БИОТРАНСПЛАНТАТ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ДЕГЕНЕРАТИВНЫХ И ТРАВМАТИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЙ ХРЯЩЕВОЙ ТКАНИ И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ Российский патент 2007 года по МПК A61K35/28 A61K35/32 A61K35/54 A61K31/737 A61P19/02 

Изобретение касается получения биотрансплантата на основе комбинации стволовых и/или прогениторных клеток человека и матрицы-носителя, состоящей из синтетических и/или биологических веществ, для повышения регенераторных и репаративных свойств хрящевой и соединительной ткани при травматических и дегенеративных заболеваниях суставного хряща.

Заболевания, сопровождающиеся травматическими и дегенеративными изменениями в хрящевой ткани, являются не до конца решенной проблемы современной медицины [1, 3-8, 16, 17]. Основной проблемой лечения данных патологий служит отсутствие или недостаточный регенеративный потенциал хрящевой ткани, прогрессивно снижающийся с возрастом. В настоящее время в широкой клинической практике отсутствуют технологии, позволяющие восполнить недостаток утраченной в результате патологического процесса хрящевой ткани [2, 9-11].

В последнее десятилетие крупнейшими мировыми научно-исследовательскими центрами созданы фармакологические препараты для восстановления хрящевой ткани в клинической практике для лечения дегенеративных и травматологических заболеваний хрящевой ткани суставов [12]. Этому обстоятельству предшествовали изучение in vitro культуры ходробластов, которые показали, что при культивировании не изменяется фенотип (отсутствие дедифференцировки в более ранние формы), не происходит трансформация генома, в том числе и экспрессия онкогенов [7]. При культивировании культуры ходробластов на биосовместимых материалах происходит их дифференцировка в хондроциты с формированием нормального по структуре внеклеточного матрикса, идентичного естественному [13, 5]. Эксперименты на лабораторных животных показали, что тканеинженерные конструкции, полученные из ходробластов и биоматериалов, восстанавливают нормальную структуру поврежденного хряща, без какой либо тенденции к неоплазии (формирования злокачественных и доброкачественных опухолей из хрящевой ткани) [13, 14, 5]. Более чем 5-летние клинические исследования 1-го и 2-го уровня показали клиническую эффективность тканеинженерных конструкций, содержащие аллогенные или аутогенные ходробласты.

Биотрансплантат, состоящий из малодифференцированных клеток и матрицы носителя (тканеинженерная конструкция), трансплантируемый в зону патологического очага, позволит добиться восстановления утраченной ткани в результате включения трансплантируемых клеток в репаративные процессы наряду с имеющимися в месте пересадки малодифференцированными клетками реципиента, оказывая индуктивные и стимулирующие влияния на них, а также за счет их собственной активной деятельности (пролиферация, дифференцировка, синтез внеклеточного матрикса, что приведет к уменьшению или исчезновению клинических симптомов и выздоровлению.

Разработка и внедрение предлагаемых биотрансплантатов - тканеинженерных конструкций, содержащих человеческие аллогенные или аутогенные ходробласты, позволит повысить эффективность лечения дегенеративных заболеваний и травматических повреждений различных типов хрящевой ткани, например суставного хряща, трахеи или межпозвонковых дисков, в том числе при неэффективности стандартного лечения, что также явится важным вкладом в лечение данной патологии. Практическое применение указанных тканеинженерных конструкций обусловит снижение экономических затрат на лечение, потерь, связанных с нарушениями трудо- и работоспособности, сокращение сроков госпитализации и обращаемости за медицинской помощью.

Задачей изобретения является создание тканеинженерной конструкции, пригодной для органотипической регенерации и репарации хрящевой ткани, что способствует созданию унифицированного способа восстановления трехмерных дефектов хрящевой тканей и повышению эффективности лечения больных с различными заболеваниями и травмами опорно-двигательного аппарата.

Данный биотрансплантат можно производить серийно в промышленном производстве.

Для решения данной задачи разработан биотрансплантат на основе макромолекулярной объемной, трехмерной матрицы, включающий, по меньшей мере, один компонент структуры, по меньшей мере, один компонент активации.

