СПОСОБ ПРИЖИЗНЕННОЙ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЙ ДИАГНОСТИКИ Trichocephalus vulpis И Thominx (Capillaria) aerophilus ПО МИКРОСТРУКТУРЕ ЯИЦ Российский патент 2013 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к области ветеринарной медицины, а более конкретно к паразитологии (гельминтологии) для постановки прижизненного дифференциального диагноза гельминтозоонозов по микроструктуре яиц: Trichocephalus vulpis (поражающий собак, волков, хорьков, лисиц, человека) и Thominx (Capillaria) aerophilus (поражающий бурых медведей, кошек, собак, волков, лисиц, барсуков, песцов, куниц, норок, соболей и других пушных зверей семейств: собачьих, куньих, кошачьих и человека) и предназначенный для использования при постановке прижизненного диагноза методами копроовоскопии при исследовании внешней среды и больных животных, ставя диагноз не только до рода гельминта, но и до вида возбудителя болезни.

Известны работы по прижизненной дифференциальной диагностики по микро- и ультраструктуре яиц трихоцефал Пасечника В.Е., Pasechnik V.E. и патент №2396069 Пасечника В.Е., 1997, 1999, 2000, 2010 /2, 3, 4, 5, 6/, в которых автор приводит данные о впервые в научном мире (в соответствии с научной литературой) изученной им микроструктуре и ультраструктуре яиц 3-х видов трихоцефал от жвачных животных под световой и сканирующей электронной микроскопией и выявленных им наиболее характерных признаков по ультраструктуре яиц.

Приведенные Пасечником В.Е., Pasechnik V.E /2, 3, 4, 5, 6/ дифференциальные признаки очень ценные при разработке дифференциальной посмертной и прижизненной диагностики трихоцефал по микроструктуре яиц гельминта имеют большое научное и практическое значение.

Однако работы Пасечника В.Е. Pasechnik V.E. /2, 3, 4, 5, 6/ имеют некоторые недостатки: а) часть работ проведена под сканирующим электронным микроскопом; б) все проведенные научные работы Пасечника В.Е. Pasechnik V.E. /2, 3, 4, 5, 6/ были основаны на исследовании микро- и ультраструктуры яиц трихоцефал от сельскохозяйственных и диких жвачных животных.

А. Данная работа основана на исследованиях и изучении микроструктуры яиц трихоцефал и томинксов от хищных животных.

Известно по работе Г.А.Котельникова (1984) /I/ (см. Справочник - страница 112), что яйца Trichocephalus vulpis (у собачьих) коричневого цвета, бочковидной формы с пробочками на полюсах, величина 0,083-0,093×0,037-0,040 мм и яйца Thominx aerophilus (у пушных зверей семейства собачьих) сходны с яйцами капиллярий, несколько ассиметричные, на оболочке - сеть извилистых гребневидных выростов, цвет желтоватый, величина 0,062-0,077×0,033-0,037 мм.

Приведенные морфологические признаки по Г.А.Котельникову /1/ имеют свою научную ценность при постановке диагноза, но имеют и недостатки:

а) использовать морфологические признаки и биометрические данные по Г.А.Котельникову /1/ возможно, но только при условии, что мы будем обследовать хищных путем непосредственного взятия проб из экссудата дыхательных путей, но в практическом плане это возможно только от домашних и дрессированных хищных, в редких случаях от пушных зверей в звероводческих хозяйствах и наиболее приемлемо в медицинской практике при исследовании человека; б) однако при исследовании хищных даже и в цирках, не говоря о зоопарках, заповедниках и крупных зверей: медведи, тигры, львы, гепарды, пантеры и др., это нереально, так как обследовать иногда приходится большое количество животных.

Однако Г.А.Котельников /1/ предлагает эти видовые признаки яиц использовать при прижизненной дифференциальной диагностике Trichocephalus vulpis и Thominx (Capillaria) aerophilus при исследовании хищных методами копроовоскопии: флотации, седиментации, комбинированными, так как известно, что прижизненно заражение домашних и диких хищных и человека трихоцефалами и томинксами может быть установлено овоскопическим методом исследования фекалий (копроовоскопией), так как в биологическом цикле этих паразитов есть общая особенность: выделение яиц гельминтов во внешнюю среду из организма дефинитивного хозяина (хищники, человек) происходит с экскрементами.

