СПОСОБ ОЦЕНКИ ВЛИЯНИЯ АКТИВНОСТИ АРГИНИНДЕГИДРОГЕНАЗЫ НА УРОВЕНЬ ГИСТАМИНА В КРОВИ БЕРЕМЕННЫХ, ПЕРЕНЕСШИХ В ТРЕТЬЕМ ТРИМЕСТРЕ ГЕСТАЦИИ ОБОСТРЕНИЕ ГЕРПЕС-ВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ С ТИТРОМ АНТИТЕЛ ГЕРПЕСА 1:12800 Российский патент 2012 года по МПК G01N33/53 

Цель исследования - показать нарастание уровня гистамина в периферической крови беременной, вызванное повышением активности аргининдегидрогеназы в синцитиотрофобласте ворсинок плаценты при обострении в третьем триместре герпес-вирусной инфекции.

Аргининдегидрогеназа инициирует отделение от гепарин-аргининового комплекса большого количества гистамина. Гистамин в организме человека образуется во многих органах из гистидина под влиянием гистидиндекарбоксилазы. Это экзогенный гистамин. Однако большая часть гистамина синтезируется в клетках организма путем декарбоксилирования гистидина тканевой гистидиндекарбоксилазой. Почти все органы человека содержат гистамин. Гистамин в тканях находится в неактивном состоянии в виде лабильных комплексов с белками, гепарином и сернокислыми полисахаридами. В таком случае в клетке образуется белково-гепариновый комплекс, в котором гепарин и белок, в основном аргинин, образуют прочную основу [1, 2, 4, 5]. Гистамин через аргинин связан в этом комплексе не достаточно прочно [7]. Таким образом, схема построения связи с белково-полисахаридным комплексом можно представить следующим образом: основа этого комплекса состоит из белково-гепариновой структуры, в которой гепарин и белок связаны между собой ионными связями (в силу взаимодействия аминогрупп аргинина с карбоксильными и сульфатными группами гепарина). С этим комплексом через аргинин и взаимодействует гистамин (фигура 1). При воздействии различных физиологических стимулов через ферментативные системы (аргининдегидрагеназа) связь гистамина с аргинином разрывается, и гистамин легко освобождается в клетке.

Прототипом предложенного метода авторы взяли исследования В.В.Виноградова и Н.Ф.Воробьевой [1], которые полагают, что в тучных клетках, богатых гистамином, он тесно связан с белковой основой, состоящей из тесно взаимодействующих аминогрупп аргинина с карбоксильными и сульфатными группами гепарина. Гистамин в этом комплексе легко удаляется при токсическом воздействии на структуру.

В приведенном прототипе не указан характер токсического влияния вирусов на прочность связи гистамина при активизации аргининдегидрогеназы. Не были разработаны гистохимические методы, позволяющие определять активность аргининдегидрогеназы. Не применялись компьютерные цитофото-метрические методы оценки активности аргининдегидрогеназы.

Наши исследования принципиально отличаются от гипотетических данных, приведенных в ранее опубликованных работах:

1. Объектом исследования является синцитиотрофобласт ворсинок плаценты.

2. Разработана методика выявления гистохимическим методом аргининдегидрогеназы.

3. Предложен новый компьютерный цитофотометрический метод оценки аргининдегидрогеназы.

4. Одновременно изучается как активность аргининдегидрогеназы, так и уровень нарастания гистамина в крови беременной, что может становиться отрицательным фактором, действующим на фетоплацентарную систему.

В литературе нет описания, отражающего влияние токсических продуктов вирусной инфекции (в частности герпес-вирусной) на процесс инициации активности аргининдегидрогеназы, приводящей к повышенному освобождению гистамина в цитозоль клеток и в частности в синцитиотрофобласт ворсинок плаценты.

Заявленный способ имеет следующие приемы:

1. Исследовали синцитиотрофобласт ворсинок плаценты 25 беременных, перенесших в третьем триместре гестации обострение герпес- вирусной инфекции на предмет выявления гистохимическим методом активность аргининдегидрогеназы. Контролем служила плацента от 10 беременных, не болевших на протяжении всего периода гестации. Реакция выполнялась по следующему плану:

а) 0,1 М фосфатный буфер рН 7,6;

б) L-аргинин "Союз реактив" 25 мг/мл фосфатного буфера;

в) Нитросиний тетразолий (фирма "ICN") 1 мг/мл фосфатного буфера (5 мМоль);

г) НАДФ (фирма "Serva") 1 мг/мл фосфатного буфера (5 мМоль).

2. Инкубация проводилась при 37°С в течение 30 мин.

3. Срезы споласкивались в дистиллированной воде и заключались в глицерин-желатину.

4. Контрольные срезы инкубировались в среде, содержащей вместо аргинина L буферный фосфатный раствор рН 7,6.

Прототипом подобного типа реакций на выявление дегидрогеназ авторами использована рекомендация, предложенная Лойда З. (1962) [6].

