Способ делипидирования лиофилизированных липопротеинов высокой плотности из сыворотки крови человека Советский патент 1992 года по МПК C07K15/16 

Изобретение относится к биологической химии, а именно к способам получения препаративных количеств аполипопротеинов, входящих в состав липопротеинов сыворотки крови человека.

Известен способ делипидирования лиофилизированных липопротеинов, заключающийся в том. что 20-50 мг лиофилизированных липопротеинов экстрагируют при -20°С в течение 30 мин 3 х 35 мл смеси этиловый спирт- диэтиловый эфир (1:1 по объему), отделяя после каждой экстракции осадок белков липопротеинов от недостаточной жидкости с помощью центрифугирования при 2000 об/мин в течение 30 мин при 4°С. Затем к осадку добавляют 35 мл диэтилового эфира, выдерживают 3 мин при -20°С, центрифугируют при 2000 об/мин в течение 30 мин при 4°С, после чего надосадочную жидкость сливают, а осадок бысушивают в струе азота.

Однако такой способ делипидирования лиофилизированных липопротеинов малоПроизводителен, многостадиен и очень трудоемок.

Наиболее близким к предлагаемому является способ делипидирования лиофилизированных липопротеинов высокой плотности из сыворотки крови человека, который включает стадии экстракции в центрифужной пробирке объемом 50 мл лиофилизированных липопротеинов высокой плотности смесью хлороформ-метиловый спирт (1:2 по объему), из расчета 50 мл смеси на 200 мг белка в течение 30 мин при - 10°С и перемешивании один раз в 10 мин путем переворачивания пробирки; центрифугирования полученной смеси при 2000 об/мин в течение 10 мин при 6°С и декантации надосадочной жидкости Указанные операции повторяют шесть раз, затем экстрагируют осадок в той же пробирке диэти- ловым эфиром из расчета 50 мл смеси на 200 мг белка в течение 30 мин при -10°С и перемешивании один раз в 10 мин путем перево-ч ел

ю

со

X

СА

рачивания пробирки, центрифугируют полученную смесь при 2000 об/мин в течение 10 мин при 6°С, декантируют надосадочную жидкость, повторяют эти операции еще раз и высушивают осадок на воздухе.

К недостаткам известного способа относятся большие затраты времени и ручного труда при получении препаративных количеств делипидированыых липопротеи- нов высокой плотности, длительное использование центрифуги с встроенным холодильным агрегатом Для центрифугирования при пониженной температуре, необходимость постоянного участия человека при проведении делипидирования в течение длительного времени.

Целью изобретения являются упрощение и ускорение способа делипидирования лиофилизированных липопротеинов высокой плотности из сыворотки крови человека.

Поставленная цель достигается тем, что о предлагаемом способе делипидирования лиофилизированных липопротеинов высокой Плотности из сыворотки крови человека стадии многократных экстракций смесью хлороформ-метиловый спирт и последующей промывки осадка аполипопротеинов диэтиловым эфиром объединены в одну стадию без предварительного отделения осадка аполилопротеинов от смеси хлороформ-метиловый спирт, а также использованием метода механической фильтрации при пониженном давлении для определения конечного продукта (тонкодисперсного осадка аполипопротеинов) от смеси органических растворителей,

Новым в предлагаемом способе делипидирования лиофилизированных липопро- теинов высокой плотности является отделение тонкодисперсного осадка аполипопротеинов от смеси органических растворителей методом механической фильтрации при пониженном давлении и объединение стадий экстракции и промывки осадка аполипопротеинов без предварительного отделения осадка аполипопротеинов от смеси хлороформ-метиловый спирт

Пример. Липопротеины высокой плотности (1,063-1,210 г/см3) выделяют из сыворотки крови человека методом последовательного ультрацентрифугирования. Полученную фракцию липопротеинов высокой плотности в виде прозрачной жидкости светло-желтого цвета переносят в диализный мешок, диализуют против 9 л 10 мМ раствора двууглекислого аммония в течение 15ч при 4°С, после чего раствор липопротеинов высокой плотности переносят в круг- лодонную колбу, замораживают при вращении колбы в охлаждающей смеси (сухой лед - ацетон или жидкий азот) и лиофи- лизируют в течение 15 ч.

