СПОСОБ ОЦЕНКИ ВЛИЯНИЯ АНТИТЕЛ IgG И IgM К ФОСФАТИДИЛСЕРИНУ В ПЛАЦЕНТЕ БЕРЕМЕННЫХ НА РАЗВИТИЕ АПОПТОЗА В СИНЦИТИОТРОФОБЛАСТЕ ВОРСИНОК ПЛАЦЕНТЫ ПРИ ОБОСТРЕНИИ ВО ВРЕМЯ БЕРЕМЕННОСТИ ГЕРПЕС-ВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ Российский патент 2010 года по МПК A61B10/00 G01N33/53 

Цель исследования показать изменения содержания антител к фосфатидилсерину классов IgG и IgM в плаценте рожениц, перенесших в третьем триместре вспышку герпес-вирусной инфекции, сопровождающиеся увеличением числа ядер синцитиотрофобласта ворсинок плаценты, вступающих в апоптоз.

Клетку можно послать в апоптоз повреждающими факторами (продуктами перекисного окисления липидов, TNF α), действующими факторами извне. В этом случае важную роль играет фосфолипид фосфатидилсерин внешней поверхности мембраны. Транспортная АТФ-аза переносит фосфатидилсерин из наружного слоя плазматической мембраны во внутренний (Владимиров Ю.А., 1991; Князькин И.В., 2007; Скулачев В.П., 1999; 2001; Alareon-Segovia D., 1987).

В существующей литературе нет ссылок, указывающих на изменение содержания антител IgG и IgM к серину в плаценте при обострении во время беременности герпес-вирусной инфекции, приводящее к нарастанию ядер в синцитиотрофобласте ворсинок плаценты в состоянии апоптоза.

Заявленный способ имеет следующие приемы:

Исследовали гомогенат плаценты у 20 беременных, перенесших в третьем триместре вспышку герпес-вирусной инфекции, и 20 беременных, не болевших в течение всего периода гестации (контроль). Исследования проводились на базе стационара акушерского отделения клиники Дальневосточного научного центра физиологии и патологии дыхания СО РАМН. Все исследования были проведены с учетом требований Хельсинской декларации Всемирной ассоциации «Этические принципы проведения научных медицинских исследований с учетом человека» с поправками 2000 г. и «Правилами клинической практики в Российской Федерации», утвержденными Приказом Минздрава РФ от 19.06.2003 г. №266.

Морфологическая детекция апоптоза проводилась на парафиновых срезах плаценты по метке концов фрагментов ДНК in situ (ISEL - метод) [3]. Срезы после дегидратации в дистиллированной воде в течение 30 мин инкубируют в 3% растворе перекиси водорода и отмывают 0,15 M забуференным солевым раствором (PBS) (0,15 M NaCl на 0,1 М фосфатном буфере pH 7,5). Затем срезы инкубируют в смеси 0,3 М NaCl и 30 мМ цитрата натрия (pH 7,0; 80°C, 20 мин) и отмывают в 0,15 М PBS. После чего срезы инкубируют в растворе проназы при комнатной температуре в течение 30 мин (Calbiochem; 1 мг/мл на 0,15 M PBS). Отмывают в 0,15 М PBS и буфером A (50 мМ трис-гидрохлорид, 5 мМ хлорид магния, 10 мМ β-меркаптоэтанол и 0,005% раствор бычьего сывороточного альбумина (БСА), pH 7,5). Последовательно инкубируют (18°C, 2 час) в смеси из 4 нуклеотидов (0,01 мМ dATF, dCTF, dGTF; "Promega Madison WI", 0,001 мМ biotin-II-dUTP, "Sigma") и ДНК полимеразе-1 E coli (20 Ед/мл; "Promega"), до 2-3 см и толщиной 1 мм. Кусочки ткани помещали в химические стаканы, содержащие 200 мл физиологического раствора, отмывали приготовленной на буфере А. Затем отмывают буфером A, а вслед за ним 0,5 М PBS (0,5 М NaCl на 0,1 M фосфатном буфере pH 7,5). Окончательно срезы инкубируют с конъюгатом пероксидазы (Vectastam Elite ABC Kit-Vector, Burliname, CA), разведенным 1:25 0,5 M PBS, в который введены 1% БСА (бычьего сывороточного альбумина) и 0,5% твин-20, и в течение 10 мин окрашивают 0,04% раствором ДАБ (3,3-диаминобензидин тетрахлорид) на 0,05 M трис-буфере pH 7,5 и перекиси водорода в конечной концентрации 0,015% из 30% раствора. Промывают дистиллированной водой, обезвоживают и заключают в бальзам. Подсчет ядер, находившихся в состоянии апоптоза, проводился на 100 концевых ворсинках плаценты в каждом отдельно взятом случае. В подсчет на 100 ворсинок отбиралось 2000 ядер.

Для получения гомогената плодовая часть плаценты (ворсинчатый хорион) срезалась скальпелем небольшими пластинками площадью от клеток крови, перемешивая на магнитной мешалке в течение 15 мин и подсушивали на фильтрованной бумаге. Затем ткань растирали пестиком в фарфоровой ступке и гомогенизировали до однородной массы. К полеченному гомогенату добавляли ФР в объеме, равном изначальному весу ткани (на 1 г - 1 мл ФР). Взвесь помещали в пластиковые пробирки «Falcon» и подвергали замораживанию при -20°C в течение суток. Затем гомогенат размораживали и ультрацентрифугировали при 4000 об/мин при температуре +4°C. Недостаточную жидкость разливали мелкими аликвотами и хранили при -20°C до проведения иммуноферментного анализа.

