СПОСОБ ПРИЖИЗНЕННОЙ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЙ ДИАГНОСТИКИ Ascaris lumbricoides И Ascaris suum ПО МИКРОСТРУКТУРЕ ЯИЦ Российский патент 2012 года по МПК G01N33/48 A61D99/00 

Изобретение относится к области ветеринарной медицины, а более конкретно - к паразитологии (гельминтологии) для постановки прижизненной дифференциальной диагностики аскарид Ascaris lumbricoides Linnaeus, 1758 (от человека, обезьян) и Ascaris suum Goese, 1782 (от свиньи, вепря-кабана) не только до рода: Ascaris Linnaeus, 1758 (яйца с толстой бугристой или гладкой оболочкой), но и до вида: по микроструктуре яиц и предназначенный для использования при постановке диагноза методами копроовоскопии (флотации, седиментации, комбинированные) с научной целью для совершенствования систематики гельминтов, или при контаминации (загрязнении) и мониторинге внешней среды яйцами зоонозных возбудителей инвазии (помещений, кормов, предметов ухода, воды, водоисточников, пастбищ) или при изучении региональной эпизоотологии (эпидемиологии) по данной болезни.

Известно по работе А.А.Мозгового, 1953, с.46 [1], что у Ascaris lumbricoides яйца овальные, желтого или коричневого цвета, 0,05-0,075 мм длины и 0,04-0,05 мм ширины. Поверхность наружной оболочки яиц бугристая. Иногда выделяются яйца без белковой оболочки или неоплодотворенные. В последнем случае они более удлиненные (0,080 мм длины и 0,045 мм ширины) и содержат большое количество желточных шариков, а у Ascaris suum яйца овальной формы, с толстой скорлупой, состоящей из ряда оболочек сложной структуры. Наружная оболочка яиц имеет фестончатую форму и напоминает собой тутовую ягоду. Длина яиц 0,056-0,087 мм, ширина 0,046-0,057 мм (по Скрябину и Шульцу, 0,050-0,075 мм длины и 0,040-0,050 мм ширины). А. А.Мозговой, 1953, с.95 [1].

Известно по Г.А.Котельникову, 1984, с.108 [2], что у Ascaris suum: яйца овальные, величина 0,050-0,075×0,040-0,050 мм; покрыты толстой крупнобугристой скорлупой; внутри - округлая зародышевая клетка; окраска темно-коричневая или бурая.

Размеры яиц (по результатам наших измерений 500 оплодотворенных яиц): Ascaris lumbricoides: 0,050-0,075 мм длины и 0,04-0,05 мм ширины, а яиц Ascaris suum: 0,050-0,075 мм длины и 0,040-0,050 мм ширины.

Следовательно, по размерам яиц виды паразитических нематод Ascaris lumbricoides и Ascaris suum проведение прижизненной дифференциальной диагностики не представляется возможным, так как размеры яиц указанных видов паразитов практически совпадают и только иногда встречаются неоплодотворенные яйца аскарид, которые имеют большую длину и ширину.

Известно, что в научной литературе нет указаний на наличие крышечек (пробочек) на полюсах и детального описания микроструктуры яиц аскарид, что крайне важно для совершенствования систематики и практического использования прижизненной дифференциальной диагностики Ascaris lumbricoides и Ascaris suum, особенно при контаминации внешней среды зародышами возбудителей зоонозных болезней [1, 2, 3, 4].

Морфологические признаки структуры яиц указанные в работах вышеназванных авторов, на практике и в научных целях при обнаружении других форм паразитов, оказались крайне недостаточно, для дифференциации видов. Так, признак «бугристые» недостаточно информативен, так как бугристость свойственна и виду Ascaris suum, и виду Ascaris lumbricoides (по результатам наших исследований).

И даже наиболее информативный видовой признак яиц по специфичному (облигатному) хозяину аскарид может в некоторых случаях быть ошибочным, так как еще нет достаточно убедительных научных работ по невозможности заражения и развития этих видов аскарид до половозрелой стадии в неспецифичных хозяевах, тем более что в литературе имеются указания об обнаружении Ascaris lumbricoides у человека (облигатный хозяин); приматы: орангутан, шимпанзе, Macaccus innus, свинья, индийский дикий кабан, домашняя овца, собака, кошка, большая индийская белка, бык; Ascaris phacochoeri - свиньи бородавочники; Ascaris cebi - обезьяна сапажу - Cebus capucinus; Ascaris suum у свиньи и человека. А.А.Мозговой, В.Е.Пасечник [1, 3, 4].