Макромолекулярная объемная, трехмерная структура - матрица-носитель - может быть выполнена из хитозана, коллагенов различных типов и происхождения, альгината и им подобных веществ с добавлением таких компонентов, как гиалуроновая кислота, хондроэтин сульфат. Матрица носитель может быть выполнена в различных формах, например в виде геля, губок, пленок или иных трехмерных моделей. Вещества, входящие в матрицу-носитель служат для поддержания компонентов активации в трехмерном пространстве, фиксируя их на себе и удерживая их от рассеивания. Матрица-носитель может дополнительно содержать белки внеклеточного матрикса, например коллагены различных типов (I-XIX), энтегрин, фибронектин и ламинин и др. Указанные белки внеклеточного матрикса способствуют процессам миграции, дифференцировки, пролиферации и активизации основных функций компонента активации, что, в свою очередь, позволяет добиваться ускорения процессов регенерации хрящевой ткани.

В состав носителя также дополнительно могут быть введены антисептики, такие как ионы серебра, меди или золота и других микро- и макроэлементов, и антибиотики широкого спектра действия, в концентрациях не токсичных для клеток, что позволяет значительно уменьшить вероятность возникновения воспалительного процесса в пораженной ткани.

Матрица-носитель представляет собой композит, получаемый путем объединения необходимых для конкретной ситуации компонентов. Например, в следующих пропорциях: базовое вещество (гель хитозана, альгината, коллагена или их производных, содержащий от 0,5% до 20% сухого вещества в зависимости от клинической или экспериментальной задачи) может быть в виде самостоятельного компонента или в различных сочетаниях, например: 3% гель хитозана - 70% объема базового вещества / 15% гель альгината - 30% объема; 2% гель коллагена - 80% объема / 15% гель хитозана - 20% объема; 5% гель хитозана - 50% объема / 1% гель коллагена - 50% объема; концентрации базового вещества и процентное содержание компонентов зависит от клинической или экспериментальной задачи. Композитные добавки (гиалуроновая кислота, хондроэтин сульфаты) вносятся в базовое вещество путем обычного смешивания в различных пропорциях: базовое вещество от 90% до 99% объема, композитные добавки от 1% до 10%, в зависимости от клинической или экспериментальной задачи. Благодаря различным формам, придаваемым матрице-носителю, ее структуре, наличию армирующих небиодеградирующих компонентов, возникает возможность доставлять и переносить живые клетки в область дефекта хрящевой ткани любой конфигурации, глубины и размера.

Биодеградируемая часть матрицы-носителя может быть получена простым смешиванием всех его компонентов, необходимых для каждого конкретного случая, регламентируемого клинической или экспериментальной задачей. При необходимости к основным компонентам носителя вносят матриксные белки, факторы роста, антибиотики и/или антисептики, причем количество добавок может варьироваться в зависимости от клинической или экспериментальной задачи и объема выходящего продукта, например в качестве матриксных белков могут быть использованы фибронектин, и/или ламинин, и/или иные белки внеклеточного матрикса в концентрации от 0,1 до 100 мкг/мл, а предпочтительно от 1 до 5 мкг/мл, в качестве биологически активных веществ факторы роста фибробластов и/или трансформирующий фактор роста α и β и/или фактор роста, выделяемый тромбоцитами и/или фактор роста гепатоцитов в концентрациях от 1-300 нг/мл, а предпочтительно от 1 до 100 нг/мл или иные; в качестве асептических средств может быть использован гентамицин в концентрации от 0,08 до 0,4 мг/мл геля, а предпочтительно от 0,1 до 0,2 мг/мл и/или пенициллин (или его производные), стрептомицин (или его производные) любые другие антибиотики широкого спектра действия. По завершении процесса изготовления носителя, в него вносят компонент активации.