Содержание антител к фосфатидилсерину классов IgG и IgM определяли с помощью твердофазного иммуноферментного анализа с использованием наборов компании «Bender MedSystems» (Austria). Верификацию вируса простого герпеса (ВПГ-1) и выраженность заболевания оценивали по динамике титров антител IgG с помощью стандартных тест-систем фирмы ЗАО «Вектор Бест», (Новосибирск). Анализ проводили на микропланшетном ридере «Stat-Fax-2100» (USA).

Статистическая обработка данных проводилась с использованием t-критерия Стьюдента.

Исследования показали, что обострение герпес-вирусной инфекции в третьем триместре беременности сопровождалось нарастанием в гомогенате плацент антител IgG и IgM к фосфатидилсерину. При титре антител к ВПГ-1 1:6400 отмечалось нарастание антител IgG и IgM к PS до 4,70±0,08 Ед/мл. Такие же высокие показатели антител IgG и IgM к PS определялись при титре антител к ВПГ-1 1:12800 - 5,60±0,06 Ед/мл (контроль - 2,50±0,07 Ед/мл).

Исследуя срезы плаценты после реакции ISEL, отмечено, что на 2000 ядер в ворсинках плаценты рожениц, перенесших герпес-вирусную инфекцию в третьем триместре при титре антител к вирусу герпеса - 1:6400, определяли 2,30±0,015% (контроль - 1,50±0,02%; p<0,001) ядер синцитиотрофобласта в состоянии апоптоза, а при титре 1:12800 количество ядер в состоянии апоптоза в синцитиотрофобласте увеличивалось до 4,50±0,20%.

Таким образом, вспышка герпес-вирусной инфекции во время беременности стимулирует выработку антител IgG и IgM к фосфатидилсерину (PS), что приводит к увеличению преждевременно вступающих в апоптоз ядер фетоплацентарного барьера.

Литература

1. Владимиров Ю.А. Свободные радикалы в живых системах / Ю.А.Владимиров, О.А.Азизова, А.И.Деев и др. // Итоги науки и техники. Сер. Биофизика. - 1991. - 29 т.

2. Князькин И.В. Апоптоз в онкоурологии / И.В.Князькин, В.Н.Цыган - Санк. Петерб.: «Наука». - 2007. - 240 с.

3. Погорелов В.М. Морфология апоптоза при нормальном и злокачественном гемопоэзе / В.М.Погорелов, Г.И.Козинец // Гематология и трансфузиология. - 1995. - т.43. - №5. - с.21-24.

4. Скулачев В.П. Феноптоз: запрограммированная смерть организма / В.П.Скулачев // Биохимия. - 1999. - 64 т. - Вып.12. - с.1679-1688.

5. Скулачев В.П. Явления запрограммированной смерти. Митохондрии, клетки и органы: роль активных форм кислорода / В.П.Скулачев // Соросовский образовательный журнал. 2001. №7. с.4-10.

6. Alareon-Segovia D. Antiphospholipid antibodies and the antiphospholipid syndrome in systemic lupus erythematosus. A perspective analysis of 500 consecutive patients, D. Alareon-Segovia, M. Debze // Medicine, 1987 v.68, p.353-365.

Изобретение относится к области медицины, а именно к диагностическим методам, и касается способа диагностики вступления ядер синцитиотрофобласта ворсинок плаценты в апоптоз путем определения в гомогенате плаценты содержания антител IgG и IgM к фосфатидилсерину у беременных, перенесших в третьем триместре герпес-вирусную инфекцию. Способ заключается в определении антител IgG и IgM к фосфатидилсерину методом ИФА в гомогенате плаценты. При титре антител к ВПГ-1 1:6400 определялось 4,70±0,08 Ед/мл антител IgG и IgM к фосфатидилсерину; при титре 1:12800 содержание антител IgG и IgM к фосфатидилсерину увеличилось до 5,60±0,06 Ед/мл (контроль - 2,50±0,07 Ед/мл) и при этом число ядер синцитиотрофобласта в состоянии апоптоза составило 4,50±0,20% (контроль - 1,5±0,20%). Способ обладает высокой чувствительностью и позволяет прогнозировать развитие апоптоза в ядрах синцитиотрофобласта ворсинок плаценты при нарастании в плаценте антител IgG и IgM к фосфотидилсерину.

Способ определения количества ядер синцитиотрофобласта ворсинок плаценты в состоянии апоптоза у родильниц, перенесших в третьем триместре беременности вспышку герпес-вирусной инфекции, включающий определение содержания 4,70±0,08 Ед/мл антител IgG, IgM к фосфатидилсерину и титра антител к вирусу герпеса 1:6400, и при этом определяют, что 2,30±0,015% ядер синцитиотрофобласта ворсинок плаценты находится в состоянии апоптоза; при концентрации антител IgG и IgM к фосфатидилсерину 5,60±0,06% Ед/мл (контроль - 2,50±0,07 Ед/мл) и величине титра антител к вирусу герпеса 1:12800 определяют, что 4,50±0,20% ядер синцитиотрофобласта ворсинок плаценты находится в состоянии апоптоза.