СПОСОБ ИДЕНТИФИКАЦИИ ПОЛИМОРФИЗМА rs1128446 ГЕНА ТИОРЕДОКСИНРЕДУКТАЗЫ-1 У ЧЕЛОВЕКА Российский патент 2012 года по МПК C12Q1/68 C12N15/53 C12N9/02 

Изобретение относится к области молекулярной биологии и генетики, а именно к разработке методов генотипирования полиморфизма генов ферментов антиоксидантной защиты у человека.

Одной из наиболее древних, эволюционно сложившихся и сложноустроенных биологических систем у человека является система редокс-гомеостаза, главным компонентом которой является сеть ферментов антиоксидантной защиты, контролирующих течение, направленность и интенсивность процессов свободнорадикального окисления в органах и тканях и обеспечивающих приспособление организма к изменяющимся условиям внешней среды [Gutteridge J.M.C., Halliwell В. Antioxidants: Molecules, medicines, and myths // Biochemical and biophysical research communications. - 2010. - Vol.393, issue 4. - P.561-564]. Антиоксидантные ферменты характеризуются выраженными межиндивидуальными и популяционными различиями в ферментативной активности благодаря наличию в структуре их генов функционально неравноценных полиморфных аллелей [Gutteridge J.M.C., HalliweH В. Antioxidants: Molecules, medicines, and myths // Biochemical and biophysical research communications. - 2010. - Vol.393, issue 4. - P. 561-564]. В последние годы отмечается значительный интерес исследователей к изучению полиморфизма генов системы антиоксидантной защиты при различной патологии у человека.

Тиоредоксинредуктаза 1 типа, TXNRD1 (OMIM 601112) - антиоксидантный фермент, катализирующий восстановление тиоредоксина в реакции использования электронов НАДФН и обладающий дисульфидоксидоредуктазной активностью [Novoselov S.V., Gladyshev N.N. Non-animal origin of animal thioredoxin reductases: Implications for selenocysteine evolution and evolution of protein function through carboxy-terminal extensions // Protein. Sci. - 2003. - Vol.12. - P.372-378; Ермаков В.В. Биогеохимия селена и его значение в профилактике эндемических заболеваний человека // Электронный науч.-информ. журн. «Вестн. отд. наук о Земле РАН». - 2004. - №1(22). - http://www.scgis.ru/russian/cp1251/h_dgggms/l-2004/scpub-4.pdf]. Кроме антиоксидантной защиты организма и контроля над постоянством редокс-потенциала клетки тиоредоксинредуктаза имеет множество других физиологических функций: участвует в клеточной пролиферации, участвует в транспорте электронов, осуществляет сигнальную трансдукцию, связывание селена, участвует в активации НАДН и НАДНФ.

Ген TXNRD1 локализован в хромосоме 12q23-q24.1 и экспрессируется в цитозоле всех органов, преимущественно в гладкомышечных клетках и кардиомиоцитах [Gasdaska P.Y., Gasdaska J.R., Cochran S., Powis G. Cloning and sequencing of a human thioredoxin reductase // FEBS Lett. - 1995. - Vol.373. - P.5-9]. Ген TXNRD1 имеет множество однонуклеотидных полиморфизмов. Одним из наиболее частных полиморфизмов, потенциально способных оказывать влияние на экспрессию гена TXNRD1, является нуклеотидная замена C/G в 5'-нетранслируемой (5'-UTR) области гена, известная как полиморфизм rs 1128446. Анализ литературных данных показывает, что на сегодняшний день не существует способов идентификации полиморфизма rs 1128446 гена тиоредоксинредуктазы-1, в том числе и методом полимеразной цепной реакции с последующим анализом длин рестрикционных фрагментов (ПЦР-ПДРФ). В этой связи существует потребность в создании быстрого, недорогого способа идентификации полиморфизма rs 1128446 гена TXNRD1, который мог бы использоваться в качестве рутинного метода генотипирования в ПЦР-лаборатории со стандартным набором оборудования и реактивов.

Задачей изобретения является разработка способа идентификации полиморфизма rs 1128446 гена TXNRD1 посредством проведения полимеразной цепной реакции и анализа длин рестрикционных фрагментов.

Предлагаемый способ осуществляется следующим образом:

При разработке способа генотипирования rs 1128446 полиморфизма гена TXNRD1 (Gene ID: 7296) использовали образцы геномной ДНК, выделенные из замороженной венозной крови стандартным двухэтапным методом фенольно-хлороформной экстракции (Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Д. Методы генной инженерии. Молекулярное клонирование. Пер. с анг. М.: Мир, - 1984. - 480 с.). Сначала на основе нуклеотидной последовательности гена тиоредоксинредуктазы 1 типа с помощью программы "GeneFisher" 1.3 (http://bibiserv.techfak.uni-bielefeld.de) была подобрана пара праймеров, фланкирующих интересуемую область 5'-UTR гена TXNRD1, имеющая следующую структуру:

F: 5'-GGCTTCTCGTAGCCATTAGG-3' (SEQ IDNO 1)

R: 5'-TATCTTCCCTTCCCCGAGAC-3' (SEQ ID NO 2)

Праймеры были синтезированы в НПО "Литех" (г.Москва). Амплификацию проводили на многоканальном термоциклере "Терцик" (ЗАО НПФ "ДНК-Технология", г.Москва). Параметры ПЦР были следующими:

"горячий старт" в течение 4 мин при 95°С, затем 40 циклов амплификации в режиме 95°С - 30 сек; 60°С - 30 сек; 72°С - 30 сек, заключительный цикл элонгации ДНК - 7 мин при 72°С. Размер амплифицированного в ходе ПЦР фрагмента гена TXNRD1 составил 262 пар нуклеотидов (п.н.). С целью проверки качества амплификации интересуемого фрагмента ДНК нуклеотидную последовательность продукта амплификации гена TXNRD1 секвенировали на генетическом анализаторе ABI PRISM 310 Genetic Analyzer с использованием набора реактивов BigDye Termination Kit 1.1 ("Applied Biosystems", США).

