ЭКСТРАКТ COPTIDIS RHIZOMA И ЕГО НОВОЕ ПРИМЕНЕНИЕ В ЛЕЧЕНИИ РЕСПИРАТОРНОГО ЗАБОЛЕВАНИЯ Российский патент 2012 года по МПК A61K36/718 A61K36/25 A61P11/10 A61P11/14 A61P31/00 

Область изобретения

Предложен экстракт Coptidis rhizoma или объединенный экстракт Coptidis rhizoma с листом плюща, который полезен в отхаркивающей, противокашлевой и/или антигистаминной активностях. В частности, предложены противокашлевая и/или отхаркивающая композиция и/или композиция для предупреждения или лечения респираторных заболеваний, содержащая экстракт Coptidis rhizoma или объединенный экстракт Coptidis rhizoma с листом плюща в качестве активного ингредиента, и ее способ получения.

Предшествующий уровень техники

Известно, что кашель и мокрота могут быть вызваны физическими или химическими факторами, такими как холодный воздух, чужеродные субстанции, включая патологические микроорганизмы, загрязнения воздуха, аллерген и тому подобное, и могут быть разделены в соответствии с причинами следующим образом.

Во-первых, если кашлевые рецепторы в гортани, трахеях, бронхах, глотке, придаточных пазухах носа, диафрагме и тому подобном стимулируются физико-химическими факторами, то стимуляция передается в центр кашля в продолговатом мозге головного мозга, в результате чего наблюдается кашлевой рефлекс.

Во-вторых, если парасимпатическая нервная система активируется физическими или химическими факторами, то гладкая мускулатура бронхов сокращается, в результате чего могут наблюдаться такие симптомы, как спазм бронхов и бронхоконстрикция.

В-третьих, медиаторы воспаления и тому подобные высвобождаются из тучных клеток посредством физических и химических факторов.

Поэтому удаление указанных выше факторов может подавлять кашель и мокроту. Однако большинство лекарственных средств, разработанных до сих пор, представляют собой, главным образом, синтетические химические вещества и, таким образом, вызывают различные побочные эффекты. Природные лекарственные средства, разработанные для компенсации таких дефектов, не могут демонстрировать существенного эффекта для подавления кашля и мокроты.

При этом астма, которая является типичным респираторным заболеванием, часто и резко демонстрирует такие симптомы, как затруднение дыхания, кашель, жесткое дыхание и тому подобное. Астма может быть разделена на сердечную астму и бронхиальную астму. Хотя показатель частоты заболеваний астмой варьирует в зависимости от страны, человеческой расы, возраста и тому подобного, в Англии в 2007 г. было сообщено, что примерно 7,9% взрослых, 13,7% детей и 9,4% пожилых людей страдают от астмы. В Корее частота заболеваний была увеличена в связи с изменением образа жизни, загрязнением окружающей среды, увеличением стресса и тому подобного. В последнее время тяжесть астмы увеличилась до максимума, поскольку загрязнение окружающей среды становится серьезным, возраст заболеваемости астмой снижается и симптомы длятся дольше.

Обструкция дыхательных путей, характерная для астмы, происходит посредством 3 стадий. В частности, гладкие мышцы бронхов сокращаются, слизистая оболочка легких утолщается и вязкая слизь скапливается в бронхах и бронхиолах, тем самым закупоривая дыхательные пути. Из этих стадий только сокращение гладких мышц бронхов может быть легко восстановлено.

В механизме возникновения экзогенной (аллергенной) астмы особенно важным является IgE, a IgG связан с этим частично. IgE высвобождает медиаторы, такие как гистамин, SRS-A (медленно реагирующая субстанция анафилаксии), ECF-A (эозинофильный хемотаксический фактор анафилаксии), NCF (нейтрофильный хемотаксический фактор), PAF (фактор активации тромбоцитов), кинин, PGs (простагландины) и тому подобное, которые активируют тучные клетки для того, чтобы вызвать реакцию гиперчувствительности. Оказалось, что эндогенная (неаллергенная) астма, хотя ее механизм не был выяснен, опосредуется вегетативным нервом. Холиновая стимуляция у пациентов с эндогенной формой вызывает выделение медиатора, такого как гистамин, из тучной клетки непосредственно через рецепторы, увеличение секреции бокаловидных клеток, расширение кровеносных сосудов в легких и сокращение трахеи, бронхов и бронхиол, тем самым увеличивая спазм бронхов и секрецию слизи.

Основное лечение астмы до сих пор не было разработано и развиваются различные способы и лекарственные средства для предупреждения спазма и осложнений, однако они просто облегчают симптомы и не могут принципиально вылечить болезнь, и они могут вызывать серьезные побочные эффекты.

Для преодоления ограничений существующих лекарственных средств существует спрос на создание новых лекарственных средств, способных принципиально лечить причину и эффективно облегчать симптомы заболевания. Однако различные лейкоциты, цитокины и воспалительные медиаторы, выделяемые из них, вовлечены в респираторное заболевание и, таким образом, эффективное лечение затруднительно с однокомпонентным соединением. Таким образом, натуральный экстракт, имеющий различные ингредиенты и механизмы, может быть эффективным лекарственным средством, и поэтому существует потребность в разработке лекарственного средства на основе натурального экстракта.

Подробное описание изобретения

Техническая проблема

Авторы настоящего изобретения показали на основании результатов исследований для разработки противокашлевых или отхаркивающих средств, что экстракт Coptidis rhizoma или объединенный экстракт Coptidis rhizoma с листом плюща обладают великолепными противокашлевой, отхаркивающей и антигистаминной активностями для завершения настоящего изобретения.

В одном воплощении предложено новое применение экстракта Coptidis rhizoma или объединенного экстракта Coptidis rhizoma с листом плюща для удаления мокроты, подавления кашля и/или лечения и/или предупреждения респираторных заболеваний.

В другом воплощении предложены противокашлевая или отхаркивающая композиция и/или композиция для предупреждения и/или лечения респираторных заболеваний, содержащая экстракт Coptidis rhizoma или объединенный экстракт Coptidis rhizoma с листом плюща в качестве активного ингредиента, и способ ее получения.

В еще одном воплощении предложен способ подавления кашля, удаления мокроты и/или лечения и/или предупреждения респираторных заболеваний, включающий стадию введения композиции, содержащей экстракт Coptidis rhizoma или объединенный экстракт Coptidis rhizoma с листом плюща в качестве активного ингредиента, пациенту, нуждающемуся в подавлении кашля, удалении мокроты и/или лечении и/или предупреждении респираторного заболевания.

Техническое решение

Одно воплощение относится к новому применению экстракта Coptidis rhizoma или объединенного экстракта Coptidis rhizoma с листом плюща в удалении мокроты, подавлении кашля и/или лечении и/или предупреждении респираторных заболеваний.

Другое воплощение относится к противокашлевой или отхаркивающей композиции и/или композиции для предупреждения и/или лечения респираторных заболеваний, содержащей экстракт Coptidis rhizoma или объединенный экстракт Coptidis rhizoma с листом плюща в качестве активного ингредиента.

Coptidis Rhizoma представляет собой многолетнее травянистое растение, относящееся к семейству Ranunculaceae, и в основном используется его корневищная часть. Известно, что она содержит алкалоид берберин, пальматин, коптизин, берберастин, магнофлорин и тому подобное в качестве основных фармакологических компонентов.

Однако воздействие композиции, содержащей экстракт Coptidis rhizoma и Coptidis Rhizoma, на противокашлевую, отхаркивающую и антигистаминную активности не было еще изучено.

Авторы настоящего изобретения обнаружили, что экстракт Coptidis rhizoma обладает противокашлевой, отхаркивающей и антигистаминной активностями и является эффективным в лечении и/или предупреждении респираторного заболевания для завершения настоящего изобретения.

Плющ относится к семейству Araliaceae, и это означает растение, относящиеся к роду Hedera (Hedera spp.). Например, он может включать, но не ограничивается этим, Hedera algeriensis, Hedera azorica, Hedera canariensis, Hedera colchica, Hedera helix, Hedera hibernica, Hedera maderensis, Hedera nepalensis, Hedera pastuchowii, Hedera rhombea и тому подобное. Были обнаружены противокашлевые и отхаркивающие эффекты высушенного экстракта листьев плюща; однако до сих пор не было сообщено, что при введении экстракта листа плюща в комбинации с другими экстрактами трав может быть получен значительный синергетический эффект без побочных эффектов.

Авторы настоящего изобретения установили, что комбинация экстракта Coptidis rhizoma и экстракта листа плюща значительно увеличивает противокашлевый эффект, отхаркивающий эффект, антигистаминный эффект, эффект подавления бронхоконстрикции, эффект подавления гиперчувствительности дыхательных путей, эффект подавления бронхиальной окклюзии в легочной ткани и эффект подавления инфильтрации воспалительных клеток по сравнению с каждым экстрактом отдельно. Кроме того, в настоящем изобретении предложено оптимальное для смеси соотношение экстракта Coptidis rhizoma и экстракта листа плюща, демонстрирующее максимальный синергетический эффект для фармакологических активностей.

Для того чтобы увеличить синергетические эффекты для противокашлевого, отхаркивающего, антигистаминного действия, подавления бронхоконстрикции, подавления гиперчувствительности дыхательных путей, подавления бронхиальной окклюзии в легочной ткани и подавления инфильтрации воспалительных клеток путем смешивания экстракта Coptidis rhizoma с экстрактом листа плюща, соотношение в смеси экстракта листа плюща и экстракта Coptidis rhizoma составляет от 0,1:1 до 10:1 в расчете на массу твердого содержимого (масса экстракта листа плюща: масса экстракта Coptidis rhizoma), предпочтительно от 0,2:1 до 5:1, более предпочтительно от 1:1 до 4:1, еще более предпочтительно от 1,5:1 до 3.5:1, наиболее предпочтительно от 2,5:1 до 3,5:1. Термин 'твердое содержимое' означает содержимое, из которого удален растворитель, используемый для получения экстракта.

Термин 'экстракт' в данной заявке означает неочищенный экстракт Coptidis Rhizoma и/или листа плюща и/или конкретный растворимый в растворителе экстракт или фракцию неочищенного экстракта, и он может находиться в форме раствора, концентрата или порошка. Термин 'объединенный экстракт Coptidis rhizoma с листом плюща' означает как смесь экстракта листа плюща и экстракта Coptidis Rhizoma соответственно, полученного путем экстрагирования листа плюща и Coptidis Rhizoma, так и экстракт, полученный путем экстрагирования смеси листа плюща и Coptidis Rhizoma.

Экстракт Coptidis Rhizoma может представлять собой неочищенный экстракт, полученный путем экстрагирования Coptidis Rhizoma, предпочтительно его корневищной части, одним или более растворителями, выбранными из группы, состоящей из воды и линейного или разветвленного спирта, имеющего от 1 до 4 атомов углерода, растворимый в растворителе экстракт, полученный путем добавления к неочищенному экстракту одного или более растворителей, выбранных из группы, состоящей из водного раствора линейного или разветвленного спирта, имеющего от 1 до 6 атомов углерода, предпочтительно водного раствора пропилового спирта, водного раствора изопропилового спирта и насыщенного водой бутилового спирта.