Компонентом активации процесса органотипической регенерации и/или репарации хрящевой ткани в тканеинженерной конструкции (биотрансплантате) могут служить аутогенные или аллогенные клетки мезенхимального происхождения, которые являются камбиальными малодифференцированными клетками соединительной ткани (поперечно-полосатая и гладкая мускулатура, жировая ткань, кость, хрящевая ткань т.п.). Клетки, используемые для создания тканеинженерной конструкции, представляют собой мезенхимальные стромальные клетки, находящиеся на различных стадиях дифференцировки (мультипотентные, стволовые клетки), на которых, в свою очередь, они еще могут быть дифференцированы в хондробластическом направлении. Описанные клетки могут быть выделены из аутогенных или донорских тканей, таких как костный мозг, надкостница, надхрящница, кость, хрящ, жировая ткань и др., и культивируются in vitro для увеличения их количества, изменения фенотипа (если это необходимо).

В качестве одного из основных компонентов активации могут быть использованы хондробласты (Патент RU 2160112, 12.10.2000).

Источниками культуры хондробластов являются гиалиновая, волокнистая, эластичная хрящевая ткань любой локализации, пульпозные ядра межпозвоночных дисков взрослого человека или эмбрионов человека на сроках беременности после 8 недель.

Биотрансплантат получают вне тела живого организма путем объединения, каким-либо способом, компонента активации с матрицей-носителем в пропорциях, регламентируемых экспериментальной или клинической задачей, в результате чего образуется желаемая биологическая единица (биотрансплантат, тканеинженерная конструкция).

При необходимости биотрансплантат может включать в себя пластификатор, обычно в количестве от 0,1 до 10 мас.%. Пластификатор выбирают как правило из группы полиэтиленгликоля, сорбита, глицерина и т.п.

Для удобства фиксации биотрансплантата на раневой поверхности и придания трансплантату необходимой формы заявляемая композиция дополнительно может включать, по крайней мере, один слой полимерной основы, размещенный внутри или на поверхности носителя. Полимерная основа может быть выполнена в виде сетчатого эндопротеза или пленки или в виде перевязочного материала. Указанный сетчатый эндопротез может быть выполнен, например, из биодеградируемого или не биодеградируемого сетчатого материала или его равноценного заменителя по свойствам: биосовместимость и эластичность.

При необходимости комплекс может дополнительно иметь сетчатый полимерный слой, расположенный снизу или сверху активного биологического комплекса.

Культура хондробластов человека содержит аггрекан- и коллаген II-экспрессирующих клеток не менее 80% и не более 20% примесных клеток.

Хрящевую ткань отмывают, механически измельчают и подвергают ферментативной дезагрегации в течение 40-90 минут в растворе, содержащем 0,01-0,1% раствор коллагеназы II типа, 0,05-0,1% раствор проназы Е. Суспензию первичных диссоциированных хондробластов засевают с плотностью не менее 1×10⁶ кл./мл и культивируют в среде, содержащей ростовую среду DMEM/F12, 10% эмбриональной телячьей сыворотки с добавлением ростовых добавок и факторов роста.

Среду неоднократно меняют. При достижении клеточной культуры конфлюэнтного состояния осуществляют пассирование с использованием раствора трипсина для дезагрегации монослоя. Плотность посева - 1×10⁶ кл./мл.

Клетки культивируют 18-25 дней при 37°С в атмосфере 5% CO₂. Пассируют культуру не более двух раз.

Для приготовления биотрансплантата материал переносят в стерильный сосуд с раствором Хэнкса и гентамицина (80 мг/л). Дальнейшая работа производится в стерильных условиях ламинарного бокса. Выделенная с помощью хирургических инструментов хрящевая ткань тщательно отмывается от сгустков крови, максимально отделяются все мягкие ткани (кожа, фасции, мышцы, сухожилия, связки) и костная ткань. Полученную хрящевую ткань измельчают до кусочков не менее 1 мм куб. Затем подвергают ферментативной и механической дезагрегации - освобождение клеточных элементов от тканевого матрикса.

Способ дезагрегации заключается в использовании 0,1% раствора коллагеназы II типа (Sigma), 0,05% раствора проназы Е (Sigma), в одномоментном инкубировании кусочков хрящевой ткани в течение 40-90 мин в двухкомпонентном (1:1) ферментном растворе, с последующим измельчением путем многократного пипетирования до получения одноклеточной суспензии. Полученная суспензия трижды отмывается путем центрифугирования при 700 об/мин.

