Цель предпринимаемого исследования - разработать метод путем метахроматического окрашивания (азур I) мембраны синцитиотрофобласта, позволяющего оценить, что на фоне герпес-вирусной инфекции проницаемость синцитиотрофобласта для крупнодисперсных образований увеличивается.
Метахромазию можно определить как окрашивание белков ткани, при котором спектр поглощения образующего комплекса ткань-краситель существенно отличается от спектра как исходного красителя, так и прочих тканевых комплексов. В результате такого окрашивания появляются выраженные цветовые контрасты.
Метахромазия возникает вследствие образования полимеров красителей [3, 6, 7, 8]. Согласно мнению многих авторов мономерная форма красителя имеет синий цвет, димеры и тримеры приобретают фиолетовый цвет, переходящий в полимерах в ярко-красный. Согласно данным Михаэлиса [8] при поглощении красителей (азур I, толуидиновый синий) появляются три полосы поглощения красителей: полоса-α (мономерная - синего цвета), полоса-β (димерная - фиолетового цвета) и полоса-γ (полимерная - красного цвета). Возникновение метахроматической окраски связано с агрегацией молекул красителя под влиянием межмолекулярных сил субстрата. Наиболее интенсивное окрашивание бывает при расстоянии между отрицательными зарядами субстрата меньше 5Å [2, 4, 5]. Если расстояние между СООН- группами составляет 10,3-10,5Å, субстрат не дает метахроматической окраски, и только после сближения этих групп до 5Å начинает появляться метахромазия.
Таким образом, отсутствие метахромазии можно объяснить тем, что в структуре отрицательно заряженные белки либо экранированы, либо находятся на расстоянии 10,0Å и более.
В качестве прототипа использовались данные, изложенные в работе Б.Альбертс, Д.Брей, М.Рэфф, К.Робертс, Дж.Уотсон [1]. Авторы считают, что наружные мембраны животных клеток формируют в мембранах поры, которые могут быть малы и обеспечивают транспорт ионов. Ионные каналы обеспечивают перенос веществ, приблизительно 106 ионов в секунду. Поры, по мнению авторов, вероятно очень узкие, и через них в норме могут проходить только те вещества, которые имеют подходящий размер и заряд.
Однако авторы не приводят данных, которые бы освещали изменение диаметра этих пор, особенно при патологических ситуациях, возникающих в организме. Нет также и работ, освещающих, что диаметр пор может расширяться под действием токсических инфекционных продуктов, и это явление можно регистрировать путем метахроматического окрашивания белков, формирующих стенку этих пор. В данной работе установлено, что герпес-вирусная инфекция изменяет диаметр пор и тогда метахроматической окраски при диаметре пор 10,3-10,5 Å не наблюдается.
В литературе применения метода метахроматического окрашивания мембран тканевых структур не имеется. Хотя этот метод может помочь оценить, находится ли мембрана в функционально благоприятных условиях, то есть ее проницаемость не нарушена, или при слабом окрашивании (γ-окрашивании в синий цвет) - ослаблено, следовательно должны быть факторы, нарушающие расстояние между СООН- группами, и мембрана становиться проницаемой для крупнодисперсных молекул.
Особое значение это приобретает в оценке состояния мембран синцитиотрофобласта ворсинок плаценты, которая в норме не должна пропускать крупнодисперсные структуры.
В известной литературе аналогов не обнаружено, тем более, что явления метахромазии выявляются на фоне герпес-вирусной инфекции в плаценте - явление, которое в литературе не освещалось.
Заявленный способ имеет следующие приемы.
1. Исследовали плаценту 20 рожениц, перенесших в третьем триместре герпес-вирусную инфекцию. Контролем служила плацента 15 рожениц, не болевших на всем протяжении гестации герпес-вирусной инфекцией.
2. Кусочки плаценты фиксировали в 10% спирт-формалине и заливали в парафин. Срезы, изготовленные на микротоме толщиной 3-4 мкм, обезпарафинировали и окрашивали в 0,01% растворе азура I при рН 4,0, разведенного на 30% этиловом спирте в течение 30 мин при комнатной температуре. После окраски срезы споласкивали в дистиллированной воде и заключали в глицерин-желатину.