Экстракт листа плюща может представлять собой неочищенный экстракт, полученный путем экстрагирования высушенного листа плюща одним или более растворителями, выбранными из группы, состоящей из воды и линейного или разветвленного спирта, имеющего от 1 до 4 атомов углерода, или растворимый в растворителе экстракт, полученный путем добавления к неочищенному экстракту одного или более растворителей, выбранных из группы, состоящей из водного раствора линейного или разветвленного спирта, имеющего от 1 до 6 атомов углерода, предпочтительно водного раствора пропилового спирта, водного раствора изопропилового спирта и насыщенного водой бутилового спирта. Плющ, используемый для получения экстракта листа плюща, может представлять собой Hedera spp., и, например, он может представлять собой один или более, выбранных из группы, состоящей из Hedera algeriensis, Hedera azorica, Hedera canariensis, Hedera colchica, Hedera helix, Hedera hibernica, Hedera maderensis, Hedera nepalensis, Hedera pastuchowii, Hedera rhombea и тому подобного, но не ограничивается ими.

В предпочтительном воплощении растворитель, используемый для получения неочищенного экстракта Coptidis Rhizoma или листа плюща, может представлять собой один или более, выбранных из группы, состоящей из воды, 10-70%-ного (об./об.), предпочтительно 20-60%-ного (об./об.), более предпочтительно 25-55%-ного (об./об.) линейного или разветвленного спирта, имеющего от 1 до 4 атомов углерода, предпочтительно водного раствора метанола и водного раствора этанола и насыщенного водой бутилового спирта.

Растворитель, используемый для получения растворимого в растворителе экстракта Coptidis Rhizoma или листа плюща, может представлять собой один или более растворителей, выбранных из группы, состоящей из 10-70%-ного (об./об.), предпочтительно 20-60%-ного (об./об.), более предпочтительно 25-55%-ного (об./об.) линейного или разветвленного спирта, имеющего от 1 до 6 атомов углерода, предпочтительно водного раствора пропилового спирта и водного раствора изопропилового спирта и насыщенного водой бутилового спирта.

Объединенный экстракт Coptidis rhizoma с листом плюща может представлять собой смесь экстракта Coptidis rhizoma и экстракта листа плюща или экстракт смеси Coptidis Rhizoma и листа плюща. Например, объединенный экстракт может представлять собой неочищенный экстракт, полученный путем смешивания Coptidis Rhizoma и листа плюща и экстрагирования смеси одним или более растворителями, выбранными из группы, состоящей из воды и линейного или разветвленного спирта, имеющего от 1 до 4 атомов углерода, или растворимый в растворителе экстракт, полученный путем добавления к неочищенному экстракту одного или более растворителей, выбранных из группы, состоящей из водного раствора низшего спирта, имеющего от 1 до 6 атомов углерода, предпочтительно водного раствора пропилового спирта, водного раствора изопропилового спирта и насыщенного водой бутилового спирта.

Предпочтительно, растворитель, используемый для получения неочищенного экстракта Coptidis Rhizoma и листа плюща, может представлять собой воду, 10-70%-ный (об./об.), предпочтительно 20-60%-ный (об./об.), более предпочтительно примерно 25-55%-ный (об./об.) водный раствор метанола или водный раствор этанола или насыщенный водой бутиловый спирт. Растворитель, используемый для получения растворимого в растворителе экстракта, может представлять собой один или более растворителей, выбранных из группы, состоящей из 10-70%-ного (об./об.), предпочтительно 20-60%-ного (об./об.), более предпочтительно примерно 25-55%-ного (об./об.) водного раствора низшего спирта, имеющего от 1 до 6 атомов углерода, предпочтительно водного раствора пропилового спирта, водного раствора изопропилового спирта и насыщенного водой бутилового спирта.

'Фракция' может быть получена путем хроматографирования растворимого в растворителе экстракта на колонке с силикагелем смешанным растворителем из метиленхлорида и метанола (30:1-7:1 (об./об.)).

Экстракт Coptidis Rhizoma, растворимый в растворителе экстракт или фракция, содержит берберин, пальматин, коптизин, колумбамин и ятроризин, предпочтительно берберин (0,5-47,0 частей по массе):пальматин (0,2-21,4 частей по массе):коптизин (0,1-18,0 частей по массе):колумбамин (0,1-3,2 частей по массе):ятроризин (0,1-2,6 частей по массе).

В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу получения объединенного экстракта Coptidis rhizoma с листом плюща, обладающего активностями: противокашлевой, отхаркивающей, антигистаминной, подавления бронхоконстрикции, подавления гиперчувствительности дыхательных путей, подавления бронхиальный окклюзии в легочной ткани и подавления инфильтрации воспалительных клеток.

Способ включает стадию экстрагирования Coptidis Rhizoma, предпочтительно его корневищной части, одним или более растворителями, выбранными из группы, состоящей из воды и линейного или разветвленного спирта, имеющего от 1 до 4 атомов углерода, например воды, 10-70%-ного (об./об.), предпочтительно 20-60%-ного (об./об.), более предпочтительно примерно 25-55%-ного (об./об.) водного раствора метанола или водного раствора этанола или насыщенного водой бутилового спирта.

Способ получения объединенного экстракта Coptidis rhizoma с листом плюща может включать стадии:

экстрагирование высушенного листа плюща одним или более растворителями, выбранными из группы, состоящей из воды и линейного или разветвленного спирта, имеющего от 1 до 4 атомов углерода, например воды, 10-70%-ного (об./об.), предпочтительно 20-60%-ного (об./об.), более предпочтительно 25-55%-ного (об./об.) водного раствора метанола или водного раствора этанола или насыщенного водой бутилового спирта, с получением экстракта листа плюща;

экстрагирование Coptidis Rhizoma, предпочтительно его корневищной части, одним или более растворителями, выбранными из группы, состоящей из воды и линейного или разветвленного спирта, имеющего от 1 до 4 атомов углерода, например воды, 10-70%-ного (об./об.), предпочтительно 20-60%-ного (об./об.), более предпочтительно 25-55%-ного (об./об.) водного раствора метанола или водного раствора этанола или насыщенного водой бутилового спирта, с получением экстракта Coptidis rhizoma; и

смешивание полученного экстракта листа плюща и экстракта Coptidis rhizoma в соотношении от 0,1:1 до 10:1 (масса экстракта листа плюща : масса экстракта Coptidis rhizoma), предпочтительно от 0,2:1 до 5:1, более предпочтительно от 1:1 до 4:1, еще более предпочтительно от 1,5:1 до 3,5:1, наиболее предпочтительно от 2,5:1 до 3,5:1 в расчете на твердое содержимое.

Стадия получения экстракта листа плюща и стадия получения экстракта Coptidis rhizoma может дополнительно включать стадию добавления к полученному экстракту одного или более растворителей, выбранных из группы состоящей из линейного или разветвленного спирта, имеющего от 1 до 6 атомов углерода, предпочтительно насыщенного водой бутилового спирта, пропилового спирта и изопропилового спирта, с получением растворимого в растворителе экстракта.

Стадия получения экстракта листа плюща будет подробно объяснена: лист плюща режут и промывают водой для удаления примесей и сушат, а затем экстрагируют при кипячении с обратным холодильником одним или более растворителями, выбранными из группы, состоящей из воды и линейного или разветвленного спирта, имеющего от 1 до 4 атомов углерода, например воды, 10-70%-ного (об./об.), предпочтительно 20-60%-ного (об./об.), более предпочтительно 25-55%-ного водного раствора метанола или водного раствора этанола или насыщенного водой бутилового спирта, в количестве, кратном примерно 5-20 объемам, предпочтительно 7-15 объемам высушенного листа плюща. Температура экстракции составляет от 40 до 110°С, предпочтительно от 55 до 90°С.

После экстракции экстракт фильтруют для сбора фильтрата и остаток экстрагируют при кипячении с обратным холодильником одним или более растворителями, выбранными из группы, состоящей из воды и линейного или разветвленного спирта, имеющего от 1 до 4 атомов углерода, например воды, 10-70%-ного (об./об.), предпочтительно 20-60%-ного (об./об.), более предпочтительно 25-55%-ного водного раствора метанола или водного раствора этанола или насыщенного водой бутилового спирта, в количестве, кратном примерно 5-15 объемам, предпочтительно 8-12 объемам. Температура экстракции составляет, хотя конкретно и не ограничивается этим, 40-110°С, предпочтительно 55-90°С. После экстракции экстракт фильтруют, фильтрат объединяют с ранее полученным фильтратом и их концентрируют под вакуумом с получением экстракта листа плюща. Двойная экстракция и объединение фильтратов, полученных после каждой экстракции, могут увеличить эффективность экстракции, но число экстракций не ограничивается этим.

Стадия получения экстракта Coptidis rhizoma будет объяснена подробно: корневищную часть Coptidis rhizoma режут на мелкие кусочки, а затем к ней добавляют один или более растворителей, выбранных из группы, состоящей из воды и линейного или разветвленного спирта, имеющего от 1 до 4 атомов углерода, например воды, 10-70%-ного (об./об.), предпочтительно 20-60%-ного (об./об.), более предпочтительно 25-55%-ного водного раствора метанола или водного раствора этанола или насыщенного водой бутилового спирта, в количестве, кратном примерно 3-20 объемам, предпочтительно 5-15 объемам сырья для экстракции в течение 0,5-20 часов, предпочтительно 1-10 часов, более предпочтительно 2-5 часов. Температура экстракции составляет, хотя конкретно и не ограничивается этим, предпочтительно 40-110°С, предпочтительно 55-90°С. Предпочтительно, полученный экстракт фильтруют для сбора фильтрата и к остатку добавляют один или более растворителей, выбранных из группы, состоящей из воды и линейного или разветвленного спирта, имеющего от 1 до 4 атомов углерода, например воды, 10-70%-ного (об./об.), предпочтительно 20-60%-ного (об./об.), более предпочтительно 25-55%-ного водного раствора метанола или водного раствора этанола или насыщенного водой бутилового спирта, в количестве, кратном примерно 5-15 объемам, предпочтительно 8-12 объемам, и температуру увеличивают для повторного экстракции в течение 1-10 часов, предпочтительно 2-5 часов, и затем экстракт фильтруют и концентрируют под вакуумом с получением экстракта Coptidis rhizoma. Объединение полученного экстракта с ранее полученным фильтратом может увеличить эффективность экстракции.

Двойная экстракция и объединение фильтратов, полученных после каждой экстракции, может увеличить эффективность экстракции, но число экстракций не ограничивается этим.

Если количество растворителя, используемого для получения экстракта Coptidis rhizoma и/или экстракта листа плюща, слишком мало, то перемешивание затрудняется и растворимость экстракта уменьшается до нижней эффективности экстракции. Если количество растворителя, используемого для получения экстракта Coptidis rhizoma и/или экстракта листа плюща, слишком велико, то количество низшего спирта, используемого для следующей стадии очистки, увеличивается, что вызывает экономические проблемы и проблемы при обработке. Таким образом, предпочтительно корректировать количество растворителя в пределах описанного выше диапазона.

В соответствии с одним предпочтительным воплощением настоящего изобретения повторная экстракция может быть осуществлена после первичной экстракции, что предотвращает уменьшение эффективности экстракции при осуществлении только первичной экстракции, поскольку в случае, когда экстракт травы производится в большом количестве, даже если достигается эффективная фильтрация, то количество экстракта травы является большим, что приводит к его потерям, и, таким образом, эффективность экстракции уменьшается при осуществлении только первичной экстракции. Поэтому в соответствии с одним предпочтительным воплощением настоящего изобретения повторная экстракция может быть осуществлена после первичной экстракции. Кроме того, в результате определения эффективности экстракции на каждой стадии обнаружили, что примерно 80-90% общего количества экстракта экстрагируется посредством вторичной экстракции и, таким образом, можно предположить, что двухстадийные экстракции обеспечивают существенную экономическую эффективность по сравнению с многоступенчатыми экстракциями с более чем третьей экстракцией.

