СПОСОБ БИОЛОГИЧЕСКОЙ ОЦЕНКИ ОСТЕОИНДУЦИРУЮЩЕГО ЭФФЕКТА БЕЛКОВ ПЛАЗМЫ КРОВИ Российский патент 2012 года по МПК A61B10/00 G09B23/28 

Описание патента на изобретение RU2456927C2

Изобретение относится к области медицины, а именно к травматологии и ортопедии, и может применяться для оценки остеоиндуцирующего эффекта белков аутоплазмы крови, вводимых пациентам в целях стимуляции костеобразования.

Известны способ диагностики эндогенной интоксикации организма, способ определения степени тяжести эндогенной интоксикации организма и способ определения этиологии эндогенной интоксикации организма, в которых для выявления эндогенной интоксикации организма исследуют сыворотку или плазму крови методом клиновидной дегидратации и при наличии особенностей из ряда: штриховых, параллельных, концентрических, многолучевых, закругленных и круглых трещин, трещин в виде черной сети, в виде рыбьей чешуи, морщин, линий Валнера и языков Арнольда диагностируют эндогенную интоксикацию. Для оценки степени тяжести эндогенной интоксикации организма определяют наличие совокупности характерных особенностей по десятибалльной шкале и по размеру площади, занимаемой указанными особенностями. Воспалительный характер эндогенной интоксикации определяют при наличии закругленных, круглых трещин в центральной зоне дегидратированной капли. При наличии трещин в виде черной сети в ее центральной зоне определяют некротический характер эндогенной интоксикации. Нарушения липидного обмена определяют по выявлению трещин в виде рыбьей чешуи в промежуточной зоне. При наличии многолучевых трещин в центральной зоне определяют эндогенную интоксикацию, вызванную почечной недостаточностью (Пат. №2378991 RU. Опубл. 27.04.2009).

Однако известный способ предназначен для повышения точности диагностики эндогенной интоксикации организма и не предусматривает осуществление предварительной биологической оценки остеоиндуцирующего эффекта полученного препарата модифицированной аутоплазмы крови.

Известен способ стимуляции костной регенерации экстракорпорально модифицированной аутоплазмой, включающий взятие определенного объема крови у пациента с замедленным остеогенезом с последующим выделением активных компонентов плазмы, их лиофилизацию и введение в соединительно-тканную прослойку регенерата этого же пациента (Ускорение костной регенерации экстракорпорально модифицированной аутоплазмой: Медицинская технология / ФГУН «РНЦ «ВТО» им. акад. Г.А.Илизарова; Сост.: А.В.Попков, М.А.Ковинька, О.Л.Гребнева, Д.А.Попков, И.А.Талашова. Курган, 2005. С.6-9).

Однако данный способ не подразумевает предварительной биологической оценки остеоиндуцирующего эффекта полученного препарата модифицированной аутоплазмы крови.

Задачей настоящего изобретения является выявление наличия или отсутствия остеоиндуцирующего эффекта при стимуляции костеобразования.

Поставленная задача решается тем, что в способе биологической оценки остеоиндуцирующего эффекта белков плазмы крови, включающем в себя получение модифицированной аутоплазмы из плазмы крови человека, тестируют модифицированную аутоплазму на трех лабораторных мышах, которым предварительно осуществляют перелом костей голени, затем через 48 часов внутрибрюшинно вводят модифицированную аутоплазму в объеме 0,02 мл, далее через 72 часа после введения модифицированной аутоплазмы у мышей забирают кровь, в сыворотке которой проводят определение активности щелочной фосфатазы, затем оценивают результаты, при этом если активность щелочной фосфатазы в сыворотке крови как минимум двух мышей увеличена относительно верхней границы нормы, характерной для выбранного вида животных, в 2 и более раза, то делают вывод о наличии остеоиндуцирующего эффекта тестируемых белков плазмы крови, если активность щелочной фосфатазы увеличивается в 2 и более раза, относительно верхней границы нормы, только у одной меньше, то делают вывод об отсутствии остеоиндуцирующего эффекта тестируемых белков плазмы крови.

Настоящее изобретение поясняют подробным описанием и примером.

Способ осуществляют следующим образом.

Апирогенно готовят посуду и растворы: насыщенный раствор аммония сульфата, 0,15 М натрия хлорида, 8 М мочевины, трис-НСl 0,005 М рН=4,5. Плазму крови, взятую однократно в количестве 3,0 мл разводят в два раза 0,15 М раствором NaCl, после чего проводят осаждение белков с помощью насыщенного раствора сульфата аммония. На первом этапе добавляют 3 мл насыщенного раствора сульфата аммония и отбрасывают после центрифугирования преципитат.