В научных и в практических условиях необходимо уточнять диагноз болезни, вызываемой гельминтом до вида по ведущим диагностическим признакам микроструктуры яиц, так как болезнь может быть вызвана одним или даже двумя видами аскарид, так как известно, что эти виды аскарид могут паразитировать и у человека, и у свиней, и у обезьян, и даже случайно Ascaris suum у овец. Так, известно, что экспериментальное заражение было проведено на 3-х ягнятах инвазионными яйцами Ascaris suum - Б.С.Москалевым, 1957.

«В организме ягнят развивались аскариды, которые не достигли половой зрелости и жили от 22 до 107 дней» (по Е.Е.Шумаковичу и др. - [5] - с.330.).

Гибель обезьян, свиней (поросят) и людей (детей) вызывали по нашим и данным других авторов следующие виды аскарид: у обезьян - вид Ascaris cebi и у людей (детей) - Ascaris lumbricoides и из собственной практики гибель поросят от аскариоза на свинокомплексе Сорокского района, Молдавской ССР в 1975-1976 гг., вызываемого видом Ascaris suum / А.А.Мозговой [1] В.Е.Пасечник [3, 4]. Поэтому в научных и практических целях: при заболевании животных аскариозом, особенно редких и на грани исчезновения приматов: шимпанзе, орангутанов или при гибели домашних (племенных) или диких свиней (кабан=вепрь) в зоопарках, цирках, приусадебных хозяйствах граждан и в заповедниках, охотничье-промысловых хозяйствах России и особенно при контаминации внешней среды яйцами гельминтозоонозов: Ascaris lumbricoides, Ascaris suum, необходимо уточнять диагноз возбудителя болезни на вскрытии, так как прижизненная дифференциальная диагностика аскарид по микроструктуре яиц до вида - не разработана.

Цель изобретения. Целью изобретения является использование изученной нами впервые микроструктуры наружных и внутренних оболочек, зародыша, крышечек (пробочек) и полюсов 2500 яиц аскарид, идентифицированных до вида паразита: Ascaris lumbricoides и Ascaris suum, которые были собраны и исследованы по К.И.Скрябину: методом гельминтологических вскрытий тонких кишок, от домашних свиней на мясокомбинатах Республики Молдова, Украины и России, 5-и кабанов и извлеченных из фекалий человека из Республики Молдова (в период с 1984-2008 гг.), спонтанно зараженных аскариозом и при культивировании яиц аскарид в лабораторных и полевых условиях и которая могла бы быть применена в повышении эффективности при постановки прижизненного диагноза, при выяснении возбудителя болезни не только до рода: Ascaris Linnaeus, 1758, но и до вида: Ascaris lumbricoides и Ascaris suum, или с научной целью для совершенствования систематики гельминтов, или при исследовании (мониторинге) контаминации внешней среды зародышами возбудителей болезни, или в процессе изучения региональной эпизоотологии (=эпидемиологии) гельминтозоонозов.

