильного реагента при pH 6-9 и обработку Arg- производного инсулина карбоксипептидазой B (RU, 2062301, 1996).

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату является хроматографический способ выделения и очистки инсулина человека, включающий дезинтеграцию клеток, содержащих гибридный белок, сульфитолиз, выделение твердой фазы центрифугированием, растворение в буферном растворе при pH 7,5, диализ на мембране, ренатурацию в присутствии 2-меркаптоэтанола, концентрирование белка, очистку с помощью аффинной хроматографии, лиофилизацию, растворение с помощью гуанидинхлорида, очистку на сефадексе G-75, ферментативное расщепление трипсином и карбоксипептидазой B, аффинную хроматографию гидролизата и лиофилизацию (P.Jonasson, Eur.J.Biochem. 236, 656-661, 1996). Авторы данной работы модифицировали процедуру выделения и очистки конечного продукта так, чтобы наряду с инсулином было возможным выделять пептид C, который имеет, по их мнению, выраженную биологическую активность.

Недостатком известного способа является его сложность и дороговизна.

Задачей настоящего изобретения является разработка простого экономичного способа выделения инсулина человека из препроинсулина, в котором вместо природного метионина между лидерной последовательностью и проинсулином находится аргинин.

Поставленная задача решается описываемым способом хроматографического выделения и очистки инсулина, включающим дезинтеграцию клеток, содержащих гибридный белок, сульфитолиз, выделение твердой фазы путем сублимации, растворение в буферном растворе с pH 7,5, очистку путем анионообменной хроматографии, предпочтительно, на колонке с DEAE-Toyperl, уравновешенной трисбуфером pH 7,5 путем элюции хлористым натрием, обессоливание, ренатурацию, концентрирование белка ультрафильтрацией, повторную анионообменную хроматографию, концентрирование, ферментативное расщепление трипсином и карбоксипептидазой B, катионообменную хроматографию гидролизата, предпочтительно на колонке с S-сефарозой, уравновешенной буфером с pH 4,0, при элюировании хлористым натрием, ультрафильтрацию и гель-фильтрацию.

Замена дорогостоящей стадии аффинной хроматографии, с помощью которой проводят разделение в прототипе на анионообменную и катионообменную, позволяет сделать процесс более технологичным и простым. Когда гибридный (рекомбинантный) белок подвергают сульфитолизу, образуется белок -S-сульфонат. Этот этап позволяет солюбилизировать и стабилизировать белок, эффективно проводить его выделение и очистку с помощью анионообменной хроматографии за счет появления 6 отрицательно заряженных групп S-SO₃.

Рекомбинантный белок-S-сульфонат подвергают обессоливанию на колонке с сефадексом D-25. Ренатурацию, как и в прототипе, проводят в разбавленном растворе с помощью 2-меркаптоэтанола.

Очищенный путем ультрафильтрации и анионообменной хроматографии ренатурированный рекомбинантный белок, так же как и в прототипе, подвергают трипсинолизу. Поскольку основными продуктами трипсинолиза являются ди-Arg-инсулин и Arg-инсулин, дальнейшее превращение их в инсулин проводят с использованием карбоксипептидазы B. Таким образом, ренатурированный рекомбинантный белок может непосредственно превращаться в инсулин, минуя стадию получения проинсулина. Именно это позволяет исключить в технологической схеме стадию расщепления рекомбинантного белка бромцианом, которая необходима для получения проинсулина из нативного препроинсулина. Исключение из технологической схемы стадии, связанной с бромцианом, не только уменьшает себестоимость конечного продукта за счет непосредственного сокращения числа стадий, но и значительно снижает вредность для окружающей среды при постановке данного производства. Кроме того замена химического расщепления рекомбинантного белка на ферментативное является очень выгодной, так как обеспечивает более высокий выход и качество конечного продукта.

После ферментативной обработки ренатурированного рекомбинантного белка трипсином и карбоксипептидазой B, выделение и очистку инсулина предложено проводить с использованием катионообменной хроматографии.

Фракции с высоким содержанием инсулина объединяют и концентрируют на ультрафильтрационной установке.

Заключительную очистку инсулина проводили с помощью гель-фильтрации. Фракции с инсулином лиофилизовали.

Вышеописанная последовательность стадий позволяет эффективно выделить чистый инсулин.

Биологическая активность полученного инсулина составила 29 Ед/мг. Молекулярную массу полученного инсулина контролировали с помощью масс-спектрометрии. N-концевую последовательность (9 шагов) полученной субстанции определяли с помощью метода Сэнгера. Анализ аминокислотных последовательностей показал наличие только двух полипептидных цепей, принадлежащих инсулину.

Изобретение иллюстрируется нижеследующим примером.

Для получения штамма-продуцента проводят трансформацию штамма E.coli XL1-BLue, используя плазмиду pInsR. Отобранные клетки, несущие плазмиду InsR, являются продуцентом препроинсулина.

После подготовки ферментера к работе проводят его заполнение стерильной питательной средой следующего состава: казеин-пептон-20 г/л, дрожжевой автолизат - 14 г/л, калий фосфорнокислый двузамещенный безводный - 6 г/л, натрий хлористый - 5 г/л, магний сернокислый семиводный - 0,5 г/л, глюкоза - 10 г/л. В среде культивирования штамма-продуцента поддерживается pH в пределах 6,7 единиц, подачей водного раствора аммиака с массовой долей 12,5%. Растворенный кислород по мере потребления поддерживают на уровне 35%, изменяя скорость перемешивания. При вспенивании подают стерильную водную эмульсию пеногасителя AC-60.