На втором этапе добавляют 3 мл насыщенного раствора сульфата аммония и отбирают осадившуюся фракцию для дальнейшей работы. Фракцию, осаждающуюся в диапазоне насыщения от 30 до 50%, растворяют в 8 М растворе мочевины и подвергают гельпроникающей хроматографии на Toyoperl HW-55. Собирают фракции, соответствующие белкам с Mr 20-30 кД, диализуют полученный раствор против дистиллированной воды, лиофильно высушивают и стерилизуют, используя гамма-излучение. Полученные компоненты плазмы крови растворяют в 6 мл стерильного 0,15 М раствора NaCl.

Предварительно наркотизированное животное укладывают на приборном столе на животе. Далее фиксируют голень медиальной стороной на краю приборного стола, находят точку перелома кости в верхней трети голени и затем проводят перелом костей голени путем механического воздействия, путем перпендикулярно прикладываемого на продольную ось большеберцовой кости, до появления характерного звука перелома, при наличии которого судят об осуществлении перелома. Отсутствие смещения отломков отмечают визуально по сохраненной после манипуляции продольной оси голени. Далее, через 48 часов после осуществления перелома при помощи инсулинового шприца трем лабораторным мышам внутрибрюшинно в объеме 0,02 мл вводят раствор белков плазмы крови, полученных от больного, которому планируют провести процедуру стимуляции костеобразования. Через 72 часа после введения препарата у животных осуществляют забор крови в пробирку. Затем получают сыворотку, и проводят в ней биохимическое определение активности щелочной фосфатазы. Далее, для каждой мыши полученный результат сравнивают с нормой, равной 122 Е/л (Лабораторные животные. Разведение, содержание, использование в эксперименте. Западнюк И.П., Западнюк В.И., Захария Е.А. Киев: Вища школа. 1983. - 383 с.). Если значения активности щелочной фосфатазы в сыворотке крови как минимум двух животных превышают верхнюю границу нормы в 2 и более раза, то делают заключение о присутствии остеоиндуцирующего эффекта препарата модифицированной плазмы крови. Если значения активности щелочной фосфатазы в сыворотке крови увеличивается в 2 и более раза, относительно верхней границы нормы, только у одного и менее животного, то делают вывод об отсутствии остеоиндуцирующего эффекта препарата модифицированной плазмы крови. В качестве объекта тестирования можно использовать любое лабораторное животное, с учетом нормальных значений активности щелочной фосфатазы для данного вида животного.

Пример использования.

У пациента с его согласия получили плазму крови в объеме 3 мл. Апирогенно приготовили посуду и растворы: насыщенный раствор аммония сульфата, 0,15 М натрия хлорида, 8 М мочевины, трис-НСl 0,005 М рН=4,5. Полученную плазму развели в два раза 0,15 М раствором NaCl, после чего провели осаждение белков с помощью насыщенного раствора сульфата аммония. На первом этапе добавили 3 мл насыщенного раствора сульфата аммония и отбросили после центрифугирования преципитат.

На втором этапе добавили 3 мл насыщенного раствора сульфата аммония и отобрали осадившуюся фракцию для дальнейшей работы. Фракцию, осаждающуюся в диапазоне насыщения от 30 до 50%, растворили в 8 М растворе мочевины и подвергли гельпроникающей хроматографии на Toyoperl HW-55. Собрали фракции, соответствующие белкам с Mr 20-30 кД, диализовали полученный раствор против дистиллированной воды, лиофильно высушили и стерилизовали, используя гамма-излучение. Полученные компоненты плазмы крови растворили в 6 мл стерильного 0,15 М раствора NaCl.

Предварительно воспроизводили перелом костей голени у трех лабораторных мышей-самцов из одного помета. Для этого последовательно каждую особь наркотизировали, укладывали на приборном столе, далее фиксировали голень на краю приборного стола, находили точку перелома кости и затем проводили перелом путем воздействия на продольную ось большеберцовой кости, до появления характерного звука, по наличию которого судили об осуществлении перелома. Отсутствие смещения отломков отмечали визуально по сохраненной продольной оси голени. Далее, через 48 часов после осуществления перелома при помощи инсулинового шприца мышам внутрибрюшинно вводили 0,02 мл раствора белков плазмы крови, полученных согласно от больного, которому планировалось провести процедуру стимуляции костеобразования. Через 72 часа после введения животных эвтаназировали путем декапитации, кровь самотеком собирали в пробирки, далее, для получения сыворотки, кровь центрифугировали на центрифуге ЦЛР-1 15 мин при 3000 об/мин, затем проводили биохимическое определение активности щелочной фосфатазы на фотометре Stat Fax 1904Plus (США) с использованием наборов реагентов фирмы Vital diagnostics (РФ). Активность щелочной фосфатазы в сыворотке крови у трех тестированных мышей составила 251 Е/л, 514 Е/л, 179 Е/л. Таким образом, превышение верхней границы нормы, равной 122 Е/л, составляло 2,1, 4,2 и 1,5 раза соответственно для каждого животного. Следовательно, у двух из трех мышей активность щелочной фосфатазы превышала верхнюю границу нормы более чем в 2 раза, на основании чего сделали заключение, что тестируемый препарат белков аутоплазмы крови обладает остеоиндуцирующим эффектом и может быть введен пациенту в костный регенерат в целях стимуляции костеобразования.