Способ культивирования

Суспензию первичных диссоциированных хрящевых клеток, полученных из хрящевой ткани, культивируют на непокрытых носителями культуральных чашках Петри в среде, содержащей ростовую среду DMEM+F12 (1:1, Gibco BRL), 10% эмбриональной телячьей сыворотки (НПП ПанЭко), 1% ИТС (инсулин, трансферин, селенит, НПП ПанЭко), 50 мкг/мл аскорбиновой кислоты (Sigma), 10 мкг/мл гентамицина, 5 мкг/мл амфотерицина В с добавлением ростовых факторов 5-20 нг/мл bFGF (Sigma) и/или 0,1-10 нг/мл TGFβ₁ (Sigma). Замену среды производят каждые 3 дня. При достижении клеточной культуры конфлюэнтного состояния следует пассирование с использованием 0,05% раствора трипсина для дезагрегации монослоя, той же культуральной среды, при плотности посева не менее 10×10⁵ кл./мл. Возможно проведение не более двух пассажей вследствие дедифференцировки и изменения фенотипа (снижение количества аггрекан- и коллаген II-экспресирующих клеток) получаемых клеток.

Биотрансплантат содержит мезенхимальные стволовые клетки (МСК), полученные из фетального или донорского материала или из собственных тканей рецепиента, при этом ткань дезагрегируют, полученную клеточную суспензию ресуспендируют и культивируют на ростовой среде, содержащей трансферин, инсулин, фактор роста фибробластов и гепарин до накопления в культуре клеток зрелой стромы.

В качестве фетального материала используют ткани: костный мозг, тимус, печень, жировая ткань эмбрионов человека 1-го триместра беременности.

В качестве донорского материала используют ткани: костный мозг, тимус, печень, жировая ткань.

Для получения аутологичных МСК используют ткани: костный мозг, жировая ткань.

Мезенхимальные стволовые клетки, в основном, получают из донорского костного мозга, однако существуют и другие источники - скелетные мышцы, подкожная жировая ткань, фетальные органы гемопоэза (печень, тимус, селезенка). МСК из фетальных органов гемопоэза и методики их получения практически не изучены. Описанные методики выращивания МСК из костного мозга и липоаспиратов позволяют получить гетерогенные популяции клеток стромы, лишь небольшой процент которых является стволовыми. Клетки зрелой стромы не обладают свойством дифференцироваться в различные клеточные линии и, таким образом, терапевтически неэффективны. После трансплантации стромальные клетки мигрируют преимущественно в соединительную ткань и там накапливаются. При стандартном пассировании в высоких посевных дозах доля зрелых стромальных клеток быстро увеличивается.

Использование в качестве трансплантата гомогенной (не менее 80%) популяции плюрипотентных МСК позволяет повысить эффективность лечения, увеличить воспроизводимость результатов и избежать нежелательных эффектов.

Мезенхимальные стволовые клетки выделяются из фетальных (костный мозг, тимус, печень, жировая ткань) или донорских (костный мозг, жировая ткань, тимус) тканей. Для выделения фетальных клеток используют абортивный материал, полученный при искусственном прерывании беременности у здоровых женщин, предварительно обследованных на наличие вирусных и бактериальных инфекций.

