СПОСОБ ГЕНОТИПИРОВАНИЯ ПОЛИМОРФИЗМА rs17522918 ГЕНА ПЕРОКСИРЕДОКСИНА-1 У ЧЕЛОВЕКА Российский патент 2012 года по МПК C12Q1/68 C12N15/53 C12N9/02 

Изобретение относится к области молекулярной биологии и генетики, а именно к разработке методов генотипирования полиморфизма генов ферментов антиоксидантной защиты у человека.

Система антиоксидантной защиты представляет собой разветвленную, многокомпонентную сеть физиологически активных веществ, объединяющих ферментные и неферментные соединения, которые включаются в работу последовательно, взаимно дополняя друг друга, тем самым, обеспечивая контроль окислительных реакций и инактивацию всего многообразия токсичных продуктов свободнорадикального окисления. Хорошо известно, что антиоксидантная система включает в себя большое количество звеньев, но генетически детерминированными являются антиоксидантные ферменты, характеризующиеся выраженными межиндивидуальными и популяционными различиями в ферментативной активности, благодаря наличию в структуре их генов функционально неравноценных полиморфных аллелей [Gutteridge.J.M.C., Halliwell В. Antioxidants: Molecules, medicines, and myths // Biochemical and biophysical research communications. - 2010. - Vol.393, issue 4. - P.561-564]. В последние годы отмечается значительный интерес исследователей к изучению полиморфизма генов системы антиоксидантной защиты при различной патологии у человека.

Пероксиредоксин, PRDX1 (OMIM 176763) является одним из важных антиоксидантных ферментов, широко представленных в различных видах тканей (особенно в тех, которые характеризуются высоким уровнем пролиферативной активности), но преимущественно в лимфобластах, гладкомышечной ткани и эпителии бронхов. Фермент обладает одновременно оксидоредуктазной и пероксидазной активностью, а также участвует в клеточной пролиферации и развитии мышечной ткани [Neumann С.А., Hallek M. Essential role for the peroxiredoxin Prdxl in erythrocyte antioxidant defense and tumor suppression // Nature. - 2003. - Vol.424. - P.561-565].

Ген PRDX1 локализован в 1р34.1 хромосоме и имеет множество однонуклеотидных полиморфизмов. Одним из наиболее частных полиморфизмов, потенциально способных оказывать влияние на экспрессию гена PRDX1, является полиморфизм С/А (rs17522918) в 5'-нетранслируемой (5'-UTR) области гена. Однако данные о существующих в литературе методиках идентификации указанного полиморфизма полностью отсутствуют. Таким образом, существует реальная потребность в создании быстрого, недорогого способа идентификации полиморфизма rs17522918 гена PRDX1, который мог бы использоваться в качестве" рутинного метода генотипирования в ПЦР-лаборатории со стандартным набором оборудования и реактивов.

Задачей изобретения является разработка простого в исполнении и экономически целесообразного способа генотипирования однонуклеотидного полиморфизма rs17522918 в 5'-нетранслируемой области гена PRDX1 с помощью полимеразной цепной реакции и полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПЦР-ПДРФ).

Предлагаемый способ осуществляется следующим образом:

При разработке способа генотипирования полиморфизма rs17522918 гена PRDX1 использовали образцы геномной ДНК, выделенные из замороженной венозной крови стандартным двухэтапным методом фенольно-хлороформной экстракции (Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Д. Методы генной инженерии. Молекулярное клонирование. Пер. с анг. М.: Мир, - 1984. - 480 с.). Сначала на основе нуклеотидной последовательности гена пероксиредоксина-1 (Gene ID: 5052, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/5052) с помощью программы "GeneFisher" 1.3 (http://bibiserv.techfak.uni-bielefeld.de) была подобрана пара олигонуклеотидных праймеров, фланкирующих интересуемую область гена PRDX1, имеющих следующую структуру:

F: 5'-ACACTCACCAGTCCCAACACAAG-3' (SEQ ID NO 1)

R: 5'-CCACATCCCCCTCCTCTCTCTC-3' (SEQ ID NO 2)

Праймеры были синтезированы в НПО "Литех" (г.Москва). Амплификацию проводили на многоканальном термоциклере "Терцик" (ЗАО НПО "ДНК-Технология", г.Москва).

При приготовлении растворов для проведения ПЦР использовали импортные реагенты высокой степени очистки (Ultra pure и Biotechnology Grade). ПЦР проводили в 12 мкл реакционной смеси, содержащей 0,5 мкл образца геномной ДНК. Смесь для амплификации включала: 67 мМ Трис-НСl рН 8,8, 16,6 мМ сульфата аммония, 6,7 мкМ ЭДТА, 1,6 мM MgCl₂, 1 мМ β-меркаптоэтанола, 1 мМ каждого dNTPs (dATP, dCTP, dTTP и dGTP), 15 нМ каждого из праймеров и 1U (1 единица активности) Taq-полимеразы. Для предотвращения испарения амплификационной смеси и образования конденсата на реакционную смесь наслаивали по 30 мкл минерального масла.