Предлагаемый способ позволяет оценивать предварительный биологический эффект препарата белков аутоплазмы крови, используемого для стимуляции костной репарации у пациентов с замедленным остеогенезом. Кроме того, он позволяет оптимизировать процесс лечения пациентов ортопедо-травматологического профиля и сокращать сроки их пребывания в стационаре.

Предлагаемый способ может быть использован также для изучения метаболических и структурных изменений в органах и тканях лабораторных животных, происходящих при стимуляции у них остеорепаративных процессов.

Предлагаемый способ используется в клинико-экспериментальном лабораторном отделе и клинических отделениях ФГУ «РНЦ «ВТО им. академика Г.А.Илизарова».

Похожие патенты RU2456927C2

название год авторы номер документа
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БОГАТОЙ ТРОМБОЦИТАМИ ПЛАЗМЫ И ЕЕ ПРИМЕНЕНИЯ В СОСТАВЕ МАЗИ 2012
  • Лунева Светлана Николаевна
  • Гребнева Ольга Леонидовна
  • Новиков Константин Игоревич
  • Чернаков Алексей Юрьевич
  • Накоскина Наталья Викторовна
RU2511737C2
КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ ВОССТАНОВЛЕНИЯ СКЕЛЕТНЫХ МЫШЦ И КОСТИ ПРИ СКЕЛЕТНОЙ ТРАВМЕ 2011
  • Стогов Максим Валерьевич
  • Накоскин Александр Николаевич
  • Лунева Светлана Николаевна
RU2454227C1
СПОСОБ ПРОФИЛАКТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ ОСТЕОАРТРОЗА, СРЕДСТВО ДЛЯ ЕГО ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СРЕДСТВА ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ОСТЕОАРТРОЗА 1999
  • Десятниченко К.С.
  • Ларионов А.А.
  • Лунева С.Н.
RU2197238C2
СПОСОБ УДЛИНЕНИЯ КОНЕЧНОСТИ 2002
  • Шевцов В.И.
  • Ерофеев С.А.
RU2235519C2
БИОИМПЛАНТАТ ДЛЯ ВОЗМЕЩЕНИЯ ДЕФЕКТОВ МИНЕРАЛИЗОВАННЫХ ТКАНЕЙ И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ 2005
  • Шевцов Владимир Иванович
  • Талашова Ирина Александровна
  • Лунева Светлана Николаевна
  • Ковинька Михаил Александрович
RU2311167C2
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ХЕЛАТНОГО АМИНОАЦИЛЬНОГО КОМПЛЕКСА КАЛЬЦИЯ 2010
  • Накоскин Александр Николаевич
  • Лунева Светлана Николаевна
  • Стогов Максим Валерьевич
RU2445956C1
СПОСОБ ДИФФЕРЕНЦИРОВАННОЙ СТИМУЛЯЦИИ РЕПАРАТИВНОЙ РЕГЕНЕРАЦИИ ТКАНЕЙ ПРИ МОДЕЛИРОВАНИИ ВНУТРИСУСТАВНЫХ ПЕРЕЛОМОВ ВЕРТЛУЖНОЙ ВПАДИНЫ 2012
  • Силантьева Тамара Алексеевна
  • Краснов Виталий Викторович
RU2487735C1
СПОСОБ СТИМУЛЯЦИИ РЕПАРАТИВНОЙ РЕГЕНЕРАЦИИ ТКАНЕЙ ПРИ ИХ ПОВРЕЖДЕНИЯХ И ЗАБОЛЕВАНИЯХ 1999
  • Шевцов В.И.
  • Дьячков А.Н.
RU2191585C2
СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ ПОВРЕЖДЕНИЙ КОСТЕЙ ПРИ ЗАМЕДЛЕННОЙ КОНСОЛИДАЦИИ 2003
  • Норкин И.А.
  • Решетников А.Н.
  • Овчинникова Н.Н.
  • Пучиньян Д.М.
  • Гладкова Е.В.
RU2250789C2
СПОСОБ РЕАБИЛИТАЦИИ ДЕТЕЙ И ПОДРОСТКОВ С ПЕРЕЛОМАМИ В СОЧЕТАНИИ С ОСТЕОПЕНИЧЕСКИМ СИНДРОМОМ 2008
  • Степаненко Нина Петровна
  • Липина Екатерина Витальевна
  • Кондратьева Елена Ивановна
  • Гамбриндашвили Евгения Георгиевна
  • Павлова Анастасия Александровна
  • Барабаш Лидия Владимировна
  • Мерзлякова Наталья Викторовна
  • Шахова Светлана Сергеевна
RU2391087C2