1. Поставленная цель достигается тем, что при проведении диагностики на аскариоз (=аскаридоз) [2] применяют разработанный нами способ прижизненной дифференциальной диагностики Ascaris lumbricoides и Ascaris suum по микроструктуре яиц, который заключается в отборе яиц аскарид на предметное стекло, просветлении их в смеси 98,5% раствора глицерина плотностью 1,256 и 40%-ной молочной кислоты, взятых в соотношении 1:1, после чего яйца накрывают предметным стеклом и просматривают под микроскопом при увеличениях 600 и 900 под иммерсией, отличающийся тем, что с целью повышения эффективности диагностики проводят определение микроструктурных отличий оболочек, зародыша и полюсов (крышечек) и ставят диагноз болезни до вида возбудителя болезни: Ascaris lumbricoides [с.13] имеет 2 варианта микроструктуры яиц, в 1-м варианте: Фиг.1(a) на одном из полюсов яиц имеет стилет, Фиг.2(а) - А; Фиг.4(а); на другом полюсе: с металлическим блеском (глянцевую), более острую, конусообразную и искривленную верхушку на полюсе яйца, обвитую до апикальной части концами этой микроструктурой (является продолжением концов микроструктуры с другого полюса) в виде сухожилия, выходящим из 2-й плотной (=твердой) оболочки яйца, и расположенная между 2-мя бугорками 2-й плотной (=твердой) оболочки яйца; Фиг.3(а) 1, 2 и А и Б; Фиг.4(а); 2-я плотная (=твердая) оболочка яйца имеет на одной стороне бугорки, а на другой бугорчатость плоская, листьевидная; Фиг.1(a); во 2-м варианте: Фиг.1(б); Фиг.3(б); Фиг.4(б) на одном полюсе имеет крышечку в виде кисточки с тонкой ножкой Фиг.3(б) - А и 3, которая соединена через ножку с зародышем Фиг.3(б) 3 и Б, а кисточкой с 1-й прозрачной оболочкой яйца, через раздвинутый просвет 2-й наружной плотной (=твердой) оболочки и приподнятый крючковидный затвор (на микрофотографии расположен с правой стороны) Фиг.3(б) А и 1, 2; расположенной между 2-мя бугристыми образованиями 2-й наружной плотной (=твердой) оболочки; на базальной части крышечки четко просматривается желто-белого цвета, пластинчатое, зубовидное образование Фиг.3(б)-4, и Фиг.4(б); на другом полюсе Фиг.1(б); Фиг.2(б) крышечка не просматривается, но видно, что полюс не замкнут и в виде крышечки (=пробочки) выступает 3-я внутренняя прозрачная оболочка яйца; на полюсе имеются 3-й бугорка; 2-я наружная плотная (=твердая) оболочка яйца имеет на одной стороне Фиг.1(б) и Фиг.2(б) бахромчатые края, стертую бугристость и гладкую поверхность, а на другой бугорки с выемкой и без волосовидной поверхности и вид 2-х соединенных овалов (кроме полюсов: на одном 3 бугорка Фиг.2(б), а на другом Фиг.3(б) - А, 1, 2, 3, 4, Б; открытая крышечка с кисточкой); зародыш хорошо просматривается в проекции микроскопа.

2. Способ прижизненной дифференциальной диагностики Ascaris lumbricoides и Ascaris suum по микростуктуре яиц по п.1, отличающийся тем, что Ascaris suum имеет 2 варианта микроструктуры яиц [с.14]; в 1-м варианте Фиг.5(а); Фиг.6(а) - А; имеет на одном из полюсов яиц крышечку, орнаментированную на верхушке 2-мя бугристыми образованиями, а в базальной части (собственно у края зародыша): 3-и клыкообразных выроста Фиг.6(а) - 1, 2, 3 и Фиг.8(а); на другом имеет слегка заостренный полюс Фиг.5(а) и Фиг.7(a); 2-я оболочка и зародыш имеют невыраженную бугристость и густую волосовидную поверхность Фиг.5(а) и Фиг.6(а) - Б; 2-й вариант: Фиг.5(б) на одном из полюсов яйцо густо (=плотно) покрыто крупными бугорками Фиг.6(б) - А, 1, 2, Б; на другом полюсе яйцо Фиг.5(б) имеет стилет (напоминающий нос корабля или плодоножку), соединенный с плотной оболочкой яйца, который в проекции микроскопа (при большом увеличении: 900) оказывается функциональной микроструктурой орнаментацией Фиг.7(б) (на микрофотографии виден процесс захвата этим приспособлением - микроорганизма (микрофауны) из водного содержимого 1-й прозрачной оболочки яйца в виде головы хищного зверя поверхность 2-й плотной оболочки яйца Фиг.5(б) и самого зародыша имеют выраженную бугристость и густую волосовидную поверхность (в противоположность с микроструктурой яйца Ascaris lumbricoides). Эти микроструктурные отличия признаков яиц 2-х видов аскарид, поражающие человека, обезьян и свиней, позволяют прижизненно отдифференцировать в 100% случаев: Ascaris lumbricoides и Ascaris suum.

Сопоставительный анализ заявляемого технического решения с прототипом показывает, что заявляемый способ отличается от известных тем, что проводят раздельное сопоставление морфологических: микроструктурных особенностей оболочек, зародыша и крышечек (полярных частей) яиц аскарид и в соответствии с нашими микрофотографиями (чертежи) ставят диагноз болезни до вида гельминта: Ascaris lumbricoides и Ascaris suum.