Поэтому исследователи (практические врачи, ученые паразитологи) сталкиваются с проблемой: идентификация до вида по имеющимся на сегодняшний день морфологическим данным отсутствует, так как видовая микроструктура яиц Trichocephalus vulpis и Thominx (Capillaria) aerophilus практически не изучена, так как внешне они очень похожи: бочонкообразные с пробочками на полюсах.

Кроме того, Г.А.Котельников /1/ предложил использовать и биометрические данные: величина яиц Trichocephalus (Trichuris) vulpis 0,083-0,093 мм × 0,037-0,040 мм, a Thominx aerophilus 0,062-0, 077 мм × 0,033-0,037 мм, то есть разница в их размере есть, но иногда размеры яиц почти совпадают (по результатам наших измерений 500 яиц): Trichocephalus.vulpis: 0,083 мм × 0,037 мм и Thommx.(Capillaria) aerophilus: 0,08 мм × 0,037 мм.

Следовательно, чтобы обнаружить разницу в размерах яиц: Trichocephalus vulpis и Thominx (Capillaria) aerophilus, необходимо измерение большого количества яиц, что в практике редко бывает особенно при субклинической инвазии и при исследовании:

- обезличенных экскрементов от людей и домашних хищных в черте города - на детских площадках и др.;

- при контаминации внешней среды на предмет обнаружения и дифференциации яиц гельминтозоонозов, а морфологически по микроструктуре яиц довольно сложно поставить видовой диагноз, так как микроструктура яиц этих видов практически не изучена.

Поэтому все исследователи, каким бы известным прижизненным методом не пользовались, флотации по Фюллеборну и его модификации, седиментации (осаждения) по Эрлиху и его модификации, комбинированным по Дарлингу и его модификации, ставят предположительный диагноз болезни: трихоцефалез или томинксоз, что иногда приводит к диагностическим ошибкам, если диагноз не подтверждается на вскрытии, или после дегельминтизации животных, т.е. после обнаружения половозрелых паразитов (гельминтов).

Однако в последнем случае бывает очень часто, что гельминтов не обнаруживают, так как для этого необходимо просмотреть очень большое количество экскрементов и, кроме того, это отнимает большое количество времени у врачей, но может и быть результатом просмотра недостаточно квалифицированного лаборанта или врача.

Известные методы прижизненной диагностики: флотации, седиментации, комбинированный имеют один существенный недостаток: они позволяют исследователю поставить только предположительный диагноз заболеванию: трихоцефалез или/и возможно томинксоз. Однако это является диагнозом рода А, в научных и в практических условиях необходимо уточнять диагноз болезни до вида возбудителя инвазии: Trichocephalus vulpis, Thominx (Capillaria) aerophilus.

Особенно это важно при заболевании высокоценных племенных, пушных и охотничье-промысловых и цирковых и породистых домашних животных и на грани исчезновения видов зверей в Российской Федерации, которых для уточнения диагноза до вида трихоцефал и томинксов Trichocephalus vulpis и Thominx (Capillaria) aerophilus - возбудителя болезни необходимо исследовать посмертно (на вскрытии), что влечет за собой иногда существенные экономические потери.

Кроме того, заболевание животного с летальным исходом может быть вызвано и смешанной инвазией, т.е. видом Trichocephalus vulpis и Thominx (Capillaria) aerophilus, что влечет за собой иногда снижение эффективности методов лечения, так как при данной болезни отсутствует прижизненный способ диагностики до вида возбудителя болезни: Trichocephalus (Trichuris) vulpis и Thominx (Capillaria) aerophilus.