Возможность использования биоматериала достигается на следующих сроках гестации: печень - 5-8 недель, тимус - 18-20 недель, костный мозг - 17-20 недель, подкожная жировая ткань - 17-19 недель. Если выделение клеток производится не из аспиратов (костный мозг, липоаспират), а из плотных тканей, например тимуса, орган предварительно измельчают и ферментативно дезагрегируют. Суспензию фильтруют через мелкоячеистое сито из нержавеющей стали. Клеточную суспензию (аспират) разводят 1:1 солевым раствором Хэнкса, центрифугируют в режиме 1,500×g 10 минут и ресуспендируют в ростовой среде DMEM/F12, содержащей 15% эмбриональной телячьей сыворотки, селектированной для выращивания клеток в низкой плотности, 2 мМ глутамина. Суспензию клеток высевают на пластиковые чашки Петри с диаметром 100 мм. Плотность посева первичной клеточной суспензии составляет 1-20 миллионов мононуклеарных клеток на 1 см² в зависимости от источника выделения. Через 1 сутки неприкрепившиеся клетки удаляют, ростовую среду заменяют. Культуры инкубируют при 37°С в атмосфере 5% CO₂. Через 6 дней наблюдают рост гетерогенных клеточных популяций. По достижении культурой 50% конфлуентности монослой трипсинизируют и пересевают на новые чашки с плотностью 10-30 клеток на 1 см² в ростовой среде, дополнительно содержащей 10 мкг/мл трансферрина, 1 мкг/мл инсулина, 10нг/мл фактора роста фибробластов - 2 и 8 ЕД/мл гепарина. Через 7-10 дней отбирают плотные колонии мелких клеток (диаметром 7-10 мкм) с большим количеством митозов. Отобранные колонии рассевают в новые чашки с плотностью 20 клеток/см² и выращивают до состояния преконфлуентности. Замену среды производят через каждые 2 дня. Последующие пассажи производят в том же режиме. Увеличение посевной дозы или изменение состава ростовой среды приводит к быстрому накоплению в культуре клеток зрелой стромы.

Фибробласты получают из кожи фетусов 1-2 триместра беременности, кожи взрослого человека, полученной в результате пластических операций или биопсий, липоаспиратов. Кожу отмывают в среде Хэнкса, содержащей антибиотик и антимикотик, измельчают и ферментативно дезагрегируют в 0,25% растворе трипсина в течение 40 минут в условиях СО₂ инкубатора при температуре 37°С. Липоаспират ферментативно дезагрегируют аналогично. Суспензию клеток разводят 1:1 солевым раствором Хэнкса, центрифугируют в режиме 1000×об/мин, 5 минут, и ресуспендируют в ростовой среде DMEM/F12, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 2 мМ глутамина. Суспензию высевают на пластиковые чашки Петри с диаметром 100 мм. Плотность посева первичной клеточной суспензии составляет 500-1000 тысяч клеток на 1 см².

Примером применения биотранспланта является способ лечения дегенеративных и травматических заболеваний хрящевой ткани.

Доступ к суставу осуществляют стандартным методом в зависимости от локализации повреждения. После артротомии осуществляют дебридемент хрящевого дефекта вплоть до здоровой хрящевой ткани. Удаляют рубцы и освобождают субхондральную кость, которая должна быть неповрежденной и не кровоточить. Из надкостницы близлежащей кости выкраивают свободный лоскут несколько больших размеров, чем размер дефекта. Дефект хряща покрывают надкостницей, которая обращена камбиальным слоем. Далее надкостницу подшивают к краям дефекта рассасывающимися нитями 6-0. Сверху шов покрывают фибриновым клеем. Для заполнения дефекта хряща биотрансплантат в необходимом объеме с количеством клеток не менее 10 млн. в мл вводят под надкостницу на дефект хряща. Отверстие после введения биотрансплантата заклеивают фибриновым клеем. Операционную рану ушивают традиционным способом.

В послеоперационный период необходима полная иммобилизация сустава в течение 2 недель; с 3 по 6 недели разрешается частичная нагрузка на оперированный сустав; с 6 по 12 - щадящая нагрузка; с 12 по 26 - свободный режим движения в суставе и с 26 по 52 недели - движение в суставе без ограничений. Комбинированный биотрансплантат обладает высокими потенциями к пролиферации, дифференцировке, синтезирующих внеклеточный хрящевой матрикс, для использования в качестве биотрансплантата в травматологии, ортопедии, челюстно-лицевой хирургии.

Создание этой структуры основывается на следующих основных принципах:

1. Трехмерность конструкции, которая достигается использованием предлагаемой матрицы-носителя.

2. Аутогенность, что достигается использованием аутогенных клеток человека.

3. Аллогенность, что достигается использованием аллогенных клеток человека.

4. Использование клеток мезодермального и мезенхимального происхождения.