Эти отличия позволяют сделать вывод о соответствии заявляемого технического решения критерию «новизна». Признаки, отличающие заявляемое техническое решение от прототипа, не выявлены в других технических решениях и поэтому они обеспечивают заявляемому техническому решению соответствие критерию «существенные отличия».

Пример конкретного выполнения предлагаемого способа.

Пример. На мясокомбинате (перед убоем животных) в Республике Молдова выделили 15 свиней, которых пометили ушными бирками и от каждой индивидуально из прямой кишки были взяты пробы фекалий, которые исследовали на наличие яиц аскарид известными методами. В пробах фекалий от свиней (15 голов) и от человека (после дефекации) были выявлены яйца аскарид (ЭИ=100%), что позволило поставить предварительный диагноз болезни по родовым Ascaris Linnaeus, 1758 признакам яйца с толстой бугристой оболочкой - аскариоз (=аскаридоз). В последующем используя разработанный нами «Способ прижизненной дифференциальной диагностики Ascaris lumbricoides и Ascaris suum по микроструктуре яиц» (оболочек, зародыша, строение полюсов и/или крышечек на полюсах яиц), выявили видовые признаки аскарид в сборах нематод (504 экземпляра) из тонкого отдела кишок и желудка убитых и исследованных на вскрытии по методу К.И.Скрябина, свиней и выделенных при дефекации людей из Молдовы (после дегельминтизации), которых мы определили как возбудителей болезни, вызванной видами: Ascaris lumbricoides и Ascaris suum. Ниже приводим последовательность постановки диагноза не только до рода: Ascaris Linnaeus, 1758 (яйца с толстой бугристой или гладкой оболочкой), но и до вида возбудителей инвазии: Ascaris lumbricoides и A. suum.

Предварительно просветленные яйца аскарид смесью 98,5% раствора глицерина плотностью 1,256 и 40%-ной молочной кислоты, взятых в соотношении 1:1, помещали на предметное стекло, после чего накрывали предметным стеклом и исследовали при увеличениях микроскопа: 600 и 900 под иммерсией. При соответствии микроструктурных признаков яиц аскарид /чертежи/: в 1-м варианте: Фиг.1(а); Фиг.2(а) - А, 1, 2, 3, Б; на одном из полюсов имеется стилет, а на другом полюсе: Фиг.1(a); Фиг.3(а) - А, 1, 2; с металлическим блеском (глянцевую), более острую, конусообразную и искривленную на верхушке крышечку и обвитую до апикальной ее части концами этой змеевидной микроструктуры яйца, являющаяся ее продолжением с другого полюса и выходящих из 2-й наружной плотной (=твердой) оболочки, крышечки расположены между двумя бугристыми образованиями 2-й наружной плотной (=твердой) оболочки яйца; 2-я плотная (=твердая) оболочка яйца Фиг.1(a) имеет на одной стороне стертую бугорчатую микроструктуру, а на другой бугорчатость менее выражена и имеет плоский, листьевидный вид; во 2-м варианте: Фиг.1(б); Фиг.3(б) - А, 4; одна из крышечек на полюсе яйца имеет вид кисточки с тонкой ножкой, которая соединена ножкой с зародышем, а кисточкой с 1-й наружной прозрачной оболочкой, через раздвинутый просвет 2-й плотной (=твердой) оболочки и приподнятый крючковидный затвор Фиг.3(б); Фиг.4(б) (на нашей микрофотографии расположен с правой стороны) яйца; в базальной части крышечки (у края зародыша) просматривается желтовато-белого цвета пластинчатое, зубовидная микроструктура; на другом полюсе яйца крышечка не просматривается, так как наружная плотная (=твердая) 2-я оболочка не замкнута на полюсе Фиг.2(б) и роль пробочки выполняет 3-я внутренняя прозрачная оболочка яйца; в верхней части полюса видны 3-й бугорка; 2-я плотная оболочка имеет бахромчатые края Фиг.1(б) и Фиг.2(б) (в виде лепестков подсолнечника) и гладкую поверхность двух соединенных овалов на одной стороне и бугорки с выемками на другой стороне (кроме полюсов: на одном 3 бугорка; на другом открытое отверстие в яйце с бахромчатой (пробочкой) крышечкой). В таком комплексе микроструктурных признаков и в сопоставлении их с нашими микрофотографиями (чертежи) ставится диагноз вида: Ascaris lumbricoides.