Цель изобретения. Целью изобретения является использование изученной нами впервые микроструктуры оболочек, пробочек, шейки пробочек и зародыша зрелых 2500 яиц трихоцефал и томинксов, извлеченных из вагины самок каждого идентифицированного до вида паразита, которые были собраны методом гельминтологических вскрытий от собак, кошек и лисиц, спонтанно зараженных трихоцефалезом и томинксозом в России, Молдове и Украине, и которая могла бы быть применена в повышении эффективности способа и постановки прижизненного диагноза не только до рода, как при известных методах прижизненной диагностики (флотации, седиментации, комбинированным), но и до вида трихоцефал и томинксов по микроструктуре яиц: Trichocephalus (Trichuris) vulpis и Thominx (Capillaria) aerophilus -возбудителей болезни.

1. Поставленная цель достигается тем, что при проведении диагностики на трихоцефалез и томинксоз одним из известных методов: флотации, седиментации или комбинированным /1/ применяют разработанный нами способ прижизненной дифференциальной диагностики Trichocephalus vulpis и Thominx (Capillaria) aerophilus, который заключается в отборе на предметное стекло яиц, просветления их в 98,5% растворе глицерина (плотностью 1,256) плюс 40% молочная кислота в соотношении 1:1, накрывают предметным стеклом и просматривают под микроскопом при увеличениях: 600, 1200 и 900 под иммерсией, отличающийся от известных методов прижизненной диагностики флотации, седиментации, комбинированный тем, что с целью повышения эффективности диагностики проводят определение микроструктурных отличий яиц, ставя диагноз болезни не только до рода, но и до вида: Trichocephalus vulpis (см. Приложение - с.14), имеет длинные с выраженной шейкой и широкими шапочками и выступающие над поверхностью оболочек пробочки на полюсах яиц; Фиг.2(б) - А; нежную, тонкую, прозрачную 1-ю наружную оболочку, которая охватывает все яйцо и видна вблизи полюсов в виде Фиг.1(а); кристаллических микроструктур, окружающих полюса яиц Фиг.1(б); яйца имеют: на 2-й наружной кератизированной оболочке шипы и на полюсах стилеты Фиг.1(б); 3-я внутренняя оболочка видна в области пробочек в виде полупрозрачной трехконечной микроструктуры, выходящей из яйца во внутреннее розового цвета жидкостное пространство 1-й прозрачной оболочки Фиг.2(а); шейки пробочек винтообразной формы с 3-мя кольцами, из которых 3-е по счету от апикального конца - выпуклое и шире остальных в два раза Фиг.2(б): 1, 2, 3; 3-е кольцо скрепляет основание шейки пробочек с 4-й внутренней прозрачной оболочкой зародыша Фиг.2(б): 3 и Б.

2. Способ прижизненной дифференциальной диагностики Trichocephalus vulpis и Thominx aerophilus по п.1, отличающийся тем, что Thominx (Capillaria) aerophilus имеет (см. Приложение - с.15) асимметричные яйца и короткие непрозрачные пробочки на полюсах яиц Фиг.3(а), Фиг.4(б); 1-я прозрачная оболочка яйца окружает все яйцо и видна на полюсах и в области пробочек Фиг.3(а); Фиг.3(б); поверхность 2-й наружной кератизированной оболочки яиц - волокнистая и мелкобугорчатая Фиг.4(а); пробочки состоят: из шапочки Фиг.4(а) - А, 2-х расположенных треугольником под ней округлых отростков Фиг.4(а) - Б и В и нижнего (3-го) радиального ряда, состоящего из 5 отростков, расположенных в виде микроструктуры, напоминающей клавиши музыкального инструмента Фиг.4(а): 1, 2, 3, 4, 5; все элементы пробочки имеют бело-желтый цвет.

Эти микроструктурные видовые отличия признаков яиц трихоцефал и томинксов позволяют отдифференцировать в 100% случаев виды Trichocephalus (Trichuris) vulpis и Thominx (Capillaria) aerophilus, не прибегая к убою животных.

Сопоставительный анализ заявляемого технического решения с прототипом (флотации, седиментации и комбинированные) показывает, что заявляемый способ отличается от известных тем, что проводят раздельное сопоставление морфологических особенностей яиц и в соответствии с нашими рисунками (микрофотографиями) ставят диагноз болезни не только до рода, но и до вида гельминта: Trichocephalus (Trichuris) vulpis и Thominx (Capillaria) aerophilus.