Параметры ПЦР были следующими: "горячий старт" в течение 5 мин при 95°С, затем 38 циклов амплификации в режиме 95°С - 30 сек; 65°С - 30 сек; 72°С - 30 сек, заключительный цикл элонгации ДНК - 7 мин при 72°С. Размер амплифицированного в ходе ПЦР фрагмента гена PRDX1 составил 165 пар нуклеотидов (п.н.). С целью проверки качества амплификации интересуемого фрагмента ДНК нуклеотидную последовательность продукта ПЦР гена PRDX1 секвенировали на генетическом анализаторе ABI PRISM 310 Genetic Analyzer с использованием набора реактивов BigDye Termination Kit 1.1 ("Applied Biosystems", США). Контроль успешности проведения ПЦР осуществлялся с помощью электрофореза продуктов амплификации на 2% агарозном геле. Обнаружение полиморфизма rs17522918 гена PRDX1 проводилось путем обработки ампликона 5U (5 единиц активности) эндонуклеазой BstH2I (ООО "Сибэнзим", г.Новосибирск; прототип HaeII) согласно протоколу, описанному производителем фермента. Рестрикционную смесь термостатировали в течение 6 ч при температуре 65°С. После инкубации фрагменты ДНК фракционировали с помощью электрофореза в 2% агарозном геле, приготовленном на основе ТАЕ буфера (0,089 М Трис-HCl, 2 мМ ЭДТА, 0,089М борная кислота) с 0,01% бромистым этидием. Фракционирование фрагментов ДНК проводили в камере для горизонтального электрофореза SE-2 (ООО "Хеликон", г.Москва) в течение 25 мин при напряжении 180В. В качестве маркера молекулярного веса использовали ДНК фага λ, гидролизированную эндонуклеазой PstI. Разделенные фрагменты ДНК визуализировали на трансиллюминаторе с помощью прибора компьютерной видеосъемки GDS-8000 ("UVP", США). Документирование и обработка изображений электрофоретических гелей проводилась с помощью аналитического пакета Labworks.

Для демонстрации эффективности разработанного способа идентификации полиморфизма rs17522918 гена PRDX1 было проведено генотипирование тотальной ДНК 20 добровольцев. Результаты электрофоретического разделения продуктов ПЦР-рестрикции полиморфизма rs17522918 гена PRDX1 представлены на фигуре. При наличии аллеля дикого типа С существует сайт узнавания для эндонуклеазы BstH2I, которая расщепляет ампликон размером 165 п.н. на два фрагмента 81 и 84 п.н. (при электрофоретическом разделении они накладываются друг на друга). При наличии мутантного аллеля А гена PRDX1 происходит потеря сайта узнавания для эндонуклеазы BstH2I, в результате чего ампликон остается нерасщепленным данной рестриктазой и визуализируется в виде одного фрагмента размером 165 п.н. У гетерозиготных носителей благодаря наличию обоих аллельных вариантов гена присутствуют все три фрагмента ДНК: 165, 81 и 84 п.н.

Таким образом, представленные результаты показывают, что предлагаемый способ позволяет эффективно идентифицировать полиморфизм rs17522918 в гене пероксиредоксина-1 с помощью предложенного нами метода ПЦР-ПДРФ. В связи с незначительной себестоимостью анализа, обусловленной низкой ценой эндонуклеазы BstH2I отечественного производства ООО "Сибэнзим" (http://russia.sibenzyme.com/info59.php), предлагаемый способ генотипирования может быть применен в любой ПЦР-лаборатории с минимальным набором оборудования и реактивов.

Изобретение относится к области молекулярной биологии и может быть использовано в медицине при определении наследственной предрасположенности к развитию заболеваний, ассоциированных с носительством полиморфных вариантов гена пероксиредоксина-1. Предложен способ генотипировании полиморфизма rs 17522918 гена PRDX1, предусматривающий проведение ПЦР с использованием специально подобранной пары праймеров (F: 5'-ACACTCACCAGTCCCAACACAAG-3' и R: 5'-ССАСАТСССССТССТСТСТСТС-3') и последующий анализ ПЦР-продукта методом ПДРФ, который включает обработку эндонуклеазой BstH2I и фракционирование полученных фрагментов в 2% агарозном геле. При этом ДНК-фрагменты размером 81 и 84 п.н. верифицируют как гомозиготный генотип дикого типа СС, фрагмент размером 165 п.н. - как гомозиготный мутантный генотип АА, а фрагменты 165, 81 и 84 п.н. - как гетерозиготный генотип СА. Способ по изобретению отличается простотой и точностью диагностики. 1 ил., 1 пр.

Способ генотипирования полиморфизма rs17522918 гена пероксиредоксина-1 у человека, включающий генотипирование полиморфизма методами полимеразной цепной реакции и полиморфизма длин рестрикционных фрагментов с использованием праймеров с SEQ ID NO 1-2 и эндонуклеазы BstH2 I для дифференцировки аллелей С и А полиморфизма rs17522918 гена PRDX1, при этом гомозиготному генотипу дикого типа СС соответствуют длины рестрикционных фрагментов размерами 81 и 84 пар нуклеотидов, гомозиготному мутантному генотипу АА - длины рестрикционных фрагментов размером 165 пар нуклеотидов, гетерозиготному генотипу СА - длины рестрикционных фрагментов размерами 165, 81 и 84 пар нуклеотидов.