Растворимый в растворителе экстракт может быть получен путем суспендирования полученного неочищенного экстракта примерно в 2-10-кратном, предпочтительно примерно 3-7-кратном объеме воды и добавления к нему одного или более растворителей, выбранных из группы, состоящей из водного раствора линейного или разветвленного спирта, имеющего от 1 до 6 атомов углерода, предпочтительно водного раствора пропилового спирта или водного раствора изопропилового спирта и насыщенного водой бутилового спирта, в количестве, кратном 0,5-3, предпочтительно эквивалентном количестве, кратном до 2, суспензии от 1 до 5 раз, предпочтительно от 2 до 3 раз, для экстрагирования растворимого в растворителе слоя и затем концентрирования под вакуумом.

Стадию экстракции растворимого в растворителе экстракта с использованием низшего спирта используют для очистки от ненужных примесей, таких как белки, полисахариды, жирные кислоты и тому подобное. Если количество низшего спирта, используемого для этого, мало по сравнению с фильтратом, то образуются мелкие частицы из ненужных ингредиентов, таких как жирные кислоты, которые делают разделение слоев неровным и уменьшают экстрагируемое количество активных ингредиентов. Поэтому может быть предпочтительна корректировка количества низшего спирта в пределах описанного выше диапазона.

Фракцию низшего спирта, полученную после разделения слоев, концентрируют под вакуумом при 50-60°С для удаления остатков растворителя в

образце.

Для того чтобы контролировать содержание оставшегося низшего спирта в полученном концентрате с тем, чтобы сделать его пригодным для применения в качестве сырья для медицины, концентрат может быть подвергнут азеотропному концентрированию примерно в 10-30 раз, предпочтительно в 15-25 раз, более предпочтительно примерно в 20 раз по массе воды в расчете на общее количество концентрата, 1-5 раз, предпочтительно 2-3 раза, и эквивалентное количество воды добавляют к нему для его однородного суспендирования, а затем суспензию лиофилизируют с получением экстракта Coptidis rhizoma и/или экстракта листа плюща в порошковой форме.

Предпочтительно, для однородного объединения каждого экстракта в объединенном экстракте примерно 2-3-кратное количество воды по массе добавляют к объединенному экстракту и затем его концентрируют под вакуумом при 50-60°С, снова добавляют эквивалентное количество воды к концентрату для его однородного суспендирования и затем суспензию лиофилизируют с получением композиции в порошковой форме.

В соответствии с другим воплощением способ получения объединенного экстракта Coptidis rhizoma с листом плюща может включать стадии:

смешивание высушенного листа плюща и Coptidis Rhizoma, предпочтительно его корневищной части, в массовом соотношении 1:4-7:1 (масса листа плюща : масса Coptidis Rhizoma), предпочтительно 1:1-6:1, более предпочтительно 2:1-5:1, с получением смеси листа плюща и Coptidis Rhizoma; и

экстрагирование смеси одним или более растворителями, выбранными из группы, состоящей из воды и линейного или разветвленного спирта, имеющего от 1 до 4 атомов углерода, например воды, 10-70%-ного (об./об.), предпочтительно 20-60%-ного (об./об.), более предпочтительно примерно 25-55%-ного (об./об.) водного раствора метанола или водного раствора этанола или насыщенного водой бутилового спирта.

Указанный выше способ дополнительно может включать стадию добавления одного или более растворителей, выбранных из группы, состоящей из линейного или разветвленного низшего спирта, имеющего от 1 до 6 атомов углерода, предпочтительно пропилового спирта, изопропилового спирта и насыщенного водой бутилового спирта, с получением растворимого в растворителе экстракта после стадии получения экстракта из смеси листа плюща и Coptidis Rhizoma.

Детали стадий получения неочищенного экстракта и растворимого в растворителе экстракта являются такими, как описано при получении каждого травяного экстракта.

Поскольку в настоящем изобретении используют способ экстракции, то может быть использован любой обычно используемый способ. Например, экстракция может быть осуществлена, но не ограничивается этим, посредством экстракции при комнатной температуре, экстракции горячей водой, ультразвуковой экстракции, экстракции при кипячении с обратным холодильником или экстракции охлаждением.

В другом аспекте в настоящем изобретении предложена противокашлевая композиция, содержащая экстракт Coptidis rhizoma или объединенный экстракт Coptidis rhizoma с листом плюща в качестве активного ингредиента. В другом аспекте в настоящем изобретении также предложена отхаркивающая композиция, содержащая экстракт Coptidis rhizoma или объединеный экстракт Coptidis rhizoma с листом плюща в качестве активного ингредиента. В еще одном аспекте в настоящем изобретении также предложена композиция для предупреждения и/или лечения респираторного заболевания, содержащая экстракт Coptidis rhizoma или объединенный экстракт Coptidis rhizoma с листом плюща в качестве активного ингредиента.

В другом аспекте в настоящем изобретении предложен способ подавления кашля, включающий стадию введения экстракта Coptidis rhizoma или объединенного экстракта Coptidis rhizoma с листом плюща пациенту в терапевтически эффективном количестве. В другом аспекте в настоящем изобретении также предложен способ удаления мокроты, включающий стадию введения экстракта Coptidis rhizoma или объединенного экстракта Coptidis rhizoma с листом плюща пациенту в терапевтически эффективном количестве. В еще одном аспекте в настоящем изобретении также предложен способ предупреждения и/или лечения респираторного заболевания, включающий стадию введения экстракта Coptidis rhizoma или объединенного экстракта Coptidis rhizoma с листом плюща пациенту в терапевтически эффективном количестве. Пациент может представлять собой любого млекопитающего, нуждающегося в подавлении кашля, удалении мокроты или лечении и/или предупреждении респираторного заболевания, предпочтительно человека.

Терапевтически эффективное количество представляет собой определенную дозировку для получения желаемого эффекта лечения. Она может варьировать в зависимости от возраста, массы, пола, лекарственной формы, состояния здоровья и тяжести заболевания, а также в зависимости от решения врача или фармацевта. Например, суточная доза может составлять 0,5-500 мг/кг, предпочтительно 1-300 мг/кг, в зависимости от содержания активного ингредиента, но не ограничивается этим. Дозу можно вводить один раз в сутки или несколько раз в сутки. Дозировка иллюстрирует средний случай, и она может быть выше или ниже в зависимости от индивидуума. Если суточная доза композиции, содержащей объединенный экстракт по настоящему изобретению, меньше вышеописанного диапазона, то значительный эффект не может быть получен, а если она превышает вышеописанный диапазон, то экономическая эффективность падает, и доза выходит за пределы обычного диапазона, вызывая таким образом нежелательный побочный эффект. Таким образом, предпочтительно, чтобы суточная доза находилась в вышеописанном диапазоне,

Экстракт Coptidis Rhizoma и объединенный экстракт Coptidis rhizoma с листом плюща демонстрируют активности: противокашлевую, отхаркивающую, антигистаминную, подавления бронхоконстрикции, подавления гиперреактивности дыхательных путей, подавления бронхиальной окклюзии в легочной ткани и подавления инфильтрации воспалительных клеток, и, таким образом, они могут быть использованы для лечения, предупреждения или облегчения соответствующих респираторных заболеваний. И объединенный экстракт Coptidis rhizoma с листом плюща является предпочтительным, поскольку может быть получен синергизм по сравнению с каждым отдельным экстрактом.

Респираторное заболевание может представлять собой любое заболевание, вызывающее кашель и мокроту, и, например, оно выбрано из группы, состоящей из обыкновенного кашля или мокроты; эмфиземы легких, вызывающей кашель или мокроту; бронхита, такого как хронический бронхит, острый бронхит, катаральный бронхит, обструктивное или воспалительное заболевание бронхов и т.д.; астмы, такой как бронхиальная астма, атопическая астма, атопическая бронхиальная lgE-опосредованная астма, неатопическая астма, аллергическая астма, неаллергическая астма и т.д.; хронической или острой бронхоконстрикции; синдрома стертозного дыхания у младенца; хронического обструктивного заболевания легких; бронхиальной аденомы; одиночного легочного узла; туберкулеза легких; пиоторакса; абсцесса легких; простуды; гриппа и легочного гистиоцитоза.

Композиция по настоящему изобретению может быть введена млекопитающим, включая человека, различными путями. Она может быть введена с использованием общепринятых способов, например она может быть введена перорально, ректально или посредством внутривенной, внутримышечной, подкожной, внутриматочной или интрацеребровентрикулярной инъекции. Композиция по настоящему изобретению может быть приготолена в пероральной лекарственной форме, такой как порошок, гранула, таблетка, капсула, суспензия, эмульсия, сироп, аэрозоль и т.д., или в парентеральной лекарственной форме, такой как трансдермальный агент, суппозиторий и стерильный раствор для инъекции и т.д.

Композиция по настоящему изобретению может дополнительно содержать фармацевтически пригодный и физиологически приемлемый адъювант, такой как носитель, эксципиент и разбавители.

Композицию по настоящему изобретению можно вводить отдельно; однако, как правило, с учетом способа введения и стандартной фармацевтической практики, ее можно вводить с выбранным фармацевтическим носителем. Например, композицию можно вводить перорально, интрабуккально или сублингвально в виде таблетки, содержащей лактозу или крахмал, капсулу одну или содержащую эксципиент, эликсир, содержащий ароматизаторы или красители, или суспензию. Жидкий препарат может быть приготовлен с фармацевтически приемлемыми добавками, такими как суспендирующий агент (например, метилцеллюлоза, полусинтетический глицерид, такой как witepsol, или смесь глицеридов, такая как смесь масла из косточек абрикоса и ПЭГ-6 эфира, или смесь ПЭГ-8 и глицерида каприловой/каприновой кислоты).

В другом аспекте в настоящем изобретении предложен здоровый функциональный пищевой продукт для подавления кашля, удаления мокроты или предупреждения или облегчения респираторного заболевания, такого как астма, содержащий экстракт Coptidis rhizoma или объединенный экстракт Coptidis rhizoma с листом плюща. Здоровый функциональный пищевой продукт может представлять собой пищевой продукт, напиток или пищевые добавки и т.д.

Содержание экстракта в качестве активного ингредиента, содержащегося в здоровом функциональном пищевом продукте, может соответственно варьировать в зависимости от вида пищевого продукта, желаемого применения и т.д., без конкретных ограничений. Например, он может быть добавлен в количестве 0,01-15 мас.% от общего количества пищевого продукта, и что касается композиции здорового напитка, то он может быть добавлен в количестве 0,02-10 г, предпочтительно 0,3-1 г, в расчете на 100 мл композиции.

В случае введения травяной композиции по настоящему изобретению в организм человека, с учетом основных свойств натуральных экстрактов, полагают, что она не приводит к побочным эффектам, в отличие от синтетических лекарственных средств, и в результате практического теста на токсичность доказано, что она не влияет на живой организм.

Краткое описание графических материалов

На Фиг.1 представлены отхаркивающие активности экстракта Coptidis rhizoma и активной фракции и их основных ингредиентов посредством способа секреции фенолового красного в мышиной модели.

На Фиг.2 представлены отхаркивающие активности экстрактов, полученных в Примере 2, показывающие результаты измерения, полученные способом с феноловым красным с использованием мыши.

На Фиг.3 представлены противокашлевые активности экстрактов, полученных в Примере 2, показывающие результаты теста на подавление кашля с использованием морской свинки.

На Фиг.4 представлены активности экстрактов, полученных в Примере 2, по подавлению бронхоконстрикции, показывающие релаксацию (%) индуктора констрикции с использованием бронхов, извлеченных из морской свинки.

На Фиг.5 представлены эффекты экстрактов из Примеров 2-7 на бронхиальную окклюзию в легочной ткани и активности в отношении подавления инфильтрации воспалительных клеток в легочной ткани OVA(овальбумин)-сенсибилизированной и тестируемой мыши ((а) нормальная группа, (б) индуцированная группа, (в) положительный контроль, (г) примеры 2-7).