Эти отличия позволяют сделать вывод о соответствии заявляемого технического решения критерию «новизна». Признаки, отличающие заявляемое техническое решение от прототипа, не выявлены в других технических решениях и поэтому они обеспечивают заявляемому техническому решению соответствие критерию «существенные отличия».

Примеры конкретного выполнения предлагаемого способа

Пример. От спонтанно зараженных (в Молдове) 5 собак видом Trichocephalus (Trichuris) vulpis и 5 кошек видом Thominx (Capillaria) aerophilus индивидуально из прямой кишки были взяты известными методами: флотации, комбинированным и седиментации пробы фекалий, которые исследовали на наличие яиц трихоцефалид и капилляриид и были выделены для исследования по 500 яиц от каждой группы инвазированных хищных.

В пробах экскрементов от хищных были выявлены яйца, похожие по родовым признакам на яйца трихоцефалид и капилляриид, что позволило поставить предположительный диагноз: трихоцефалез или/и томинксоз.

Яйца паразита, попавшие в поле зрения, предварительно просветленные смесью 98,5% раствора глицерина (плотность 1,256) и 40% молочной кислоты в соотношении 1:1, помещали на предметное стекло, после чего яйца накрывали покровным стеклом и подвергали исследованию по разработанному нами способу с учетом микроструктурных видовых признаков яиц Trichocephalus vulpis и Thominx aerophilus при увеличениях микроскопа: 600, 1200 и 900 под иммерсией.

В процессе исследования использовали изученные нами впервые микроструктурные видовые признаки яиц в совокупности с микрофотографиями (Приложение): Trichocephalus (Trichuris) vulpis и Thominx (Capillaria) aerophilus.

При соответствии морфологических признаков (см. Приложение - с.14): пробочки длинные с выраженной шейкой и широкими шапочками и выступающие над поверхностью оболочек на полюсах яиц Фиг.2(б) - А;

имеют нежную тонкую прозрачную 1-ю оболочку, которая охватывает все яйцо и отчетливо видна вблизи полюсов в виде кристаллических микроструктур Фиг 1(а), окружающих полюса яиц Фиг.1(б);

яйца имеют: на 2-й наружной кератизированной оболочке шипы и на полюсах стилеты Фиг.1(б);

3-я внутренняя оболочка видна в области пробочек в виде полупрозрачной трехконечной микроструктуры, выходящей из яйца Фиг.2(а) в жидкостное розового цвета пространство 1-й прозрачной оболочки яиц;

шейки пробочек винтообразной формы с 3-мя кольцами, из которых 3-е по счету от апикального конца - выпуклое и шире остальных (предыдущих) в два раза Фиг.2(б) - 1, 2, 3;

3-е кольцо у основания шеек пробочек выполняет роль связующего звена пробочки с 4-й внутренней прозрачной оболочкой зародыша. Фиг.2(б) 3 и Б;

В таком комплексе признаков и при сопоставлении их с нашими микрофотографиями (Приложение - с.14) ставится диагноз вида: Trichocephalus (Trichuris) vulpis.

При исследовании 500 яиц от второй группы, используя впервые изученные нами микроструктурные признаки (см. Приложение - с.15):

яйца асимметричные и имеют короткие непрозрачные пробочки на полюсах Фиг.3(а) и Фиг.4(б);

1-я наружная оболочка окружает все яйцо и видна на полюсах и в области пробочек Фиг.3(а) и Фиг.3(б);

поверхность 2-й наружной кератизированной оболочки яиц волокнистая и мелкобугорчатая Фиг.4(а);

пробочки состоят из: шапочки Фиг.4(а) - А; 2-х расположенных под ней округлых отростков Фиг.4(а) - Б и В, и нижнего (3-го) радиального ряда, состоящего из 5 отростков, расположенных в виде микроструктуры, напоминающей клавиши музыкального инструмента; Фиг.4(а) - 1, 2, 3, 4, 5; все элементы пробочки имеют бело-желтый цвет.

