СПОСОБ ВЫРАЩИВАНИЯ КУЛЬТУР ХРЯЩЕВЫХ КЛЕТОК Российский патент 2012 года по МПК C12N5/00 

Изобретение относится к области медицины, в частности к области трансплантологии, и может быть использовано для выращивания хрящевой ткани in vitro.

Известен способ выращивания культур хрящевых клеток с использованием стволовых клеток. Известно, что костные морфогенетические белки (bonemorphogeneticproteins, BMPs) являются важным фактором формирования как костной, так и хрящевой ткани, что определяет интерес к их использованию для регенерации обоих тканей. Обычно при культивировании стволовых клеток in vitro для получения из них костной или хрящевой ткани под воздействием BMP использовали специфический для каждой ткани состав среды и условия выращивания (Kemmis C.M., Vahdati A., Weiss H.E., Wagner D.R. Bone morphogenetic protein 6 drives both osteogenesis and chondrogenesis in murine adipose-derived mesenchymal cells depending on culture conditions. Biochem Biophys Res Commun. 2010 Oct 8; 401(1):20-5. Epub 2010 Sep 9).

Один из наиболее эффективных методов направленной дифференцировки стволовых клеток для клеточной терапии - трансфекция в них определенных генов.

Группа корейских ученых из College of Life Science, СНА University, Сеул, разработала невирусную векторную систему для трансфекции человеческих мезенхимальных стволовых клеток (МСК) с целью добиться их дифференцировки в клетки хрящевой ткани. Было исследовано несколько возможных носителей генов с оценкой их эффективности для трансфекции и направленной дифференцировки МСК. Наилучшие результаты были получены при использовании биодеградирующих наночастиц из полилактогликоевой кислоты, несущих плазмиды с соответствующей ДНК. При их применении была достигнута устойчивая экспрессия нужных генов МСК и эффективный хондрогенез. Было показано, что клетки активно захватывают несущие ген SOX9 наночастицы in vitro and in vivo. Экспрессия гена через 2 дня после трансфекции возрастала на 75%, как и синтез глюкозаминоглюкана, что было подтверждено различными методами (ПЦР, иммуноблоттинг, иммунофлюоресценция и др.).

Таким образом, ученые предложили метод, значительно повышающий эффективность формирования хрящевой ткани, который может быть применен в клеточной терапии артритов и других заболеваний (Kirn J.H., et al. The use of biodegradable PLGA nanoparticles to mediate SOX9 gene delivery in human mesenchymal stem cells (hMSCs) and induce chondrogenesis. Biomaterials. 2010 Sep 25).

Создание искусственных органов и тканей оформилось в самостоятельную отрасль науки около десяти лет тому назад.. Ученые из Гетеборгского университета в Швеции экстрагировали хондроциты (клетки хряща) из суставов 23 пациентов, вырастили культуру клеток, которая образовала хрящевую ткань, а затем имплантировали ее в поврежденный коленный сустав. Результат оказался превосходным: у 14 из 16 пациентов было отмечено практически полное замещение поврежденного хряща новой тканью в месте ее имплантации. Выращивание хрящевой ткани занимает, к сожалению, много времени - несколько недель, поэтому ученые пытаются разработать методики более быстрого получения искусственных тканей (М.В. Плетников. Создание искусственных органов и тканей. Science, 1995, Vol.270, N 5234, pp.230-232).

Травмы суставов и хрящей могут иметь серьезные последствия, включая и развитие остеоартрита. Дегенерация хряща в суставах является широко распространенным заболеванием во всем мире.

Деформирующий остеоартроз крупных суставов приводит не только к развитию болевого синдрома, но и по мере своего прогрессирования нарушает подвижность пациентов, приводя к их инвалидности. Поскольку хрящ не может регенерировать после того, как закончен рост органа, дефекты суставных поверхностей, вызванные травмами и износом, могут быть исправлены только путем пересадки новой хрящевой ткани. Генетическая инженерия и молекулярная биология сделали возможным получение здоровых клеток хрящей из организма пациента и дальнейшее их выращивание вне тела в специальных средах.

Профессор Прасад Шастри - специалист в области тканевой инженерии (ТЕ), создающей и выращивающей биологические ткани с использованием собственных клеток организма. Он является профессором отделения биофункциональной химии высокомолекулярных соединений в Центре по исследованиям биологических сигнализаций (БИОСС), в университете Фрейбурга. Совместно со своими коллегами Прасад Шастри разработал быстрый и экономически эффективный способ получения достаточного количества костной и хрящевой ткани с использованием собственных клеток организма пациента. Выращенная in vitro здоровая хрящевая ткань использовалась для лечения дефектных суставов, где она приживалась и росла.

До недавних пор восстановление хрящевой и костной ткани с применением собственных клеток тела пациента являлось сложным и дорогостоящим процессом, требующим длительного времени на реализацию. В своей статье, опубликованной в американском журнале "Новости ортопедии", доктор Прасад Шастри и его соавторы представили новую стратегию выращивания костной и хрящевой ткани "Нова-де-Инжиниринг", которая требует лишь три недели. Проведенные исследования показали, что культурные хрящевые ткани, полученные по новой методике, хорошо приживаются и не проявляют признаков кальцификации даже через девять месяцев.

Цель изобретения - ускорить и удешевить процесс выращивания культур хрящевых клеток.

Цель достигается тем, что выращивание культур хрящевых клеток осуществляют с использованием аутологичных тканей, причем проводят измельчение аутоткани до величины графтов не более 0,5 мм³, а в качестве поддерживающего субстрата используют аутоплазму и тромбоциты; в аутоплазму добавляют на 1 мл плазмы 4 капли 10% раствора хлористого кальция; после полимеризации белков плазмы и образования сгустка переносят на питательные среды и помещают в термостат на 3-4 суток.

Способ осуществляют следующим образом.

Измельченный любым способом аутохрящ в виде микрографтов, не превышающих по своим размерам объем 0,5 мм³, помещаем в аутоплазму, добавляем на 1 мл плазмы 4 капли 10% раствора хлористого кальция или такое же количество раствора глюконата кальция. Через 10-15 минут происходит полимеризация белков плазмы и образование сгустка. В его состав входят все находящиеся в плазме тромбоциты и размельченные фрагменты хряща. Сгусток со всей клеточной массой переносится на питательные среды или питательные среды добавляются в плазму, содержащую сгусток. Весь комплекс помещается в термостат. В течение 3-4 суток происходит рост и концентрация хондроцитов в сгустке. После извлечения из термостата содержащий хондроциты белковый сгусток можно использовать, придав ему любую форму.

Изобретение относится к области медицины, в частности к области трансплантологии. Предложен способ выращивание культур хрящевых клеток с использованием аутологичных тканей, причем аутоткань измельчается до величины графтов не более 0,5 мм³, а в качестве поддерживающего субстрата используется аутоплазма и тромбоциты; в аутоплазму добавляется на 1 мл плазмы 4 капли 10% раствора хлористого кальция; после полимеризации белков плазмы и образования сгустка он переносится на питательные среды и помещается в термостат на 3-4 суток. Изобретение может быть использовано для выращивания хрящевой ткани in vitro.

Способ выращивания культур хрящевых клеток с использованием аутологичных тканей, отличающийся тем, что проводят измельчение аутоткани до величины графтов не более 0,5 мм³, а в качестве поддерживающего субстрата используют аутоплазму и тромбоциты; в аутоплазму добавляют на 1 мл плазмы 4 капли 10%-ного раствора хлористого кальция; после полимеризации белков плазмы и образования сгустка переносят на питательные среды и помещают в термостат на 3-4 суток.