Примеры

Настоящее изобретение будет подробно объяснено со ссылкой на следующие примеры и эксперименты.

Однако следующие примеры и эксперименты предназначены только для иллюстрации настоящего изобретения, и область настоящего изобретения не ограничивается ими.

Пример 1. Получение экстракта Coptidis rhizoma

1-1. Получение экстракта Coptidis rhizoma с использованием воды

1-1-1. Получение неочищенного экстракта Coptidis rhizoma (CR-GA)

Coptidis Rhizoma, приобретенный на рынке Kyungdong, промывали водой для удаления примесей, и 250 г высушенного Coptidis Rhizoma подвергали экстракции горячей водой с использованием 1,5 л воды при 80°С два раза в течение 3 часов и затем экстракт фильтровали и концентрировали под вакуумом с получением 62,5 г неочищенного экстракта (25%-ный выход по сравнению с сырой травой), который назвали 'CR-GA' и использовали в следующем Примере 1-2.

1-1-2. Получение растворимого в растворителе экстракта Coptidis Rhizoma (CR-GA-1)

К 62,5 г CR-GA, полученного в Примере 1-1-1, добавляли 0,5 л воды для его суспендирования и к нему добавляли 1 л насыщенного водой бутилового спирта для разделения слоя два раза и затем собирали только фракцию насыщенного водой бутилового спирта и концентрировали под вакуумом до высушивания. Когда большая часть бутилового спирта и воды испарялась, добавляли 0,4 л воды для его азеотропного концентрирования, которое повторяли дважды. И в конце добавляли 0,1 л дистиллированной воды для суспендирования концентрата и затем суспензию лиофилизировали с получением 19,8 г экстракта Coptidis rhizoma в форме порошка (7,92%-ный выход по сравнению с сырой травой), который назвали 'CR-GA-1' и использовали в качестве образца в следующих экспериментах.

1-2. Получение экстракта Coptidis rhizoma с использованием 50% (об./об.) этанола

1-2-1. Получение неочищенного экстракта Coptidis rhizoma (CR-GB)

Coptidis Rhizoma, приобретенный на Kyungdong рынке, промывали водой для удаления примесей, и 250 г высушенного Coptidis Rhizoma экстрагировали посредством кипячения с обратным холодильником с помощью 2,0 л 50% (об./об.) водного раствора этанола при 80°С два раза в течение 3 часов и затем экстракт фильтровали и концентрировали под вакуумом с получением 57,5 г неочищенного экстракта (23%-ный выход по сравнению с сырой травой), который назвали 'CR-GB' и использовали в следующем Примере 2-2.

1-2-2. Получение растворимого в растворителе экстракта Coptidis Rhizoma (CR-GB-1)

К 57,5 г CR-GB, полученного в Примере 1-2-1, добавляли 0,3 л воды для его суспендирования и к нему добавляли 0,6 л насыщенного водой бутилового спирта для разделения слоя во второй раз и затем собирали только фракцию бутилового спирта и концентрировали под вакуумом до высушивания. Когда большая часть бутилового спирта и воды испарялась, добавляли 0,2 л воды для его азеотропного концентрирования, которое повторяли дважды. И в конце добавляли 0,2 л дистиллированной воды для суспендирования концентрата и затем суспензию лиофилизировали с получением 31,8 г экстракта Coptidis rhizoma в форме порошка (12,7%-ный выход по сравнению с сырой травой), который назвали 'CR-GB-1' и использовали в качестве образца в следующих экспериментах.

1-3. Получение экстракта Coptidis rhizoma с использованием насыщенного водой бутилового спирта

1-3-1. Получение экстракта Coptidis rhizoma (CR-GC)

Coptidis Rhizoma, приобретенный на Kyungdong рынке, промывали водой для удаления примесей, и 250 г высушенного Coptidis Rhizoma экстрагировали посредством кипячения с обратным холодильником с помощью 2,5 л насыщенного водой н-бутилового спирта при 85°С два раза в течение 3 часов и затем экстракт фильтровали и концентрировали под вакуумом. Когда большая часть бутилового спирта испарялась, добавляли 0,2 л воды для его азеотропного концентрирования, которое повторяли дважды. В конце добавляли 0,2 л дистиллированной воды для его суспендирования и суспензию лиофилизировали с получением 32,8 г экстракта в форме порошка (13,1%-ный выход по сравнению с сырой травой), который назвали 'CR-GC' и использовали в следующих экспериментах.

1-4. Разделение экстракта Coptidis rhizoma

20 г CR-GB-1, полученного в Примере 1-2-2, разделяли на 5 фракций посредством хроматографии на колонке с силикагелем, используя смешанный растворитель из метиленхлорида и метанола (от 30:1 до примерно 7:1 (об./об.)). Фр. 1 составляла 0,8 г (далее названа как 'Фр.1'), Фр. 2 составляла 2,6 г (далее названа как 'Фр.2'), Фр. 3 составляла 5,5 г (далее названа как 'Фр.3'), Фр.4 составляла 2,8 г (далее названа как 'Фр.4'), Фр. 5 составляла 6,5 г (далее названа как 'Фр.5'), которые использовали в качестве образцов в следующих экспериментах.

Пример 2. Получение объединенного экстракта Coptidis rhizoma с листом плюща

Получение экстракта листа плюща

Листья плюща (Hedera helix) промывали водой для удаления примесей и полностью высушивали. К 250 г полученных листьев плюща добавляли 3 л 30%-ного (об./об.) водного раствора этанола и экстрагировали при кипячении с обратным холодильником в течение 6 часов и затем экстракт фильтровали для сбора фильтрата. К остатку добавляли 2,5 л 30%-ного (об./об.) водного раствора этанола, экстрагировали при кипячении с обратным холодильником при 80°С в течение 3 часов и полученный фильтрат объединяли с ранее собранным фильтратом и концентрировали его под вакуумом. Когда большая часть растворителя испарялась, добавляли 0,2 л воды для его азеотропного концентрирования, которое повторяли дважды. Добавляли эквивалентное количество воды для его однородного суспендирования и затем суспензию лиофилизировали с получением 42,4 г экстракта листа плюща в форме порошка. Полученный экстракт листа плюща использовали для получения объединенного экстракта в следующих примерах 2-1 - 2-11.

Получение экстракта Coptidis rhizoma

Coptidis rhizoma промывали водой для удаления примесей и полностью высушивали. К 250 г полученного Coptidis rhizoma добавляли 2,0 л 50%-ного (об./об.) водного раствора этанола для экстракции при кипячении с обратным холодильником при 80°С в течение 3 часов. И затем экстракт фильтровали и концентрировали под вакуумом с получением 57,5 г неочищенного экстракта. К нему добавляли 0,3 л воды для его суспендирования и к нему добавляли 0,6 л насыщенного водой бутилового спирта для разделения слоя во второй раз. Затем собирали только фракцию бутилового спирта и концентрировали под вакуумом до высушивания. Когда большая часть бутилового спирта и воды испарялась, добавляли 0,2 л воды для его азеотропного концентрирования, которое повторяли дважды. В конце к нему добавляли эквивалентное количество воды для его суспендирования и суспензию лиофилизировали с получением 31,8 г Coptidis Rhizoma, который использовали для получения объединенного экстракта в следующих примерах от 2-1 до 2-11.

2-1. Получение объединенного экстракта (0.2:1)

Полученные выше экстракт листа плюща и экстракт Coptidis rhizoma смешивали в массовом соотношении 0,2:1 (масса экстракта листа плюща : масса экстракта Coptidis rhizoma). Для однородного смешивания к объединенному экстракту добавляли примерно 2-3-кратную массу воды и затем его концентрировали под вакуумом при температуре 50-60°С. К полученному концентрату снова добавляли эквивалентное количество воды для его однородного суспендирования и суспензию лиофилизировали с получением объединенного экстракта в форме порошка.

2-2. Получение объединенного экстракта (0.4:1)

Объединенный экстракт готовили таким же способом, как описано выше для получения Примера 1, за исключением того, что соотношение полученного экстракта листа плюща и экстракта Coptidis rhizoma изменяли на 0,4:1 (масса экстракта листа плюща : масса Coptidis Rhizoma).

2-3. Получение объединенного экстракта (1:1)

Объединенный экстракт готовили таким же способом, как описано выше для получения Примера 1, за исключением того, что соотношение полученного экстракта листа плюща и экстракта Coptidis rhizoma изменяли на 1:1 (масса экстракта листа плюща : масса Coptidis Rhizoma).

2-4. Получение объединенного экстракта (1,5:1)

Объединенный экстракт готовили таким же способом, как описано выше для получения Примера 1, за исключением того, что соотношение полученного экстракта листа плюща и экстракта Coptidis rhizoma изменяли на 1,5:1 (масса экстракта листа плюща : масса Coptidis Rhizoma).

2-5. Получение объединенного экстракта (2:1)

Объединенный экстракт готовили таким же способом, как описано выше для получения Примера 1, за исключением того, что соотношение полученного экстракта листа плюща и экстракта Coptidis rhizoma изменяли на 2:1 (масса экстракта листа плюща : масса Coptidis Rhizoma).

2-6. Получение объединенного экстракт (2,5:1)

Объединенный экстракт готовили таким же способом, как описано выше для получения Примера 1, за исключением того, что соотношение полученного экстракта листа плюща и экстракта Coptidis rhizoma изменяли на 2,5:1 (масса экстракта листа плюща : масса Coptidis Rhizoma).

2-7. Получение объединенного экстракта (3:1)

Объединенный экстракт готовили таким же способом, как описано выше для получения Примера 1, за исключением того, что соотношение полученного экстракта листа плюща и экстракта Coptidis rhizoma изменяли на 3:1 (масса экстракта листа плюща : масса Coptidis Rhizoma).

2-8. Получение объединенного экстракта (3.5:1)

Объединенный экстракт готовили таким же способом, как описано выше для получения Примера 1, за исключением того, что соотношение полученного экстракта листа плюща и экстракта Coptidis rhizoma изменяли на 3,5:1 (масса экстракта листа плюща : масса Coptidis Rhizoma).

2-9. Получение объединенного экстракта (4:1)

Объединенный экстракт готовили таким же способом, как описано выше для получения Примера 1, за исключением того, что соотношение полученного экстракта листа плюща и экстракта Coptidis rhizoma изменяли на 4:1 (масса экстракта листа плюща : масса Coptidis Rhizoma).

2-10. Получение объединенного экстракта (4.5:1)

Объединенный экстракт готовили таким же способом, как описано выше для получения Примера 1, за исключением того, что соотношение полученного экстракта листа плюща и экстракта Coptidis rhizoma изменяли на 4,5:1 (масса экстракта листа плюща : масса Coptidis Rhizoma).

2-11. Получение объединенного экстракта (5:1)

Объединенный экстракт готовили таким же способом, как описано выше для получения Примера 1, за исключением того, что соотношение полученного экстракта листа плюща и экстракта Coptidis rhizoma изменяли на 5:1 (масса экстракта листа плюща : масса Coptidis Rhizoma).

Пример 3. Экспериментальное определение активности экстракта

Coptidis rhizoma

3-1. Измерение отхаркивающей активности экстракта Coptidis rhizoma

Экспериментальный способ

Для измерения отхаркивающих активностей экстрактов Coptidis rhizoma из Примеров 1-1 - 1-3 проводили эксперимент, используя способ Engler и др. (Engler Н, Szelenyi I, J.Pharmacol. Moth. 11, 151-157, 1984; Bao-quin Lin et., Pulmonary Pharmacology & Therapeutics 21, 259-263, 2008) в следующей процедуре.