Совокупность этих признаков и соответствие их нашим микрофотографиям (Приложение - с.15) позволило поставить диагноз возбудителя болезни, вызванной видом: Thominx (Capillaria) aerophilus.

После проведения вышеуказанных исследований кошек и собак убили и подвергли гельминтологическому исследованию по методу К.И.Скрябина: толстый отдел кишечника, слепую кишку и носовые ходы, большие бронхи, легкие, трахею. В группе, состоящей из 5 кошек, обнаружили паразитов вида Thominx (Capillaria) aerophilus, а в другой группе, состоящей из 5 собак, Trichocephalus (Trichuris) vulpis.

Таким образом, результаты гельминтологических вскрытий подтвердили данные, полученные при использовании предлагаемого способа прижизненного дифференциального диагноза до вида: Trichocephalus vulpis и Thominx (Capillaria) aerophilus, возбудителя болезни, так как микроструктура яиц трихоцефал и томинксов от домашних и диких хищных имеет свои видовые особенности, которые были выявлены и изучены нами (в соответствии с данными научной литературы) впервые в мировой науке.

Использование предлагаемого способа прижизненной дифференциальной диагностики при трихоцефалезе и томинксозе животных обеспечивает по сравнению с существующими: флотации, комбинированным и седиментации следующие преимущества:

1. Сокращает время и снижает трудоемкость исследований за счет исключения необходимости проведения измерений большого количества яиц трихоцефал и томинксов (диагностику можно проводить по нескольким яйцам паразита, попавшим в поле зрения исследователя) и исключает необходимость исследования на вскрытии ценных пород домашних и диких видов хищных и пушных зверей (лисиц, соболей).

2. Экономически выражается в сохранении больших финансовых сумм в результате точного видового диагноза возбудителя болезни: Trichocephalus (Trichuris) vulpis при трихоцефалезе и Thominx (Capillaria) aerophilus при томинксозе и, соответственно, сохранении высокой работоспособности домашних и диких цирковых животных и продуктивности пушных зверей (лисиц, соболей) и предотвращении гибели больных трихоцефалезом (особенно молодняк - щенков) и томинксозом животных и заражения человека (особенно детей).

3. Разработкой более эффективной терапии применительно к конкретному виду Trichocephalus vulpis и Thominx (Capillaria) aerophilus - возбудителей болезней: трихоцефалеза и томинксоза диких и домашних хищных и человека.

4. Способ прижизненной дифференциальной диагностики при трихоцефалезе и томинксозе домашних и диких хищных и человека легко осуществим в лабораторных условиях.

5. Обеспечивает 100% точность постановки прижизненного дифференциального диагноза трихоцефал и томинксов от хищных не только до рода, но и до вида паразитарных зоонозов: Trichocephalus vulpis и Thominx (Capillaria) aerophilus по микроструктуре яиц.

Источники информации

1. Котельников Г.А. «Гельминтологические исследования животных и окружающей среды»: Справочник - М.: Колос - 1984 - 208 с.

2. Пасечник В.Е. К морфологии видов Trichuris (Trichocephalus) ovis Abildgaard, 1795 и Т.skrjabini Baskakov, 1924 // Труды Всероссийского института гельминтологии имени К.И.Скрябина. - М. - 1999 - Том 35 - С.85-120.

3. Пасечник В.Е. Новый хозяин Trichocephalus (= Trichuris) capreoli Artjuch, 1948. // Труды Всероссийского института гельминтологии имени К.И.Скрябина. - М. - 2000. - Том.36. - С.127-140.

4. Пасечник В.Е. Сканирующая электронная микроскопия Trichocephalus (Trichuris) capreoli Artjuch, 1948. // Труды Всероссийского института гельминтологии имени К.И.Скрябина. - М. - 2000 - Том 36 - С.141-156.

5. Пасечник В.Е. Патент №2396069: заявка 2008140245/13, 13.10.2008; дата публикации заявки 20.04.2010; // Бюл. Федеральной службы по интеллектуальной собственности, патентам и товарным знакам Российской Федерации. - 10.08.2010. - №22.