При наличии микроструктурных признаков яиц: в 1-м варианте: Фиг.5(а) имеет на одном из полюсов яиц крышечку, орнаментированную на верхушке 2-мя бугристыми микроструктурами Фиг.6(а) - А, а в базальной части крышечки Фиг.6(а) - 1, 2, 3; и Фиг.8(а) с 3-мя клыкообразными выростами; на другом Фиг.5(а) и Фиг.7(а) слегка заостренный полюс; 2-я оболочка и зародыш с невыраженной бугристостью и густой (=плотной) волосовидной поверхностью; 2-й вариант: Фиг.5(б), Фиг.6(б) - А, 1, 2, Б, Фиг.8(б) один из полюсов яйца густо покрыт крупными бугорками; на другом полюсе имеет стилет Фиг.5(б); (напоминает нос корабля или плодоножку), соединенный с плотной оболочкой яйца, который в проекции микроскопа (при увеличении 900) оказывается функциональной микроструктурой (ловушкой для захвата микрофауны из водного содержимого 1-й наружной оболочки яйца) в виде Фиг.7(б) головы хищного зверя; поверхность 2-й наружной плотной оболочки и самого зародыша яйца имеет густой волосовидный вид и выраженную бугристость (в противоположность с микроструктурой яйца Ascaris lumbricoides). Совокупность этих признаков и соответствие их нашим микрофотографиям (Приложение: с.14) позволили поставить диагноз возбудителя болезни, вызванной видом: Ascaris suum.

Таким образом, результаты гельминтологических исследований и на вскрытии подтвердили данные, полученные при использовании предлагаемого способа прижизненной дифференциальной диагностики Ascaris lumbricoides и Ascaris suum по микроструктуре яиц до вида: Ascaris lumbricoides и Ascaris suum - возбудителя болезни, так как микроструктура оболочек, зародыша и полюсов (крышечек) яиц аскарид от человека, обезьян и домашних и диких свиней (=кабанов) имеет свои видовые особенности, которые были впервые изучены и выявлены нами (аналогов в научной литературе нет).

Использование предлагаемого способа прижизненной дифференциальной диагностики при аскаридозе человека, обезьян, домашних и диких свиней обеспечивает по сравнению с существующими следующие преимущества:

1. Сокращает время и снижает трудоемкость исследований за счет исключения необходимости проведения биометрических измерений большого количества яиц. Тем более что выше нами было показано практическое совпадение в размерах яиц аскарид: Ascaris lumbricoides и Ascaris suum (диагностику можно проводить по нескольким яйцам паразита).

2. В результате точного видового диагноза возбудителя болезни: выяснить источник (хозяина паразита) контаминации внешней среды яйцами аскарид, то есть является ли это человек, обезьяна или домашние или дикие свиньи, и тем самым: провести более радикальную дезинвазию внешней среды от возбудителя болезни: аскариоза (=аскаридоза) и сохранить от заражения аскаридами ценных племенных, породистых свиней (особенно поросят).

3. Предотвратить заражение людей (особенно детей) и на грани исчезновения видов обезьян: орангутаны, шимпанзе ларвальными формами паразитов: larva migrans и отдифференцировать виды: Ascaris lumbricoides и Ascaris suum.

4. Способ прижизненной дифференциальной диагностики при аскариозе (=аскаридозе) легко осуществим в лабораторных условиях.

5. Обеспечивает 100% точность постановки прижизненного дифференциального диагноза до вида паразита: Ascaris lumbricoides и Ascaris suum.

Источники информации

1. Мозговой А.А. Аскаридаты животных и человека. // Основы нематодологии. Изд. Академии наук СССР. Под ред. К.И.Скрябина. - Т.II. - Книга I. - М. - 1953. - С.43-118.

2. Котельников Г.А. Гельминтологические исследования животных и окружающей среды: Справочник. - М.: Колос. - 1983. - 208 с., ил.

3. Пасечник В.Е. // Диссер…кандидата ветеринарных наук. - М. - 2000 - 184 с.