Лекарственное средство, служащее положительным контролем (амброксол, Sigma), и тестируемые лекарственные средства (экстракт Coptidis Rhizoma из Примеров 1-1 - 1-3) перорально вводили мыши-самцу (возраст 8 недель, Sam tako BioKorea) и через 30 минут вводили внутрибрюшинно 500 мг/кг фенолового красного (феноловый красный растворяли в физиологическом растворе). Через 30 минут мышь подвергали анестезии диэтиловым эфиром, обескровливали путем разрезания брюшной аорты и затем производили резекцию всей трахеи. Выделенную трахею помещали в 1 мл физиологического раствора и промывали в течение 30 минут, центрифугировали при 10000 об/мин при комнатной температуре в течение 5 минут, добавляли 1 н. гидроксид натрия (NaOH) к супернатанту (добавление 0,1 мл 1 н. NaOH на 1 мл супернатанта) и затем измеряли поглощение при 546 нм для определения отхаркивающей активности по концентрации фенолового красного.

Результаты эксперимента

Полученные результаты представлены в следующей Таблице 1.

Таблица 1   доза (мг/кг) Способность секретировать мокроту (%) Пример 1-1 CR-GA 500 29   CR-GA-1 500 36 Пример 1-2 CR-GB 500 32   CR-GB-1 500 41 Пример 1-3 CR-GC 500 38 Положительный контроль (Амброксол) 250 32

Как следует из эксперимента, представленного в Таблице 1 выше, экстракты в целом имели превосходные активности, особенно CR-GB-1 из Примера 2 показал совершенно исключительную активность в отношении секреции мокроты.

Измеряли активности CR-GC-1 из Примера 2 в соответствии с дозой (50, 100, 150, 200, 500 мг/кг), эти результаты представлены в следующей Таблице 2.

Таблица 2   Доза (мг/кг) Способность секретировать мокроту (%) Пример 1-2 CR-GB-1 50 4     100 22 150 32 200 33 500 41 Положительный контроль (Амброксол) 250 30

Как следует из эксперимента, представленного в Таблице 2 выше, CR-GB-1 из Примера 1-2 продемонстрировал совершенно исключительную активность в отношении секреции мокроты при дозировке 500 мг/кг.

3-2. Измерение противокашлевой активности экстракта Coptidis rhizoma

Экспериментальный способ

Для измерения противокашлевой активности экстрактов Coptidis rhizoma из Примеров 1-1 - 1-3 проводили эксперимент, используя способ Tanaka и др. (Motomu Tanaka and Kei Maruyama, J.Pharmacol. Sci. 93, 465-470, 2003, Daoui, Cognon, Naline et., Am. J. Respir. Crit. Care. Med. 158, 42-48, 1998) в следующей процедуре.

Тестируемое лекарственное средство перорально вводили морской свинке-самцу (возраст 6 недель, Sam tako BioKorea) и через 1 час морскую свинку помещали в камеру плетизмографа (Вuхсо, США) и затем распыляли индуктор кашля лимонную кислоту (Sigma) для того, чтобы вызвать кашель. В качестве положительного контроля использовали теобромин (Sigma), используемый в качестве противокашлевого средства. Морскую свинку подвергали воздействию 0,2 М лимонной кислоты в течение 10 минут и уровень наблюдающегося кашля измеряли в течение 15 минут.

Экспериментальный результат

Результаты представлены в следующей Таблице 3.

Таблица 3   доза (мг/кг) Способность подавлять кашель (%) Пример 1-1 CR-GA 200 33   CR-GA-1 200 46 Пример 1-2 CR-GB 200 35   CR-GB-1 200 52 Пример 1-3 CR-GC 200 44 Положительный контроль (Теобромин) 50 57

Как следует из экспериментов, представленных в Таблице 3 выше, экстракты в целом имели превосходные активности, и особенно CR-GB-1 из Примера 1-2 продемонстрировал совершенно исключительную активность в отношении подавления кашля.

Активности CR-GB-1 из Примера 1-2 измеряли в соответствии с дозой (50, 100, 150, 200 мг/кг), эти результаты представлены в следующей Таблице 4.

Таблица 4   доза (мг/кг) Способность подавлять кашель (%) Пример 1-2 CR-GB-1 50 7     100 25 150 37 200 52 Положительный контроль (Теобромин) 50 57

Как следует из эксперимента, показанного в Таблице 4 выше, CR-GB-1 из Примера 1-2 продемонстрировал совершенно исключительную активность в отношении подавления кашля при дозировке 200 мг/кг.

3-3. Измерение антигистаминной активности экстракта Coptidis rhizoma

Экспериментальный метод

Для измерения антигистаминной активности экстракта Coptidis rhizoma из Примеров 1-1 - 1-3 проводили эксперимент, используя способ Honuchi и др. (Masako Honuchi and Yoshiyuki Seyama, J.Health Sci., 52(6), 711-717, 2006, Naoki Inagaki et al. Biol. Pharm. Bull. 24(7), 829-834, 2001) в следующей процедуре.

Антигистаминный эффект измеряли с использованием перитонеальных тучных клеток самца крысы (возраст 7 недель, Sam tako BioKorea), сенсибилизированных овальбумином. В качестве положительного контроля использовали кетотифен (Sigma). Крысе, сенсибилизированной овальбумином, перорально вводили кетотифен в концентрации 5 мг/кг, и тестируемые лекарственные средства вводили перорально соответственно в концентрации 200 мг/кг в течение 4 суток и затем выделяли перитонеальные тучные клетки. Выделенные перитонеальные тучные клетки (2×10⁵ клеток/мл) обрабатывали кетотифеном в концентрациях 0,01 мг/мл, 0,1 мг/мл и 1,0 мг/мл и тестируемыми лекарственными средствами в концентрациях 0,1 мг/мл, 1,0 мг/мл и 10 мг/мл. В конце тучные клетки обрабатывали соединением 48/80 (Sigma), которое активирует неиммунологическое высвобождение гистамина в концентрации 10 мкг/мл. На данном этапе определяли количество гистамина, высвобожденного из тучных клеток, для того, чтобы выяснить, подавляют ли тестируемые вещества высвобождение гистамина из тучных клеток. Измеряли относительное количество гистамина, высвобожденного из тучной клетки у крысы, которой не вводили никакого лекарственного средства, эти результаты представлены в следующей Таблице 5.

Таблица 5   Пероральная доза (мг/кг) Концентрация для обработки тучных клеток (мг/мл) Количество высвобожденного гистамина (%) Пример 1-1 CR-GA 200 0 41       0,1 38 1,0 33 10,0 26   CR-GA-1 200 0 44     0,1 35 1,0 29 10,0 23 Пример 1-2 CR-GB 200 0 42       0,1 38 1,0 31 10,0 27 CR-GB-1 200 0 39     0,1 34 1,0 27 10,0 21 Пример 1-3 CR-GC 200 0 41       0,1 37 1,0 30 10,0 22 Положительный контроль (Кетотифен) 5 0 43       0,01 41 0,1 32 1,0 18

Как следует из экспериментов, показанных в Таблице 5 выше, экстракты в целом имели превосходные активности, и особенно CR-GB-1 из Примера 1-2 продемонстрировал совершенно исключительную антигистаминную активность.

И активности CR-GB-1 из Примера 1-2 измеряли в соответствии с дозой (100, 200, 400 мг/кг), эти результаты представлены в следующей Таблице 6.

Таблица 6   Пероральная доза (мг/кг) Концентрация для обработки тучных клеток (мг/мл) Количество высвобожденного гистамина (%) Пример 1-2 CR-GB-1 100 0 49       0,1 40       1,0 36 10,0 30 200 0 42   0,1 34 1,0 27 10,0 21 400 0 31   0,1 26 1,0 23 10,0 18 Положительный контроль (Кетотифен) 5 0 43       0,01 41 0,1 32 1,0 18

Как следует из экспериментов, показанных в Таблице 6 выше, CR-GB-1 из Примера 1-2 продемонстрировал совершенно исключительную антигистаминную активность при дозировке 400 мг/кг.

3-4. Измерение противокашлевых активностей активных подфракций

Для измерения противокашлевых активностей 5 подфракций, полученных в указанном выше Примере 1-4, проводили эксперимент в отношении противокашлевой активности таким же способом, как в Эксперименте 3-2, эти результаты представлены в следующей Таблице 7.

Таблица 7   доза (мг/кг) Способность подавлять кашель (%) Фр.1 60 41 Фр.2 60 32 Фр.3 60 62 Фр.4 60 34 Фр.5 60 24 Положительный контроль Теобромин 50 57

Как следует из эксперимента, представленного в Таблице 7, фракции в целом имели превосходные активности, и особенно Фр.3 продемонстрировала совершенно исключительную противокашлевую активность.

3-5. Измерение антигистаминных активностей в активных подфракциях

Для измерения антигистаминных активностей 5 подфракций, полученных в Примере 1-4 выше, проводили такой же эксперимент, как описанный выше Эксперимент 3-3, эти результаты представлены в следующей Таблице 8.

Таблица 8   Пероральная доза (мг/кг) Концентрация для обработки тучных клеток (мг/мл) Количество освобожденного гистамина (%) Фр.1 60 0 55 0,1 50 1,0 42 10,0 39 Фр.2 60 0 59 0,1 54 1,0 48 10,0 41 Фр.3 60 0 38 0,1 31 1,0 26 10,0 19 Фр.4 60 0 56 0,1 50 1,0 44 10,0 40 Фр.5 60 0 66 0,1 62 1,0 55 10,0 51 Положительный контроль (Кетотифен) 5 0 43 0,01 41 0,1 32 1,0 18

Как следует из эксперимента, представленного в Таблице 8 выше, фракции в целом имели превосходные активности, и, в частности, Фр.3 продемонстрировала совершенно исключительную антигистаминную активность.

3-6. Анализ соединений из экстракта Coptidis rhizoma

Для анализа соединений из экстрактов Coptidis rhizoma и их фракций из приведенных выше примеров проводили эксперименты с использованием физико-химического анализа, такого как ВЭЖХ, ЖХ/МС, УФ-спектрометрия и Фурье-ЯМР.

В результате установили, что берберин, пальматин, коптизин, колумбамин и ятроризин содержатся в экстракте Coptidis rhizoma. Проанализировали содержание соединений из экстрактов Coptidis из Примеров 1-1 - 1-4, эти результаты представлены в следующей Таблице 9.

Высокоэффективную жидкостную хроматографию измеряли с использованием модели Waters Alliance 2695, использующей Waters PDA 2996. В качестве колонки использовали YMC Hydrosphere C18, S-5 мкм, 120 нм, I.D. (внутренний диаметр) 4,6×250 мм и температуру образца поддерживали при 25°С±1 и температуру колонки поддерживали при 30°С±1. Концентрация образца составляла 1 мг/мл, количество инъекции составляло 10 мкл, и скорость потока составляла 1,0 мл/мин. В качестве стандартных веществ берберин, пальматин и коптизин приобретали у компании Sigma и использовали, что касается колумбамина и ятроризина, то использовали очищенные из Coptidis Rhizoma. Подвижная фаза представляла собой градиент 0,2%-ного раствора фосфорной кислоты (растворитель А) и метанола (растворитель В) от 0 до примерно 60 минут (A:B = от 9:1 до примерно 6:4), от 60 до примерно 70 минут (A:B = от 6:4 до примерно 5:5), от 70 до примерно 90 минут (A:B = от 5:5 до примерно 0:10). Содержания соединений в экстрактах указаны с помощью соотношения площадей для каждого стандартного вещества в массовых процентах.