Полученные лиофилизированные ли- попротеины высокой плотности (2 г) в виде

сухой пушистой массы светло-желтого цвета помещают в круглодонную колбу, добавляют 200 мл охлажденной до 0°С смеси хлороформ-метиловый спирт (3:1 по объему) и интенсивно перемешивают магнитной мешалкой при 0°С (ледяная баня) в течение 30 мин, после чего полученную смесь в виде тонкой суспензии светло-желтого цвета смешивают с 800 мл охлажденного до 0°С диэтилового эфира и интенсивно перемешивают образовавшуюся смесь магнитной мешалкой при 0°С в течение 30 мин. Полученную смесь в виде тонкой суспензии светло-желтого цвета фильтруют с использованием стеклянной воронки с пористым

фильтром № 3 при пониженном давлении (вакуум водоструйного насоса). Остаток аполипопротеинов в виде порошка белого цвета высушивают при пониженном давлении (вакуум водоструйного насоса), плотно закрыв стеклянную воронку пластиной из мягкой резины.

Для определения содержания белка до делипидирования навеску лиофилизированных липопротеинов высокой плотности

(10 мг) растворяют в 1 мл калийфосфатного буфера (10 мМ КН2РСЦ, рН 7,4), содержащего 0,9% хлористого натрия NaCI. Полученный раствор анализируют на содержание белка по методу Лоури. Концентрация суммарного белка в пробе 4,6 мг/мл раствора, что в пересчете на исходные 2 г лиофилизированных липопротеинов высокой плотности составляет 0,92 г суммарного белка (46% по весу).

Для анализа аполипопротеинов, полученных после делипидирования предлагаемым способом, остаток аполипопротеинов, полученный после делипидирования 2 г лиофилизированных липопротеинов высокой

плотности, взвешивают Вес остатка 0,90 г.

Навеску остатка (10 мг) растворяют в 1 мл калийфосфатного буфера (10 мМ КН2Р04, рН 7,4), содержащего 0,9% NaCI, и полученный раствор анализируют на содержание

белка, как указано. Концентрация суммарного белка в пробе 9,9 мг/мл раствора что в пересчете на исходные ,9 г остатка апи-.ип- ротеинов составляет 0,891 г суммарного белка (99% по весу). Степень извлечения

аполипротеинов при делипидировании предлагаемым способом 97%. Полученная величина представляет собой отношение 0,891 г (содержание суммарного белка в сухом остатке аполипротеинов после делипидирования) к 0,92 г(содержание суммарного

белкавлиофилизированных липопротеинах высокой плотности до делипидирования).

Количество небелковых примесей в сухом остатке аполипротеинов не превышает 1%.

Предлагаемый способ делипидирования лиофилизированных липопротеинов высокой плотности из сыворотки крови человека был неоднократно и успешно использован при выделении аполипоп- ротеинов A-I и А-П высокой стегтени чистоты из липопротеинов высокой плотности. Выделенные препараты белков А- и А-И былйГуспешно использованы в различных диагностических и иммунологических исследованиях.

В предлагаемом способе делипидирования липопротеинов из сыворотки крови человека по сравнению с ранее известными сведено к минимуму количество ручного труда, полностью исключено центрифугирование при пониженной температуре, сокращены объем используемых органических

растворителей и общее время, затрачиваемое на делипидирование (приблизительно в 8-20 раз)

Формула изобретения

Способ делипидирования лиофилизированных лмпопротеинов высокой плотности из сыворотки крови человека, включающий первичную экстракцию липи- дов смесью хлороформ-метиловый спирт

при пониженной температуре и реэкстрак- цию полученной смеси диэтиловым эфиром, отличающийся тем, что, с целью упрощения и ускорения способа, для первичной экстракции используют смесь хлороформ-метиловый спирт с содержанием метилового спирта 25-60 об.% в количестве 100-300 мл на 1-3 г лиофилизированных липопротеинов, для реэкстракции - двух- шестикратный объем диэтилового эфира,

экстракции проводят при перемешивании в течение 15-45 мин при (-10)-40С. затем отфильтровывают осадок и высушивают целевой продукт в вакууме.

Использование: для получения препаративных количеств аполипопротеинов, входящих в состав липопротеинов сыворотки крови человека. Сущность изобретения: к 2 г лиофилизированных липопротеинов высокой плотности добавляют 200 мл охлажденной до °С смеси хлороформ-метиловый спирт (3:1 и перемешивают 30 мин. Полученную суспензию смешивают с 800 мл охлажденного до 0°С диэти- лового эфира, перемешивают 30 мин при 0°С, фильтруют и осадок на фильтре высушивают при пониженном давлении. 1 пр.