5. Удобство трансплантации, фиксации и придание трансплантату необходимой формы, что достигается включением в его состав полимерной основы - матрицы-носителя, и возможность быть дополненным фиксирующим агентом, таким как полимерная пленка или сетчатый эндопротез.

Данное изобретение предоставляет возможность закрытия объемных, трехмерных дефектов хрящевой ткани единым, унифицированным, многокомпонентным, объемным, трехмерным биотрансплантатом (тканеинженерной конструкцией), что дает право говорить о новом достигаемом техническом результате, очевидном для специалиста в данной области.

Пример 1.

Больной Ц. поступил в отделение спинальной хирургии в плановом порядке в связи с жалобами на боль в области поясницы, усиливающуюся при нагрузке с радикулярным синдромом со стороны седалищного нерва справа. При амбулаторном обследовании (ЯМРТ) выявлен остеохондроз позвоночника с межпозвонковой грыжей, пролабирующей в спинно-мозговой канал со сдавливанием нервных корешков на уровне L IV-L V. В отделении выполнена резекция части фиброзного кольца и пульпозного ядра межпозвонкового диска на уровне L IV-L V. Из полученного в результате операции хрящевой ткани межпозвонкового диска были выделены аутологичные хондробласты, которые после культивирования были соединены с носителем, состоящим из геля хитозана, гиалуроновой кислоты, хондроэтин сульфата, причем количество клеточных единиц составило 30 млн. клеток в 1 мл. Объем полученной тканеинженерной конструкции составлял 5 мл. Конструкция была трансплантирована пациенту в область пульпозного ядра. После проведенного лечения было отмечено, что у пациента отмечалось отсутствие болевого синдрома, по данным МРТ через 3 мес. произошло увеличение высоты межпозвонкового диска, отсутствие грыжевых выпячиваний и изменений со стороны нервных корешков в области бывшего сдавливания. При оценке качества жизни по шкалам пациент отметил улучшение качества жизни, что можно расценивать в совокупности с полученными клинико-инструментальными данными как выздоровление.

Таким образом, данная методика показала свою эффективность при лечении дегенеративных заболеваний межпозвонковых дисков.

Пример 2. Больная Н. поступила в травматологическое отделение в экстренном порядке с жалобами на интенсивную боль в левом коленном суставе, возникшую после падения на льду. При осмотре область сустава отечна, определяется балатация надколенника, резкое ограничение пассивных и активных движений в суставе. При рентгенологическом исследовании выявлен дефект в области внутреннего мыщелка бедренной кости. При пункции сустава получена свежая кровь, при артроскопии выявлен обширный отрыв фрагмента хряща в области медиального мыщелка, свободный фрагмент удален. После стихания острого процесса пациентке выполнена артротомия коленного сустава слева, на операции выявлен вялогранулирующий дефект хрящевой ткани в области внутреннего мыщелка, после кюретирования дна дефекта на область отсутствия хрящевой ткани была наложена тканеинженерная конструкция, состоящая из геля хитозана, гиалуроновой кислоты, хондроэтин сульфата и аллогенных хондробластов, причем количество клеточных единиц составило 15 млн. клеток в 1 мл. Конструкция была фиксирована коллагеновой пленкой и армирована сеткой Vicril (Ethicon). Послойные швы на рану, гипсовая лонгета. Спустя 2 мес. произведено снятие гипсовой лангеты и контрольное УЗИ левого коленного сустава, на котором в области имевшегося дефекта определяется эхосигнал, сходный со здоровой хрящевой тканью, объемных образований и кратерообразных дефектов на суставной поверхности не выявлено. После чего пациентке проведена реабилитационная лечебная физкультура. Спустя 4 мес. после операции состояние пациентки удовлетворительное, ходит самостоятельно, болей нет, движения в суставе в полном объеме. При контрольном УЗИ левого коленного сустава суставная поверхность гладкая, структура однородная с единичными гиперэхогенными включениями. Констатировано выздоровление.

Таким образом, получены данные о регенерации обширных внутрисуставных дефектов хрящевой ткани с использованием тканеинженерной конструкции с аллогенными хондробластами.