Таблица 9   Содержания соединений (%)     берберин пальматин коптизин колумбамин ятроризин Пример 1-1 CR-GA 15,6 4,2 4,3 0,6 0,6   CR-GA-1 25,3 4,5 4,7 0,6 0,5 Пример 1-2 CR-GB 22,8 5,6 6,5 1,5 0,9   CR-GB-1 27,0 7,1 5,2 0,9 0,8 Пример 1-3 CR-GC 30,9 7,8 6,2 1,1 1,0 Пример 1-4 Фр.1 0,5 0,2 0,1 0,1 0,1 Фр.2 10,1 6,7 0,8 0,1 0,1 Фр.3 47,0 21,4 3,7 3,2 1,5 Фр.4 5,2 1,4 18,0 0,1 2,6 Фр.5 0,1 или меньше 0,1 или меньше 0,1 или меньше 0,1 или меньше 0,1 или меньше

Как показано в Таблице 9 выше, в результате сравнения содержаний основных соединений, соответствующих экстрактам и фракциям, установили, что содержалось 0,5-47,0 частей по массе берберина, 0,2-21,4 частей по массе пальматина, 0,1-18,0 частей по массе коптизина, 0,1-3,2 частей по массе колумбамина и 0,1-2,6 частей по массе ятроризина.

3-7. Измерение отхаркивающей активности берберина

Для измерения отхаркивающих активностей экстрактов Coptidis rhizoma из Примеров 1-2 и 1-3 и 5 подфракций, полученных в Примере 1-4, проводили такой же эксперимент в отношении отхаркивающей активности, как Эксперимент 1 выше, результаты представлены в следующей Таблице 10, а гистограмма активностей показана на Фиг.1.

Таблица 10   доза (мг/кг) Способность выделять мокроту (%) Фр.1 125 25 Фр.2 125 22 Фр.3 125 44 Фр.4 125 24 Фр.5 125 10 CR-СВ из Примера 1-2 125 32 CR-GB-1 из Примера 1-2 125 38 CR-GC из Примера 1-3 125 37 Берберин 125 39 Положительный контроль Амброксол 250 34

Пример 4. Тест на активность объединенного экстракта Coptidis rhizoma с листом плюща

4-1. Измерение отхаркивающей активности

Для оценки отхаркивающих активностей объединенного экстракта и одиночного экстракта, полученного в Примере 2 (2-1 - 2-11), эксперимент проводили таким же образом, как описано в Экспериментальном способе Эксперимента 3-1, используя способ Engler и др. (Engler H, Szelenyi I, J.Pharmacol. Moth.11, 151-157, 1984, Bao-quin Lin et., Pulmonary Pharmacology & Therapeutics 21, 259-263, 2008), результаты которого показаны на Фиг.2. На Фиг.2 для положительного контроля амброксол перорально вводили в дозе 250 мг/кг и остальные тестируемые лекарственные средства перорально вводили в дозе 500 мг/кг. Для экстракта из Примера 2-7, демонстрирующего совершенно исключительную активность, отхаркивающие активности измеряли в соответствии с дозой, эти результаты представлены в следующей Таблице 11.

Таблица 11   доза (мг/кг) Способность выделять мокроту (%) Пример 2-7 50 17 100 30 150 38 200 44 500 56 Положительный контроль Амброксол 250 34

Как показано на Фиг.2, все объединенные экстракты из Примеров 2-1 - 2-11 демонстрировали улучшенные отхаркивающие эффекты по сравнению с одним экстрактом листа плюща, из чего можно было установить, что синергизм в отношении фармакологической активности наблюдается за счет объединения экстракта Coptidis rhizoma и экстракта листа плюща.

В частности, Примеры 2-3 - 2-9 демонстрировали совершенно исключительные отхаркивающие эффекты по сравнению с имеющимся отхаркивающим амброксолом, из чего видно, что если экстракт листа плюща и экстракт Coptidis rhizoma объединяют в массовом соотношении 1:1-4:1, то могут быть получены гораздо большие отхаркивающие эффекты.

В Таблице 11 выше показаны результаты оценок активностей Примера 2-7, имеющего наибольшую активность в соответствии с дозой, и установили, что вещество из Примера 2-7 имеет совершенно исключительную способность секретировать мокроту по сравнению с лекарственным средством, служащим положительным контролем. В частности, вещество из Примера 2-7 демонстрирует похожий эффект для положительного контроля при дозировке 100 мг/кг или более и совершенно исключительный эффект по сравнению с положительным контролем при дозировке 150 мг/кг или более.

4-2. Измерение противокашлевой активности

Для измерения противокашлевых активностей экстракта листа плюща и объединенного экстракта Coptidis rhizoma с листом плюща (Примеры 2-1 - 2-11), полученных в Примере 2, проводили эксперимент таким же способом, как описано [Экспериментальныйспособ] в Эксперименте 3-2, используя способ Tanaka и др. (Motomu Tanaka and Kei Maruyama, J. Pharmacol. Sci. 93, 465-470, 2003, Daoui, Cognon, Naline et., Am. J. Respir. Crit. Care. Med. 158, 42-48, 1998), результаты которого представлены на Фиг.3.

На Фиг.3 используемый в качестве положительного контроля теобромин перорально вводили в концентрации 50 мг/кг и остальные тестируемые лекарственные средства перорально вводили в концентрации 200 мг/кг. И для Примера 2-7, демонстрирующего совершенно исключительную активность, противокашлевые активности оценивали в соответствии с дозой, эти результаты представлены в следующей Таблице 12.

Таблица 12   доза (мг/кг) Способность подавлять кашель (%) Пример 2-7 50 29 100 51 150 69 200 83 Положительный контроль Теобромин 50 56

Как показано на Фиг.3, все объединенные экстракты из Примеров 2-1 - 2-11 демонстрировали повышенные противокашлевые эффекты по сравнению с одним экстрактом листа плюща, из чего можно устанавить, что синергизм для фармакологической активности наблюдается благодаря комбинации экстракта Coptidis rhizoma с экстрактом листа плюща. В частности, Примеры 2-3 - 2-9 демонстрировали более значительные противокашлевые эффекты, чем существующий противокашлевый теобромин, из чего ясно, что если экстракт листа плюща и экстракт Coptidis rhizoma объединены в массовом соотношении 1:1-4:1, то могут быть получены более значительные противокашлевые эффекты.

И в Таблице 12 выше представлены результаты оценки активностей Примера 2-7, имеющего самую высокую активность в соответствии с дозой, из чего следует, что вещество из Примера 2-7 демонстрирует похожий эффект для положительного контроля при дозировке 100 мг/кг или более и более значительный эффект по сравнению с положительным контролем при дозировке 150 мг/кг.

4-3. Измерение антигистаминного эффекта

Для измерения антигистаминного эффекта экстракта листа плюща и объединенного экстракта Coptidis rhizoma с листом плюща (Примеры 2-1 - 2-11), полученных в Примере 2 в тучной клетке, проводили эксперимент таким же способом, как описано в [Экспериментальный способ] в Эксперименте 3-3, используя способ Honuchi и др. (Masako Honuchi and Yoshiyuki Seyama, J. Health Sci., 52(6), 711-717, 2006, Naoki Inagaki et. Biol. Pharm. Вull). 24(7), 829-834, 2001), результаты которого представлены в следующей Таблице 13. И для Примера 2-7, демонстрирующего совершенно исключительную активность, антигистаминные эффекты измеряли в соответствии с дозой, и результаты представлены в следующей Таблице 14.

Таблица 13   Пероральная доза (мг/кг) Концентрация для обработки тучных клеток (мг/мл) Количество высвобожденного гистамина (%) Пример 2-1 200 0 48 0,1 42 1,0 39 10,0 32 Пример 2-2 200 0 47 0,1 41 1,0 38 10,0 31 Пример 2-3 200 0 41 0,1 37 1,0 34 10,0 28 Пример 2-4 200 0 39 0,1 37 1,0 33 10,0 26 Пример 2-5 200 0 37 0,1 34 1,0 31 10,0 25 Пример 2-6 200 0 36 0,1 34 1,0 31     10,0 24 Пример 2-7 200 0 34 0,1 32 1,0 29 10,0 20 Пример 2-8 200 0 35 0,1 33 1,0 30 10,0 22 Пример 2-9 200 0 38 0,1 35 1,0 31 10,0 27 Пример 2-10 200 0 42 0,1 39 1,0 36 10,0 31 Пример 2-11 200 0 49 0,1 44 1,0 39 10,0 30 Экстракт листа плюща 200 0 45 0,1 40 1,0 35 10,0 34 Положительный контроль Кетотифен 5 0 44 0,01 41 0,1 32 1,0 19

Таблица 14   Пероральная доза (мг/кг) Концентрация для обработки тучных клеток (мг/мл) Количество высвобожденного гистамина (%) Пример 2-7 100 0 49 0,1 39 1,0 35 10,0 34 200 0 34 0,1 32 1,0 29 10,0 20 400 0 21 0,1 18 1,0 17 10,0 17 Экстракт листа плюща 200 0 45 0,1 40 1,0 35 10,0 34 Положительный контроль Кетотифен 5 0 44 0,01 41 0,1 32 1,0 19

Как показано в Таблице 13, установили, что экстракт листа плюща и объединенные экстракты из Примеров 2-1 - 2-11 обладают антигистаминным эффектом. В частности, показано, что если экстракт листа плюща и экстракт Coptidis rhizoma соответственно, демонстрирующие антигистаминную активность, объединяют, то наблюдается синергизм. И в Таблице 14 выше представлены результаты оценки Примера 2-7, обладающего совершенно исключительной активностью в соответствии с дозой, и показано, что вещество Примера 2-7 демонстрирует превосходную антигистаминную активность.

4-4. Эксперимент на подавление бронхоконстрикции (in vitro)

Для измерения эффектов подавления бронхоконстрикции для экстракта листа плюща и объединенных экстрактов Coptidis Rhizoma с листом плюща (Примеры 2-1 - 2-11), полученных в Примере 2, проводили эксперимент, используя способ Casoni GL и др. (Clin Exp Allergy, 33, 999-1004, 2003, Anesth Analg., 89, 191-196,1999, Br J Pharmacol., 128, 577-584, 1999) в следующей процедуре.

Фенобарбитал натрия (75 мг/кг) вводили внутрибрюшинно самцу морской свинки Hartely (350~400 г, Daehan Biolink) для его анестезии, а затем извлекали трахею. Извлеченную трахею нарезали на примерно 3~5 мм в растворе Кребса-Хензелайта для разделения на сегменты и затем фиксировали в ванне для органов и перфузировали 10^-4 М гистамином для сокращения извлеченной трахеи. А затем к ней добавляли экспериментальное вещество (0,50 мг/мл) для измерения изменения степени натяжения извлеченной трахеи. В качестве положительного контроля использовали лекарственное средство, натрия нитропруссида дигидрат, в концентрации 2,6×10^-5 мг/мл. Принимая сокращение, индуцированное 10^-4 М гистамином, за 100%, вычисляли степени релаксации (%) в группах, которым вводили экспериментальное вещество, и в группе, которой вводили лекарственное средство, используемое в качестве положительного контроля, путем вычитания степени релаксации (%) эксципиентной контрольной группы из степени релаксации (%) группы, которой вводили экспериментальное вещество, и группы, которой вводили лекарственное средство, используемое в качестве положительного контроля, полученных в тех же условиях. Вычисленные степени релаксации бронхов (активность в отношении подавления бронхоконстрикции) были показаны на Фиг.4, и для Примера 2-7, демонстрирующего совершенно исключительную активность, степени релаксации трахеи измеряли в соответствии с дозой, и результаты представлены в следующей Таблице 15.