При приготовлении растворов для проведения ПЦР использовали импортные реагенты высокой степени очистки (Ultra pure и Biotechnology Grade). ПЦР проводили в 12 мкл реакционной смеси, содержащей 0,5 мкл образца геномной ДНК. Смесь для амплификации включала: 67 мМ Трис-НСl рН 8,8, 16,6 мМ сульфата аммония, 6,7 мкМ ЭДТА, 1,6 мM MgCl₂, 1 мМ β-меркаптоэтанола, 1 мМ каждого dNTPs (dATP, dCTP, dTTP и dGTP), 15 нМ каждого из праймеров и 1U (1 единица активности) Taq-полимеразы. Для предотвращения испарения амплификационной смеси и образования конденсата на реакционную смесь наслаивали по 30 мкл минерального масла.

Контроль успешного проведения ПЦР осуществлялся с помощью электрофореза продуктов амплификации на 2% агарозном геле. Обнаружение rs l128446 полиморфизма гена TXNRD1 проводилось путем обработки ампликона 5U (5 единиц активности) эндонуклеазы TaqI (ООО "Сибэнзим", г.Новосибирск) согласно протоколу, описанному производителем фермента. Рестрикционную смесь термостатировали в течение 6 ч при температуре 65°С. После инкубации фрагменты ДНК фракционировали с помощью электрофореза в 2% агарозном геле, приготовленном на основе ТАЕ буфера (0.089М Трис-HCl, 2 мМ ЭДТА, 0,089М борная кислота) с 0,01% бромистым этидием. Фракционирование фрагментов ДНК проводили в камере для горизонтального электрофореза SE-2 (ООО "Хеликон", г.Москва) в течение 30 мин при напряжении 200 В. В качестве маркера молекулярного веса использовали ДНК фага λ, гидролизированную эндонуклеазой PstI. Разделенные фрагменты ДНК визуализировали на трансиллюминаторе с помощью прибора компьютерной видеосъемки GDS-8000 ("UVP", США). Документирование и обработка изображений электрофоретических гелей проводилась с помощью аналитического пакета Labworks.

Для демонстрации эффективности разработанного способа идентификации полиморфизма rs1128446 гена TXNRD1 было проведено генотипирование у 23 человек. Результаты электрофоретического разделения продуктов ПЦР-рестрикции полиморфизма C/G гена TXNRD1 представлены на фигуре. При наличии аллеля дикого типа С существует сайт узнавания для эндонуклеазы TaqI, которая расщепляет ампликон размером 262 п.н. на два фрагмента 179 и 83 п.н. При наличии мутантного аллеля G происходит потеря сайта узнавания для эндонуклеазы TaqI, в результате чего ампликон остается нерасщепленным данной рестриктазой и визуализируется в виде одного фрагмента размером 262 п.н. У гетерозиготных носителей C/G rs1128446 гена TXNRD1 благодаря наличию обоих аллельных вариантов гена присутствуют все три фрагмента ДНК: 262, 179 и 83 п.н.

Таким образом, представленные результаты показывают, что предлагаемый способ позволяет эффективно идентифицировать полиморфизм rs1128446 в гене тиоредоксинредуктазы 1 типа с помощью ПЦР-ПДРФ анализа. В связи с низкой себестоимостью анализа, обусловленной низкой ценой на эндонуклеазу TaqI ООО "Сибэнзим" (http://russia.sibenzyme.com/infol28.php), предлагаемый способ генотипирования может быть применен в любой ПЦР-лаборатории с минимальными материальными затратами.

Изобретение относится к области молекулярной биологии и может быть использовано в медицине при определении наследственной предрасположенности к развитию заболеваний, ассоциированных с носительством полиморфных вариантов гена тиоредоксинредуктазы-1. Предложен способ генотипирования полиморфизма rs 1128446 гена TXNRD1, предусматривающий проведение 1ЩР с использованием специально подобранной пары праймеров (F: 5'-GGCTTCTCGTAGCCATTAGG-3' и R: 5'-TATCTTCCCTTCCCCGAGAC-3') и последующий анализ ПЦР-продукта методом ПДРФ, который включает обработку эндонуклеазой Taq1 и фракционирование полученных фрагментов в 2% агарозном геле. При этом ДНК-фрагменты размером 179 и 83 п.н. верифицируют как гомозиготный генотип дикого типа СС, фрагмент размером 262 п.н. - как гомозиготный мутантный генотип GG, а фрагменты 262, 179 и 83 п.н. - как гетерозиготный генотип CG. Способ отличается простотой и точностью диагностики. 1 ил., 1 пр.

Способ идентификации полиморфизма rs1128446 гена тиоредоксинредуктазы у человека, включающий идентификацию полиморфизма методами полимеразной цепной реакции и полиморфизма длин рестрикционных фрагментов с использованием праймеров с SEQ ID NO: 1-2 и эндонуклеазы TaqI для дифференцировки аллелей С и G полиморфизма rs1128446 гена TXNRD1; при этом гомозиготному генотипу дикого типа СС соответствуют длины рестрикционных фрагментов размерами 179 и 83 пары нуклеотидов, гомозиготному мутантному генотипу GG - длины рестрикционных фрагментов размером 262 пары нуклеотидов, гетерозиготному генотипу CG - длины рестрикционных фрагментов размерами 262, 179 и 83 пары нуклеотидов.