Процесс проводят в течение 3-4 часов, при этом достигают величины оптической плотности не менее 10. Количество биомассы оценивается как 20 г/л культурной жидкости. Содержание гибридного белка составляет 30-35% от общего белка клетки.

Сбор клеток, содержащих гибридный белок, проводят путем центрифугирования при 4000 об/мин, затем суспензию клеток охлаждают до 4^oC и дезинтегрируют.

На следующем этапе полученную суспензию растворяют в буферном растворе (pH 9,0), содержащем 0,02 M углекислый аммоний и 7,5 M мочевину. Затем к раствору добавляют тетратионат и сульфит натрия. Реакционная смесь перемешивается в течение 12 часов при температуре 20^oC.

После сульфитолиза раствор подают на сублимацию, разливая в лотки и замораживая до -70^oC. Сушку ведут в вакууме (остаточное давление в камере 0,202 мбар).

Полученный сухой порошок растворяют в 30 мМ трис-буфере pH 7,5 и раствор белка перистальтическим насосом наносят на колонку с DEAE-Toyperl, предварительно уравновешенную тем же буфером. После нанесения пробы колонку промывают этим же буфером. На следующем этапе рекомбинантный белок элюируют хлористым натрием (линейный градиент от 0 до 1M, скорость элюции 0,06 л/час). Фракции собирают под контролем проточного детектора при длине волны 280 нм. Состав фракций анализируется методом нативного электрофореза в полиакриламидном геле и ионообменной высокоэффективной жидкостной хроматографии на колонке с DEAE TSK5PW.

На следующем этапе белок обессоливают на колонке с сефадексом G-25, уравновешенной 50 мМ раствором глицина pH 10,5.

Далее проводят ренатурацию белка-S-сульфоната с помощью 2-меркаптоэтанола при постоянном перемешивании на холоде (4^oC). Степень ренатурации рекомбинантного белка по данным высокоэффективной жидкостной хроматографии составляет около 51%.

На следующем этапе белок концентрируют на ультрафильтрационной установке и повторно подвергают анионообменной хроматографии. Раствор наносят на колонку с DEAE-Toypearl, уравновешенную 30 мМ трис-буфером pH 7,5. После нанесения образца колонку промывают тем же буфером. Рекомбинатный белок элюируют с колонки, используя линейный градиент хлористого натрия (от 0 до 0,5 M). Контроль за степенью очистки осуществляется с помощью обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии на колонке с m-Bondapak C₁₈. Выход ренатурированного рекомбинатного белка составляет 25%, чистота препарата 80%.

После этого белок концентрируют на фильтрационной установке и подвергают ферментативному расщеплению с использованием карбоксипептидазы B и трипсина. Процесс проводят при 37^oC и по окончании инкубации смесь подкисляют до pH 4,0, добавляя ледяную уксусную кислоту. Степень расщепления рекомбинантного белка составляет 92%.

Далее гидролизат подвергают катионообменной хроматографии. Раствор ферментативного гидролизата ренатурированного рекомбинатного белка наносят на колонку с S-сефарозой, уравновешенную буферным раствором pH 4,0, содержащим 50 мМ уксуснокислый натрий и 6 М мочевину. После нанесения образца колонку промывают тем же буфером. Элюцию инсулина проводят линейным градиентом хлористого натрия (от 0 до 0,5 M). Контроль за содержанием инсулина проводили методом обращенно - фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии. Фракции с высоким содержанием инсулина объединяли и концентрировали. Выход на стадии около 44%, степень очистки белка не менее 94%.

Далее инсулин концентрируют на ультрафильтрационной установке. Выход стадии 95%.

На следующем этапе проводят гель-фильтрацию раствора инсулина на колонке с сефадексом G-50 SE. Фракции, содержащие конечный препарат, объединяют и лиофилизуют. Выход стадии около 91%, степень очистки инсулина более 96%.

Представленный пример подтверждает решение поставленной задачи - выделить инсулин человека с использованием простой и надежной ионообменной технологии.

Использование: при хроматографическом выделении инсулина. Сущность: человеческий инсулин, полученный из препроинсулина, в котором вместо природного метионина между лидерной последовательностью и проинсулином находится аргинин, выделяют и очищают с помощью ионообменной хроматографии. Способ позволяет осуществить выделение инсулина без использования токсичных реагентов по простой технологии с высоким выходом и высокой степенью очистки. 3 з.п. ф-лы.

1. Способ хроматографического выделения и очистки инсулина человека, включающий дезинтеграцию клеток, содержащих гибридный белок, сульфитолиз, выделение твердой фазы, растворение в буферном растворе pH 7,5, ренатурацию белка, его концентрирование, ферментативное расщепление трипсином и карбоксипептидазой В, хроматографию гидролизата, отличающийся тем, что после сульфитолиза твердую фазу выделяют сублимацией, дальнейшую очистку проводят путем анионообменной хроматографии с последующим обессоливанием, после ренатурации концентрирование белка ведут ультрафильтрацией и подвергают повторной ионообменной хроматографии и концентрированию, а после ферментативного расщепления проводят катионообменную хроматографию гидролизата, ультрафильтрацию и гель-фильтрацию. 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что анионообменную хроматографию проводят на колонке с DEAE-Toyperl, уравновешенной трис-буфером с pH 7,5, элюция проводится хлористым натрием. 3. Способ по п.1, отличающийся тем, что катионообменную хроматографию проводят на колонке с S-сефарозой, уравновешенной буфером с pH 4,0, элюция проводится хлористым натрием. 4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что гель-фильтрацию проводят на колонке с сефадексом G-50SF.