3. Срезы изучали под микроскопом Opton (Германия), фотографировали на пленку «Kodak» (USA). Изображение вносилось с пленки с помощью сканера в компьютер и после изучения подвергалось цитофотометрированию.
4. Параллельно все операции проводились идентично и на срезах плаценты от здоровых рожениц.
5. Титр антител к вирусу герпеса определяли иммуноферментным методом на спектрофотометре «Stat-Fax-2100» (USA).
6. Цитофотометрическая обработка осуществлялась на цитофотометре «Mekos» (Москва).
7. Исследования проводились на базе стационара акушерского отделения, клиники Дальневосточного научного центра физиологии и патологии дыхания СО РАМН учреждения Российской академии медицинских наук. Все исследования были проведены с учетом требований Хельсинской декларации Всемирной ассоциации «Этические принципы проведения научных медицинских исследований с участием человека» с поправками 2000 г. и «Правилами клинической практики в Российской Федерации», утвержденными Приказом Минздрава РФ от 19.06.2003 г. №266.
Изучив метахроматическое окрашивание мембран синцитиотрофобласта ворсинок плаценты у беременных, перенесших в третьем триместре обострение герпес-вирусной инфекции (титр антител - 1:12800), установлено, что при окраске срезов плаценты 0,01% раствором азура I при рН 4,0 обнаружено ослабление γ-метахроматической окраски мембран до 29,2±1,2 усл. ед. (контроль - 40,8±1,8 усл. ед.) (фигура 1, 2). Следовательно, обострение герпес-вирусной инфекции дезинтегрирует взаиморасположенные между СООН- группами белков в мембране синцитиотрофобласта ворсинок плаценты и увеличивает расстояние между ними более чем на 5Å, что делает ее более проницаемой для крупнодисперсных структур, к числу которых можно отнести и возбудитель герпес-вирусной инфекции.
Литература
1. Б.Альбертс, Д.Брей, Дж.Льюис, М.Рэфф, К.Робертс, Дж.Уотсон. Молекулярная биология клетки. - М.: Мир, 1994. - Т.1. - С.394-395.
2. Виноградов В.В., Воробьева Н.Ф. Тучные клетки. Новосибирск: Наука, 1973. - 126 с.
3. Лилли Р. Патогистологическая техника и практическая гистохимия. М.: Мир, 1969. - 645 с.
4. Луценко М.Т. Углеводный обмен и выявление продуктов тканевого метаболизма гистохимическими методами. Благовещенск, 2006. Изд. СО РАМН. - 164 с.
5. Пирс Э. Гистохимия. М., 1962. Ил. - 944 с.
6. Ромейс Б. Микроскопическая техника. М., 1954. Ил. - 715 с.
7. Роскин Г.И. Микроскопическая техника. М., 1953. - 447 с.
8. Michaelis L., Granick S. Metachromasy of basic dyestuffs //I. Am. Chem. Soc., 1947. - Vol.67. - P.1212-1219.
Изобретение относится к области медицины и описывает способ оценки проницаемости мембраны синцитиотрофобласта ворсинок плаценты методом метахромазии у рожениц, перенесших в третьем триместре обострение герпес-вирусной инфекции с титром антител 1:12800, где срезы кусочков плаценты рожениц окрашивают в 0,01% растворе азура I при рН 4,0 и при снижении γ-метахромазии в мембранах синцитиотрофобласта до 29,2±1,2 усл. ед. считают, что расстояние между реагирующими на окраску группами белковых молекул увеличивается более чем на 5Å, что делает мембрану синцитиотрофобласта более проницаемой для крупнодисперсных структур. Способ позволяет оценить влияния герпес-вирусной инфекции на проницаемость мембраны синцитиотрофобласта. 1 пр., 2 ил.
Способ оценки проницаемости мембраны синцитиотрофобласта ворсинок плаценты методом метахромазии у рожениц, перенесших в третьем триместре обострение герпес-вирусной инфекции с титром антител 1:12800, характеризующийся тем, что срезы кусочков плаценты рожениц окрашивают в 0,01%-ном растворе азура I при рН 4,0 и при снижении γ-метахромазии в мембранах синцитиотрофобласта до 29,2±1,2 усл. ед. считают, что расстояние между реагирующими на окраску группами белковых молекул увеличивается более чем на 5Å, что делает мембрану синцитиотрофобласта более проницаемой для крупнодисперсных структур.