Литература:

1. Васильева Л.Ф. Мануальная диагностика и терапия \\ С.-Петербург. - ИКФ "Фолиант", 1999.

2. Михайлова Л.Н. Репаративная регенерация костной и хрящевой тканей в условиях воздействия различных биомеханических факторов: Автореф. д-ра биол. наук. М., 1988.

3. Рабинович С.С. Микродискэктомия при поясничных болях // Боль и ее лечение. Медицинский междисциплинарный научно-практический журнал. - 1997, № 7. - С.11-13.

4. Ролик И.С., Галанов В.П. Грыжи межпозвонковых дисков поясничного отдела и их биологическая терапия. // Биологическая медицина, 1999, №1, с.22-31.

5. Adams SB Jr, Randolph MA, Gill TJ. Tissue engineering for meniscus repair. J Knee Surg. 2005 Jan; 18(1): 25-30.

6. Atlas SJ, Keller RB, Wu YA, Deyo RA, Singer DE. Long-term outcomes of surgical and nonsurgical management of sciatica secondary to a lumbar disc herniation: 10 year results from the maine lumbar spine study. Spine. 2005 Apr 15; 30(8): 927-35.

7. De Boer J, Wang HJ, Van Blitterswijk C. Effects of Wnt signaling on proliferation and differentiation of human mesenchymal stem cells. Tissue Eng. 2004 Mar - Apr; 10(3-4): 393-401.

8. Isaacs RE, Podichetty VK, Sandhu FA, Santiago P, Spears JD, Aaronson O, Kelly K, Hrubes М, Fessler RG. Thoracic microendoscopic discectomy: a human cadaver study. Spine. 2005 May 15; 30(10): 1226-31.

9. Kinner В, Capito RM, Spector М. Regeneration of articular cartilage. Adv Biochem Eng Biotechnol. 2005; 94: 91-123.

10. Kuettner KE, Cole AA. Cartilage degeneration in different human joints. Osteoarthritis Cartilage. 2005 Feb; 13(2): 93-103.

11. Martin MD, Boxell CM, Malone DG. Pathophysiology of lumbar disc degeneration: a review of the literature. Neurosurg Focus. 2002 Aug 15; 13(2): E1.

12. Marcacci M, Berruto M, Brocchetta D, Delcogliano A, Ghinelli D, Gobbi A, Kon E, Pederzini L, Rosa D, Sacchetti GL, Stefani G, Zanasi S. Articular cartilage engineering with Hyalograft C: 3-year clinical results. Clin Orthop Relat Res. 2005 Jun; (435): 96-105.

13. Redman SN, Oldfield SF, Archer CW. Current strategies for articular cartilage repair. Eur Cell Mater. 2005 Apr 14; 9: 23-32.

14. Sakai D, Mochida J, Yamamoto Y, Nomura T, Okuma M, Nishimura K, Nakai T, Ando K, Hotta T. Transplantation ofmesenchymal stem cells embedded in Atelocollagen gel to the intervertebral disc: a potential therapeutic model for disc degeneration. Biomaterials. 2003 Sep; 24(20): 3531-41.

15. Shieh SJ, Terada S, Vacanti JP. Tissue engineering auricular reconstruction: in vitro and in vivo studies. Biomaterials. 2004 Apr; 25(9): 1545-57.

16. Turgut M, Akyuz O, Ozsunar Y, Kacar F. Sponge-induced granuloma ("gauzoma") as a complication of posterior lumbar surgery. Neurol Med Chir (Tokyo). 2005 Apr; 45(4): 209-11.

17. Wenger M, Markwalder TM. A novel surgical treatment of lumbar disc herniation in patients with long-standing degenerative disc disease. J Neurosurg Spine. 2005 May; 2(5): 515-20.