Таблица 15   Концентрация (мг/мл) Степень релаксации бронхов (%) Пример 2-7 0,25 20 0,50 48 1,00 83 Группа положительного контроля SNP 2,6×10^-5 30

Как показано на Фиг.4, установили, что экстракт листа плюща и объединенные экстракты из Примеров 2-1 - 2-11 обладают эффектом подавления бронхоконстрикции. Показано, что все объединенные экстракты из Примеров 2-1 - 2-11 демонстрируют большее подавление бронхоконстрикции, чем только экстракт лист плюща. В Таблице 15 выше представлены результаты оценки активностей Примера 2-7, обладающего совершенно исключительными активностями в соответствии с дозой, из чего видно, что вещество из Примера 2-7 демонстрирует превосходное подавление бронхоконстрикции.

4-5. Эксперимент на противоастматический эффект с использованием мышиной модели астмы

Для того чтобы подтвердить противоастматический эффект объединенного экстракта из Примера 2-7, который демонстрировал совершенно исключительные эффекты в Экспериментах 4-1 - 4-4 с использованием мышиной модели астмы, проводили эксперимент, используя способ Tang M.L.K. и др. (Pulmonary Pharmacology & Therapeutics, 14, 203-210, 2001, Immunology and Cell Biology 79, 141-144, 2001, Journal of Experimental Medicine 189(10), 1621-1629, 1999). Для оценки проводили определение гиперчувствительности дыхательных путей (AHR) к метахолину, определение уровня IgE в плазме крови, определение количества клеток и распределения лейкоцитов в жидкости бронхоальвеолярного лаважа (BALF), наблюдение за легочной тканью и ОТ-ПЦР (полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией) (IL-1β, IL-4, IL-13r2a).

Экспериментальный способ

Мыши Balb/c (18-21 г, Orientbio Inc.) вводили внутрибрюшинно раствор овальбумина (OVA, Sigma), приготовленный для внутрибрюшинной инъекции, в количестве 500 мкл (20 мкг OVA) на одну мышь на 0-е сутки и 7-е сутки, и ее сенсибилизировали раствором, приготовленным для ингаляции OVA, с использованием небулайзера (NE-U17, OMRON Co. Ltd, Япония), и затем полученный 5%-ный раствор OVA использовали для ингаляции каждые сутки в течение 30 минут с 14-х суток до 20-х суток. В качестве положительного контроля использовали лекарственное средство, 30 мг/кг монтелукаста натрия, и все экспериментальные вещества использовали в количестве 200 мг/кг. Лекарственное средство, используемое в качестве положительного контроля, и экспериментальные вещества вводили перорально каждые сутки за один час до ингаляции OVA в течение 7 суток с 14-х суток до 20-х суток после сенсибилизации и затем эксперименты проводили по следующим пунктам оценки.

1) Определение гиперчувствительности дыхательных путей (AHR) к метахолину

Через 24 часа после последней ингаляции OVA (на 21-е сутки) мышь помещали в плетизмограф для целого организма (BUXCO, США), 0,4 мл каждого из растворов метахолина в концентрациях 0,10 и 20 мг/мл брали для введения в аэрозоле и мышь подвергали ингаляции соответственно в течение 3 минут. И PenH измеряли в течение 4 минут от времени ингаляции, и среднее значение установили как PenH (увеличенная пауза) при соответствующей дозе метахолина.

2) Определение уровня IgE в плазме крови (21-е сутки)

У животного, которого измеряли в соответствии с 1), собирали примерно 0,05 мл крови посредством забора глазничной крови и центрифугировали, и полученную плазму делили на две части и разбавляли 1:10 для определения уровня иммуноглобулина E(IgE) в плазме посредством IgE твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA; набор IgE ELISA для мыши, МЕ-151, SHIBAYAGI Co., Ltd., Япония).

3) Определение количества клеток и распределения лейкоцитов в жидкости бронхоальвеолярного лаважа (BALF) (22-е сутки)

Животным, кровь которых брали в соответствии с 2), внутрибрюшинно вводили пентонал натрия (50 мг/кг) для их анестезии. Затем, фиксируя левое легкое щипцами, вводили 0,4 мл раствора PBS в бронх и легкое и затем извлекали и брали вымытый раствор, что повторяли трижды. Раствор центрифугировали при 1500 g и супернатант удаляли, и затем 0,2 мл PBS добавляли к осадку для его повторного суспендирования. В суспензии общее количество лейкоцитов, нейтрофилов, эозинофилов и лимфоцитов измеряли с использованием автоматизированного гематологического анализатора (Advia 120 coulter counter, BAYER, Германия).

4) Исследование легочной ткани

Левое легкое, зафиксированное щипцами, вынимали и фиксировали 10%-ным раствором формалина в течение 1 суток и затем пропитанную парафином ткань с использованием гистопроцессора разрезали до толщины 3-4 мкм с помощью микротома с получением фрагментов ткани. Полученный срез окрашивали эозином и покровное стекло покрывали бальзамом и исследовали с помощью микроскопа степень окклюзии бронхиолы и инфильтрацию воспалительных клеткок.

5) ОТ-ПЦР

Ткань правого легкого быстро извлекали и хранили при -80°С до эксперимента. РНК выделяли из ткани с помощью RNA-Bee (Tel-Test Inc. USA), и количество выделенной РНК определяли при 260 нм с использованием спектрофотометра, и затем 4 мкг РНК и 2 мкл олиго-dT (Promega) доводили DEPC (диэтилпирокарбонат) водой до 10 мкл и смесь подвергали реакции при 65°С в течение 5 минут. Затем добавляли 5 мкл 5х реакционного буфера + 2 мкл RTase (ревертазы) + 5 мкл dNTP + 1 мкл ингибитора РНКазы + 2 мкл DEPC воды и 25 мкл общей смеси подвергали реакции при 42°С в течение 1 часа и при 100°С в течение 5 минут с получением кДНК. Все используемые реагенты приобретали у Promega. ПЦР осуществляли с полученными праймерами (IL-1β, IL-4, IL-13r2a). Использовали следующие праймеры:

IL-1β прямой: 5'-TCATGGGATGATGATGATAACCTGCT-3' (SEQ NO: 1),

IL-1β обратный: 5'-CCCATACTTTAGGAAGACACGGATT-3' (SEQ NO: 2);

IL-4 прямой: 5'-TCATCGGCATTTTGAACGAG-3' (SEQ NO: 3),

IL-4 обратный: 5'-GAATCCAGGCATCGAAAAGC-3' (SEQ NO: 4);

IL-13r2a прямой: 5'-GGTTATGCCAAATGCACTTGAG-3' (SEQ NO: 5),

IL-13r2a обратный: 5'-ATGGCTTTTTGTGCATATCAGAT-3' (SEQ NO: 6).

Условия ПЦР представляют собой 32 цикла 94°С по 30 секунд, 56°С по 30 секунд и 72°С по 1 минуте. ПЦР-продукт подвергали электрофорезу на 2%-ном агарозном геле и окрашивали EtBR и затем облучали УФ, и плотность сравнивали и разделяли по плотности актина для анализа значения.

Экспериментальные результаты

1) Определение гиперчувствительности дыхательных путей (AHR) к метахолину

Гиперчувствительность дыхательных путей к метахолину монтелукаста (DR. REDDY'S), используемого в качестве положительного контрольного лекарственного средства, экстракта листа плюща и объединенных экстрактов из Примеров 2-7 представлены в следующей Таблице 16.

Таблица 16   Значение PenH в соответствии с дозой метахолина 0 мг/мл 10 мг/мл 20 мг/мл Нормальная группа 1,2±0,1 1,7±0,2 6,0±2,4 Индуцированная группа 1,5±0,2 14,3±3,0 29,7±12,2 Примеры 2-7 (200 мг/кг) 1,5±0,2 7,5±2,1 15±4,9 Экстракт листа плюща (200 мг/кг) 1,4±0,2 8,2±2,5 18,1±5,9 Положительный контроль монтелукаст (30 мг/кг) 1,5±0,2 8,4±2,4 19,8±5,4

Как показано в Таблице 16 выше, объединенные экстракты из Примеров 2-7 демонстрируют более значительные эффект в отношении подавления гиперчувствительности дыхательных путей, чем только экстракт листа плюща.

2) Определение уровня IgE в плазме

Значения IgE в плазме для монтелукаста (DR. REDDY'S), используемого в качестве положительного контроля, экстракта листа плюща и объединенных экстрактов из Примеров 2-7 в соответствии с концентрациями представлены в следующей Таблице 17.

Таблица 17   Уровень IgE (нг/мл) Нормальная группа 0,6±0,2 Индуцированная группа 19,7±6,1 Примеры 2-7 (200 мг/кг) 9,6±3,2 Экстракт листа плюща (200 мг/кг) 11,0±4,8 Положительный контроль монтелукаст (30 мг/кг) 13,7±5,7

Как показано в Таблице 17 выше, группа, получающая вещества из Примеров 2-7 по настоящему изобретению, имеет более низкое значение IgE, которое опосредует воспаление, чем группа, получающая только экстракт листа плюща, и группа, получающая положительное контрольное лекарственное средство.

3) Количество клеток в жидкости бронхоальвеолярного лаважа (BALF)

Количество нейтрофилов и эозинофилов в жидкости бронхоальвеолярного лаважа (BALF) для монтелукаста (DR. REDDY'S), используемого в качестве положительного контроля, экстракта листа плюща и объединенных экстрактов из Примеров 2-7 в соответствии с концентрациями представлены в следующей Таблице 18.

Таблица 18   WBC (×10³ клеток) NEU EOS Нормальная группа 16,3±3,4 4,7±2,7 Индуцированная группа 24,0±6,1 414,7±168,2 Примеры 2-7 (200 мг/кг) 16,3±11,3 296,7±300,1 Экстракт листа плюща (200 мг/кг) 18,7±7,1 369,3±232,2 Положительный контроль монтелукаст (30 мг/кг) 22,3±7,2 466,0±207,0 WBC - лейкоцит, NEU - нейтрофил, EOS - эозинофил

Как показано в Таблице 18 выше, группа, получающая вещества из Примеров 2-7, имеет меньшее количество лейкоцитов, связанных с воспалением (нейтрофил, эозинофил), чем группа, получающая только экстракт листа плюща, и группа, получающая положительное контрольное лекарственное средство.

4) Исследование легочной ткани

Степень окклюзии бронхиол и инфильтрации воспалительных клеток для монтелукаста, используемого в качестве положительного контрольного лекарственного средства, экстракта листа плюща и объединенных экстрактов из Примеров 2-7 в соответствии с концентрациями, представлены в следующей Таблице 19, а фотографии легочной ткани, окрашенной Н и Е (гематоксилином и эозином), представлены на Фиг.5 ((а) нормальная группа, (б) индуцированная группа, (в) группа положительного контроля, (г) Примеры 2-7). В следующей Таблице 19, 1 = нет, 2 = незначительный, 3 = тонкий, 4 = средний, 5 = толстый в соответствии со степенью окклюзии и инфильтрации воспалительных клеток.

Таблица 19   Микроскопическое исследование Степень окклюзии бронхов Степень инфильтрации воспалительных клеток Нормальная группа 0±0 0±0 Индуцированная группа 3,3±0,5 3,8±0,4 Примеры 2-7 (200 мг/кг) 1,8±0,4 1,9±0,4 Экстракт листа плюща (200 мг/кг) 2,0±0,0 2,3±0,5 Положительный контроль монтелукаст (30 мг/кг) 3,5±0,5 3,7±0,5

Как показано в Таблице 19 выше, объединенные экстракты из Примеров 2-7 демонстрируют более значительный эффект в отношении подавления окклюзии бронхов и инфильтрации воспалительных клеток, чем экстракт листа плюща и лекарственное средство, используемое в качестве положительного контроля.