Реферат патента 2012 года СПОСОБ БИОЛОГИЧЕСКОЙ ОЦЕНКИ ОСТЕОИНДУЦИРУЮЩЕГО ЭФФЕКТА БЕЛКОВ ПЛАЗМЫ КРОВИ

Изобретение относится к области медицины, а именно к травматологии и ортопедии. Для биологической оценки остеоиндуцирующего эффекта белков плазмы крови получают модифицированную аутоплазму из плазмы крови человека. Тестируют модифицированную аутоплазму на трех лабораторных животных, которым предварительно осуществляют перелом костей голени, затем через 48 часов внутрибрюшинно вводят модифицированную аутоплазму в объеме 0,02 мл. Далее через 72 часа после введения модифицированной аутоплазмы у животных забирают кровь, в сыворотке которой проводят определение активности щелочной фосфатазы. Если активность щелочной фосфатазы в сыворотке крови как минимум двух животных увеличена относительно верхней границы нормы, характерной для выбранного вида животных, в 2 и более раза, то делают вывод о наличии остеоиндуцирующего эффекта тестируемых белков плазмы крови. Если активность щелочной фосфатазы увеличивается в 2 и более раза, относительно верхней границы нормы, только у одного животного, то делают вывод об отсутствии остеоиндуцирующего эффекта тестируемых белков плазмы крови. Способ позволяет оценить остеоиндуцирующий эффект препарата белков аутоплазмы крови, используемого для стимуляции костной репарации у пациентов с замедленным остеогенезом. 1 пр.

Формула изобретения RU 2 456 927 C2

Способ биологической оценки остеоиндуцирующего эффекта белков плазмы крови, включающий в себя получение модифицированной аутоплазмы из плазмы крови человека, отличающийся тем, что тестируют модифицированную аутоплазму на трех лабораторных животных, которым предварительно осуществляют перелом костей голени, затем через 48 ч внутрибрюшинно вводят модифицированную аутоплазму в объеме 0,02 мл, далее через 72 ч после введения модифицированной аутоплазмы у животных забирают кровь, в сыворотке которой проводят определение активности щелочной фосфатазы, затем оценивают результаты, при этом, если активность щелочной фосфатазы в сыворотке крови как минимум двух животных увеличена относительно верхней границы нормы, характерной для выбранного вида животных, в 2 и более раза, то делают вывод о наличии остеоиндуцирующего эффекта тестируемых белков плазмы крови, если активность щелочной фосфатазы увеличивается в 2 и более раза, относительно верхней границы нормы, только у одного животного, то делают вывод об отсутствии остеоиндуцирующего эффекта тестируемых белков плазмы крови.

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 2012 года RU2456927C2

ПОПКОВ А.В
и др
Ускорение костной регенерации экстракорпорально модифицированной аутоплазмой
Медицинские технологии
- Курган: ФГУН РНЦ "ВТО", 2005, с.6-9
RU 2001135745 A, 27.08.2003
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ХОНДРО-ОСТЕОГЕННЫХ КЛЕТОК in vitro ИЗ МЕЗЕНХИМНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ 2005
  • Бесерра Ратиа Хосе
  • Андрадес Гомес Хосе Антонио
  • Сифуэнтес Руэда Мануэль
  • Герадо Парра Энрирке
RU2375447C2
АСФАНДИЯРОВ Р.И
и др
Изомеры щелочной фосфатазы и остеогенез
- Морфология, 2002, т.121, №2-3, с.13
HOU В
et al
Mechanical

RU 2 456 927 C2

Авторы

Ковинька Михаил Александрович

Стогов Максим Валерьевич

Очеретина Ирина Геннадьевна

Гребнева Ольга Леонидовна

Даты

2012-07-27Публикация

2010-10-13Подача