4. Пасечник В.Е., Успенский А.В., Микулец Ю.И., Жданова В.Ю. // Методические рекомендации по диагностике, профилактике и мерам борьбы с гельминтозами цирковых животных. - М.: Россельхозакадемии. - 2008. - 50 с.

5. Шумакович Е.Е., Демидов Н.В., Кузнецов М.И. и др. // Гельминтозы жвачных животных. Под ред. проф. Е.Е.Шумаковича. - М.: Колос. - 1968. - 392 с.

Изобретение относится к области ветеринарной медицины. Способ прижизненной дифференциальной диагностики Ascaris lumbricoides и Ascaris suum заключается в отборе яиц аскарид на предметное стекло, просветлении их в смеси 98,5%-ного раствора глицерина плотностью 1,256 и 40%-ной молочной кислоты, взятых в соотношении 1:1, после чего яйца накрывают покровным стеклом и просматривают под микроскопом при увеличениях: 600 и 900 под иммерсией, при этом для диагностики проводят определение микроструктурных отличий яиц и дифференцируют виды аскарид по следующим признакам: Ascaris lumbricoides в 1-м варианте: на одном полюсе имеет стилет; на другом: конусообразно искривленную с металлическим блеском крышечку, обвитую концами микроструктуры, выходящей из 2-й оболочки с противоположного полюса; 2-я оболочка: на одной стороне стертые бугорки; на другой плоские, листьевидные; во 2-м варианте: крышечка имеет вид кисточки, соединенной тонкой ножкой с зародышем, через раздвинутый просвет и приподнятый крючковидный затвор 2-й оболочки, в базальной части - желтовато-белого цвета: зубовидная пластинка; на другом: отверстие не замкнуто на полюсе, роль пробочки выполняет 3-я оболочка; имеет 3 бугорка; 2-я оболочка: 2-а соединенных овала, бахромчатые края и бугорки с выемкой; Ascaris suum 1-й вариант: имеет на одном из полюсов крышечку с 2-мя бугорками на верхушке и с 3-мя клыкообразными выростами в базальной части; на другом: слегка заостренный полюс; 2-й вариант: 2-я оболочка, зародыш: выраженная бугристость; на одном полюсе густо покрыт крупными бугорками; на другом стилет с микроструктурой в виде головы хищного зверя, соединенный с 2-й плотной оболочкой. Способ позволяет прижизненно дифференцировать аскарид по микроструктуре яиц до вида: Ascaris lumbricoides и Ascaris suum. 1 пр., 8 ил.

Способ прижизненной дифференциальной диагностики Ascaris lumbricoides и Ascaris suum, заключающийся в отборе яиц аскарид на предметное стекло, просветлении их в смеси 98,5%-ного раствора глицерина плотностью 1,256 и 40%-ной молочной кислоты, взятых в соотношении 1:1, после чего яйца накрывают покровным стеклом и просматривают под микроскопом при увеличениях: 600 и 900 под иммерсией, отличающийся тем, что для диагностики проводят определение микроструктурных отличий яиц и дифференцируют виды аскарид по следующим признакам: Ascaris lumbricoides в 1-м варианте: на одном полюсе имеет стилет; на другом: конусообразно искривленную с металлическим блеском крышечку, обвитую концами микроструктуры, выходящей из 2-й оболочки с противоположного полюса; 2-я оболочка: на одной стороне стертые бугорки; на другой плоские, листьевидные; во 2-м варианте: крышечка имеет вид кисточки, соединенной тонкой ножкой с зародышем, через раздвинутый просвет и приподнятый крючковидный затвор 2-й оболочки, в базальной части - желтовато-белого цвета: зубовидная пластинка; на другом: отверстие не замкнуто на полюсе, роль пробочки выполняет 3-я оболочка; имеет 3 бугорка; 2-я оболочка: 2 соединенных овала, бахромчатые края и бугорки с выемкой; Ascaris suum 1-й вариант: имеет на одном из полюсов крышечку с 2 бугорками на верхушке и с 3 клыкообразными выростами в базальной части; на другом: слегка заостренный полюс; 2-й вариант: 2-я оболочка, зародыш: выраженная бугристость; на одном полюсе густо покрыт крупными бугорками; на другом стилет с микроструктурой в виде головы хищного зверя, соединенный с 2-й плотной оболочкой.