5) ОТ-ПЦР

Степени экспрессии опосредующих воспаление цитокинов (IL-1β, IL-4, IL-13r2a) для монтелукаста, используемого в качестве положительного контрольного лекарственного средства, и Экспериментальных веществ из Примеров 2-7 в соответствии с концентрациями представлены в следующей Таблице 20. В таблице 20 каждое значение получено путем деления плотности каждого цитокина согласно УФ-облучению на плотность актина.

Таблица 20   Степень экспрессии цитокина IL-1β IL-4 IL-13r2a Нормальная группа 0,58±0,27 0,58±0,21 0,56±0,49 Индуцированная группа 0,94±0,39 1,96±0,98 1,20±0,67 Примеры 2-7 (200 мг/кг) 0,16±0,74 0,83±0,67 0,29±0,96 Экстракт листа плюща (200 мг/кг) 1,21±0,62 0,14±0,70 0,60±0,70 Положительный контроль монтелукаст (30 мг/кг) 0,51±0,26 1,47±0,48 0,37±0,31

Как показано в Таблице 20 выше, в группе, получающей вещества из Примеров 2-7, экспрессия опосредующих воспаление цитокинов (IL-1β, IL-4, IL-13r2a) подавлена в большей степени по сравнению с группой, получающей только экстракт лист плюща, и группой, получающей положительное контрольное лекарственное средство.

Пример 5. Приготовление экстракта Coptidis Rhizoma в виде препарата

5-1. Получение порошка

экстракт Coptidis Rhizoma (Пример 1-1) 20 мг лактоза 100 мг тальк 10 мг

Указанные выше ингредиенты смешивают и помещают в герметичный пакет с получением порошка.

5-2. Получение таблетки

экстракт Coptidis Rhizoma (Пример 1-2) 10 мг кукурузный крахмал 100 мг лактоза 100 мг стеарат магния 2 мг

Указанные выше ингредиенты смешивают и прессуют стандартным для получения таблеток способом с получением таблетки.

5-3. Получение капсулы

экстракт Coptidis Rhizoma (Пример 1-3) 10 мг кристаллическая целлюлоза 3 мг лактоза 14,8 мг стеарат магния 0,2 мг

Указанные выше ингредиенты смешивали стандартным для получения капсул способом и помещали в желатиновую капсулу с получением капсулы.

5-4. Получение инъекции

экстракт Coptidis Rhizoma (Пример 1-4) 10 мг маннит 180 мг стерильная вода для инъекций 2974 мг Na₂HPO₄,12H₂O 26 мг

Одну ампулу (2 мл) готовили из вышеуказанного количества ингредиентов стандартным для получения инъекции способом.

5-5. Получение раствора

экстракт Coptidis Rhizoma (Пример 1-1) 20 мг кукурузный сироп с высоким содержанием   фруктозы 10 г маннит 5 г очищенная вода достаточное количество

Согласно стандартному способу получения раствора, каждый ингредиент добавляли к очищенной воде и растворяли в ней, и лимон добавляли в нее в достаточном количестве. И затем указанные выше ингредиенты смешивали и очищенную воду добавляли к раствору так, чтобы общее количество составило 100 мл, и выливали в коричневую бутылку и стерилизовали для получения раствора.

5-6. Получение здорового пищевого продукта

экстракт Coptidis Rhizoma (Пример 1-2) 1000 мг витамина А ацетат 70 мкг витамин Е 1,0 мг витамин В1 0,13 мг витамин В2 0,15 мг витамин В6 0,5 мг витамин В12 0,2 мкг витамин С 10 мг биотин 10 мкг амид никотиновой кислоты 1,7 мг фолиевая кислота 50 мкг пантотенат кальция 0,5 мг минеральная смесь подходящее количество сульфат железа 1,75 мг оксид цинка 0,82 мг карбонат магния 25,3 мг одноосновный фосфат калия 15 мг двухосновный фосфат кальция 55 мг цитрат калия 90 мг карбонат кальция 100 мг хлорид магния 24,8 мг

Указанные выше соотношения витаминов и минеральной смеси иллюстрируют предпочтительный пример смешиваемых ингредиентов, относительно пригодных для здорового пищевого продукта; однако эти соотношения могут быть модифицированы. Указанные выше ингредиенты могут быть смешаны в соответствии со стандартным способом приготовления здорового пищевого продукта и затем превращены в гранулы и использованы для получения композиции здорового пищевого продукта стандартным способом.

5-7. Получение здорового напитка

экстракт Coptidis Rhizoma (Пример 1-3) 1000 мг лимонная кислота 1000 мг олигосахарид 100 г концентрат японского абрикоса 2 г таурин 1 г очищенная вода добавляли для достижения   общего количества 900 мл

Указанные выше ингредиенты смешивали в соответствии со стандартным способом приготовления здорового напитка и нагревали с перемешиванием при 85°С в течение примерно 1 часа, и затем полученный раствор фильтровали для того, чтобы собрать в стерильный сосуд на 2 л, стерильно закрывали и хранили в холодильнике.

Указанные выше соотношения иллюстрируют предпочтительный пример смеси ингредиентов, относительно пригодных для выбранного напитка; однако он может быть модифицирован в соответствии с региональным и этническим вкусом, таким как класс потребностей, страна потребностей, применение и т.д.

Пример 6. Приготовление объединенного экстракта Coptidis rhizoma с листом плюща в виде препарата

6-1. Получение таблетки

200 мг объединенного экстракта из Примера 2-7, 10 мг слабой безводной кремневой кислоты, 2 мг стеарата магния, 50 мг кристаллической целлюлозы, 25 мг натрия крахмала гликолата, 113 мг кукурузного крахмала и подходящее количество безводного этанола смешивали и прессовали в таблетку стандартным способом.

6-2. Получение здорового пищевого продукта

объединенный экстракт (Пример 2-7) 1000 мг витамина А ацетат 70 мкг витамин Е 1,0 мг витамин В1 0,13 мг витамин В2 0,15 мг витамин В6 0,5 мг витамин В12 0,2 мкг витамин С 10 мг биотин 10 мкг амид никотиновой кислоты 1,7 мг фолиевая кислота 50 мкг пантотенат кальция 0,5 мг минеральная смесь подходящее количество сульфат железа 1,75 мг оксид цинка 0,82 мг карбонат магния 25,3 мг одноосновный фосфат калия 15 мг двухосновный фосфат кальция 55 мг цитрат калия 90 мг карбонат кальция 100 мг хлорид магния 24,8 мг

Указанные выше соотношения витаминов и минеральной смеси иллюстрируют предпочтительный пример смешиваемых ингредиентов, относительно пригодных для здорового пищевого продукта, однако соотношения могут быть модифицированы. Указанные выше ингредиенты могут быть смешаны стандартным для приготовления здорового пищевого продукта способом, превращены в гранулы и использованы для получения здорового пищевого продукта стандартным способом.

6-3. Получение здорового напитка

объединенный экстракт (Пример 2-7) 1000 мг лимонная кислота 1000 мг олигосахарид 100 г концентрат японского абрикоса 2 г таурин 1 г очищенная вода добавляли для достижения   общего количества 900 мл

Указанные выше ингредиенты смешивали стандартным для приготовления здорового напитка способом и затем нагревали с перемешиванием при 85°С в течение примерно 1 часа, и затем полученный раствор фильтровали и помещали в стерильный сосуд на 2 л, стерильно закрывали и затем хранили в холодильнике.

Указанные выше соотношения иллюстрируют предпочтительный пример смешиваемых ингредиентов, относительно пригодных для здорового напитка; однако соотношения могут быть модифицированы в соответствии с региональным и этническим вкусом, таким как класс потребностей, страна потребностей и т.д.

Изобретение относится к фармацевтической промышленности, в частности к противокашлевому или отхаркивающему средству. Противокашлевая или отхаркивающая композиция, содержащая экстракт Coptidis rhizoma в качестве активного ингредиента, где экстракт представляет собой неочищенный экстракт, который получен с использованием одного или более растворителей, выбранных из группы, состоящей из воды и линейного или разветвленного спирта, имеющего от 1 до 4 атомов углерода, в качестве экстрагирующего растворителя или растворимый в растворителе экстракт, который получен путем добавления водного раствора линейного или разветвленного спирта, имеющего от 1 до 6 атомов углерода, к неочищенному экстракту. Композиция для лечения респираторного заболевания, содержащая противокашлевую или отхаркивающую композицию. Здоровый функциональный пищевой продукт для облегчения респираторного заболевания, содержащий композицию, включающую в качестве активного ингредиента экстракт Coptidis rhizoma. Вышеописанные композиции и функциональный пищевой продукт эффективны в качестве противокашлевых или отхаркивающих средств. 3 н. и 5 з.п. ф-лы, 5 ил., 20 табл., 6 пр.

1. Противокашлевая или отхаркивающая композиция, содержащая экстракт Coptidis rhizoma в качестве активного ингредиента,
где экстракт представляет собой неочищенный экстракт, который получен с использованием одного или более растворителей, выбранных из группы, состоящей из воды и линейного или разветвленного спирта, имеющего от 1 до 4 атомов углерода, в качестве экстрагирующего растворителя, или растворимый в растворителе экстракт, который получен путем добавления водного раствора линейного или разветвленного спирта, имеющего от 1 до 6 атомов углерода, к неочищенному экстракту.

2. Композиция по п.1, дополнительно содержащая экстракт листа плюща и находящаяся в форме объединенного экстракта Coptidis rhizoma и листа плюща.

3. Композиция по п.2, где соотношение по массе экстракта листа плюща и экстракта Coptidis rhizoma составляет от 0,1:1 до 10:1 (масса экстракта листа плюща:масса экстракта Coptidis rhizoma).

4. Композиция по п.3, где соотношение по массе экстракта листа плюща и экстракта Coptidis rhizoma составляет от 0,2:1 до 5:1 (масса экстракта листа плюща:масса экстракта Coptidis rhizoma).

5. Композиция для лечения респираторного заболевания, содержащая противокашлевую или отхаркивающую композицию, содержащую комбинацию экстракта Coptidis rhizoma и экстракта листа плюща в качестве активного ингредиента, причем композиция находится в форме объединенного экстракта Coptidis rhizoma и листа плюща,
где экстракт представляет собой неочищенный экстракт, который получен с использованием одного или более растворителей, выбранных из группы, состоящей из воды и линейного или разветвленного спирта, имеющего от 1 до 4 атомов углерода, в качестве экстрагирующего растворителя, или растворимый в растворителе экстракт, который получен путем добавления водного раствора линейного или разветвленного спирта, имеющего от 1 до 6 атомов углерода, к неочищенному экстракту,
соотношение по массе экстракта листа плюща и экстракта Coptidis rhizoma составляет от 0,1:1 до 10:1 (масса экстракта листа плюща:масса экстракта Coptidis rhizoma), и
респираторное заболевание выбрано из группы, состоящей из бронхита, астмы, хронической или острой бронхоконстрикции, синдрома стертозного дыхания у младенца, хронического обструктивного заболевания легких, простуды, гриппа и легочного гистиоцитоза.

6. Композиция по п.5, где соотношение по массе экстракта листа плюща и экстракта Coptidis rhizoma составляет от 0,2:1 до 5:1 (масса экстракта листа плюща:масса экстракта Coptidis rhizoma).

7. Композиция по любому из пп.1-6, приготовленная в виде порошка, гранулы, таблетки, капсулы, суспензии, эмульсии, сиропа, аэрозоля, трансдермального агента, суппозитория или стерильного раствора для инъекций.

8. Здоровый функциональный пищевой продукт для облегчения респираторного заболевания, содержащий композицию по любому из пп.1-6.