Изобретение относится к медицине, биофармакологии и касается получения биотрансплантата на основе комбинации малодифференцированных (мультипотетных, камбиальных, стволовых) клеток человека и матрицы-носителя для повышения регенераторных и репаративных свойств хрящевой и соединительной ткани при травматических и дегенеративных заболеваниях суставного хряща. Комбинированный биотрансплантат для лечения травматических и дегенеративных заболеваний хрящевой ткани, представляющий собой многокомпонентную, объемную, трехмерную структуру, содержащую малодифференцированные клетки человека и матрицу-носитель. В качестве матрицы-носителя используют хитозан, и/или альгинат, и/или коллаген и композиционные добавки - гиалуроновую кислоту, хондроэтин сульфат при соотношении базового вещества и композиционной добавки 90-99%:1-10%. По завершении процесса изготовления носителя в него вносят суспензию клеточной культуры хондробластов, фибробластов, мезенхимальных стволовых клеток (МСК) костного мозга, жировой ткани или иного происхождения, как аутологичные так и аллогенные. Изобретение обеспечивает повышение эффективности лечения. 2 н. и 10 з.п. ф-лы.

1. Биотрансплантат для лечения дегенеративных и травматических заболеваний суставного хряща и межпозвоночных дисков, характеризующийся тем, что он содержит носитель, включающий базовое вещество, например хитозан, и/или альгинат, и/или коллаген и композиционные добавки - гиалуроновую кислоту, хондроэтин сульфат при соотношении базового вещества и композиционной добавки 90-99%:1-10%, а также суспензию аллогенной или аутогенной клеточной культуры хондробластов, фибробластов и мезенхимальных стволовых клеток при их содержании в 1 мл носителя 5-50 млн. клеток.2. Биотрансплантат по п.1, где носитель дополнительно включает матриксные белки: коллагены различных типов (I-XIX), энтегрин, фибронектин, ламинин в концентрации от 0,1 до 100 мкг/мл.3. Биотрансплантат по п.1, где носитель дополнительно включает антисептики, выбранные из группы ионы серебра, меди, золота и антибиотики широкого спектра действия.4. Биотрансплантат по п.1, где носитель дополнительно включает факторы роста фибробластов и/или трансформирующий фактор роста α и β и/или фактор роста, выделяемый тромбоцитами, и/или фактор роста гепатоцитов в концентрации от 1 до 300 нг/мл.5. Биотрансплантат по п.1, который дополнительно включает пластификатор, выбранный из группы полиэтиленгликоль, сорбит, глицерин в количестве от 0, 05 до 10 мас.%.6. Биотрансплантат по п.1, где источником культуры хондробластов являются гиалиновая, волокнистая, эластичная хрящевая ткань любой локализации, пульпозные ядра межпозвоночных дисков взрослого человека или эмбрионов человека на сроках 1-2 триместра беременности.7. Биотрансплантат по п.1, где источником мезенхимальных стволовых клеток является фетальный материал ткани на сроках гестации: печень 5-8 недель, тимус 18-20 недель, костный мозг 17-20 недель, подкожная жировая ткань 17-19 недель.8. Биотрансплантат по п.1, где источником мезенхимальных стволовых клеток является донорский материал: костный мозг, подкожная жировая ткань, тимус (у детей 6 лет), которые забирают у пациента для последующей аутотрансплантации.9. Биотрансплантат по п.1, где источником мезенхимальных стволовых клеток является донорский материал: костный мозг, подкожная жировая ткань, тимус (у детей 6 лет), которые забирают у пациента для последующей аллотрансплантации.10. Биотрансплантат по п.1, где источником фибробластов являются кожа фетусов 1-2 триместра беременности, кожа взрослого человека, полученная в результате пластических операций или биопсий, липоаспиратов.11. Биотрансплантат по п.1, который выполнен в форме геля, губки сетчатой структуры.12. Способ получения биотрансплантата для лечения дегенеративных и травматических заболеваний суставного хряща и межпозвоночных дисков, характеризующийся тем, что базовые вещества - гели хитозана, и/или альгината, и/или коллагена и композиционные добавки - гиалуроновую кислоту и хондроэтин сульфат смешивают, при необходимости вносят матриксные белки, факторы роста, антибиотики и/или антисептики, в полученный носитель вносят суспензию аллогенной или аутогенной клеточной культуры хондробластов, и/или фибробластов, и/или мезенхимальных стволовых клеток.