5. После изготовления срезы просматривались под электрофотомикроскопом "Opton" (Германия), а участки срезов как контрольных, так и опытных препаратов фотографировались на одну пленку "Kodak color" (USA). После проявки пленки сфотографированные участки вносились в компьютер и цитофотометрировались на установке "Mekos" (Цитофотометрическая установка. Регистрационное удостоверение МЗ РФ 29/10010198/1282-01, изделие не подлежит обязательной сертификации. Руководство по эксплуатации 275437869443001 РЭ).

6. Цитофотометрирование производилось при одном и том же зонде - 0,1 × 0,1 мм. В расчет было взято по 100 участков в каждом случае.

7. Титр антител к вирусу герпеса определяли иммуноферментным методом на спектрофотометре «Stat-Fax-2100» (USA).

8. Гистамин определялся по Л.Я.Прошиной на флюориметре "Hitachi" Япония [3].

Исследования проводились на базе стационара акушерского отделения, клиники Дальневосточного научного центра физиологии и патологии дыхания СО РАМН учреждения Российской академии медицинских наук. Все исследования были проведены с учетом требований Хельсинской декларации Всемирной ассоциации «Этические принципы проведения научных медицинских исследований с участием человека» с поправками 2000 г.и «Правилами клинической практики в Российской Федерации», утвержденными Приказом Минздрава РФ от 19.06.2003 г. №266.

Исследования показали, что при обострении герпес-вирусной инфекции в третьем триместре гестации в синцитиотрофобласте ворсинок плаценты при титре антител к вирусу герпеса 1:12800 резко возрастает реакция на аргининдегидрогеназу 48,7±2,9 усл.ед. (контроль - 15,2±1,8 усл. ед.; р<0,001) (фигура 2, 3). При этом в периферической крови беременной резко возрастает содержание гистамина до 1,44±0,09 мкмоль/л (контроль - 0,612±0,01 мкмоль/л; р<0,001).

Таким образом, обострение герпес-вирусной инфекции в третьем триместре гестации приводит к активизации в синцитиотрофобласте аргининдегидрогеназы, что, в свою очередь, приводит к увеличению в организме беременной гистамина, избыточное количество которого отрицательно влияет на метаболизм в синцитиотрофобласте и отрицательно действует на фетоплацентарное состояние беременной.

Литература

1. Виноградов В.В., Воробьева Н.Ф. Тучные клетки. - Новосибирск: Наука, 1973. - 126 с.

2. Луценко М.Т., Коненков В.И., Пирогов А.Б. Механизмы этиопатогенеза бронхиальной астмы. - Новосибирск-Благовещенск, 2002. - 239 с.

3. Прошина Л.Я. Исследование гистамина и серотонина в одной пробе крови. - Лаборат. дело, 1981. - №2. - С.90-93.

4. Alorg С.Н., Novothny J., Uvans В. Jonig binding of histamine in mast cellgranules. - Acta Physiol. Scand, - 1967. - vol.69. - p.276-283.

5. Alorg С.Н., Bergendorf A., Uvans B. Site of fonic binding of sodium and histamine in mast cell granules. - Brit. J. Pharmacol. - 1968. - vol.34. - p.195-196.

6. Лойда З., Госсрау Р., Шиблер Т. Гистохимия ферментов. Лабораторные методы. - М.: Мир, 1962. - 270 с.

7. Snellman О., Sylven В. Analysis of the nature herarin-lipoprotein obtained from extracts of tissue mast cell. Biochem. Biophys. Acta. - 1951. - vol.7. - p.98-109.

Изобретение относится к области медицины и описывает способ оценки влияния активности аргининдегидрогеназы на уровень гистамина в крови беременных, перенесших в третьем триместре гестации обострение герпес-вирусной инфекции с титром антител герпеса 1:12800, где исследуют синцитиотрофобласт ворсинок плаценты с помощью гистохимической реакции, участки срезов фотографируют, вносят в компьютер и цитофотометрируют, и при нарастании активности аргининдегидрогеназы до 48,7±2,9 усл. ед. определяют нарастание содержания гистамина в периферической крови беременной до 1,44±0,09 мкмоль/л, что ухудшает фетоплацентарную недостаточность беременных. Данный способ позволяет оценить влияние активности аргининдегидрогеназы на уровень гистамина в крови беременных, перенесших в третьем триместре гестации обострение герпес-вирусной инфекции. 3 ил., 1 пр.

Способ оценки влияния активности аргининдегидрогеназы на уровень гистамина в крови беременных, перенесших в третьем триместре гестации обострение герпес-вирусной инфекции с титром антител герпеса 1:12800, характеризующийся тем, что исследуют синцитиотрофобласт ворсинок плаценты с помощью гистохимической реакции, участки срезов фотографируют, вносят в компьютер и цитофотометрируют и при нарастании активности аргининдегидрогеназы до 48,7±2,9 усл.ед. определяют нарастание содержания гистамина в периферической крови беременной до 1,44±0,09 мкмоль/л, что ухудшает фетоплацентарную недостаточность беременных.