6. Pasechnik V.E. Ultrastructure of eggs surface of the genus Trichocephalus Schrank, 1788 // Second English language International Nematology Simposium of the Societi of Nematologist. - Abstract. - Moscow. - 23-30 August 1997. - P.20.

7. Скрябин К.И., Петров А.М. Основы ветеринарной нематодологии. М.: Колос - 1964. - С.476-480, 490-494.

Изобретение относится к области ветеринарной медицины и предназначено для прижизненной дифференциальной диагностики Trichocephalus vulpis и Thominx (Capillaria) aerophilus. Способ включает отбор яиц трихоцефал и томинксов на предметное стекло, просветление их в смеси 98,5% раствора глицерина плотностью 1,256 и 40%-ной молочной кислоты, взятых в соотношении 1:1. Затем яйца накрывают покровным стеклом и просматривают под микроскопом при увеличениях: 600, 1200 и 900 под иммерсией. Trichocephalus vulpis имеет длинные с выраженной шейкой и широкими шапочками и выступающие над поверхностью оболочек пробочки на полюсах яиц; нежную, тонкую, прозрачную 1-ю наружную оболочку, которая охватывает все яйцо и видна вблизи полюсов в виде кристаллических микроструктур; яйца имеют: на 2-й оболочке шипы и на полюсах стилеты; 3-я оболочка видна в области пробочек в виде полупрозрачной трехконечной микроструктуры, выходящей из яйца в жидкостное пространство 1-й оболочки; шейки пробочек винтообразной формы с 3 кольцами; 3-е кольцо выпуклое и шире остальных в 2 раза, скрепляет основание шейки пробочек с внутренней оболочкой зародыша, Thominx (Capillaria) aerophilus имеет асимметричные яйца и короткие непрозрачные пробочки на полюсах яиц; 1-я оболочка окружает все яйцо и видна на полюсах и в области пробочек; поверхность 2-й наружной кератизированной оболочки яиц волокнистая и мелкобугорчатая; пробочки состоят из шапочки, 2-х расположенных треугольником под ней округлых отростков и нижнего (3-го) радиального ряда, состоящего из 5 отростков; все элементы пробочки имеют бело-желтый цвет. Способ позволяет прижизненно дифференцировать Trichocephalus vulpis и томинксов Thominx (Capillaria) aerophilus от домашних и диких хищных до вида по микроструктуре яиц. 8 ил., 1 пр.

Способ прижизненной дифференциальной диагностики Trichocephalus vulpis и Thominx (Capillaria) aerophilus пo микроструктуре яиц, заключающийся в отборе яиц на предметное стекло, просветления их в смеси 98,5%-ного раствора глицерина (плотностью 1,256) и 40%-ной молочной кислоты, взятых в соотношении 1:1, после чего яйца накрывают покровным стеклом и просматривают под микроскопом при увеличениях 600, 1200 и 900 под иммерсией, отличающийся тем, что для диагностики проводят определение микроструктурных отличий яиц и дифференцируют Trichocephalus vulpis и Thominx (Capillaria) aerophilus no следующим признакам: Trichocephalus vulpis имеет длинные с выраженной шейкой и широкими шапочками и выступающие над поверхностью оболочек пробочки на полюсах яиц; нежную, тонкую, прозрачную 1-ю наружную оболочку, которая охватывает все яйцо и видна вблизи полюсов в виде кристаллических микроструктур; яйца, имеют на 2-й оболочке шипы и на полюсах стилеты; 3-я оболочка видна в области пробочек в виде полупрозрачной трехконечной микроструктуры, выходящей из яйца в жидкостное пространство 1-й оболочки; шейки пробочек винтообразной формы с 3 кольцами; 3-е кольцо выпуклое и шире остальных в 2 раза, скрепляет основание шейки пробочек с внутренней оболочкой зародыша, Thominx (Capillaria) aerophilus имеет асимметричные яйца и короткие, непрозрачные пробочки на полюсах яиц; 1-я оболочка окружает все яйцо и видна на полюсах и в области пробочек; поверхность 2-й наружной кератизированной оболочки яиц волокнистая и мелкобугорчатая; пробочки состоят из шапочки, 2 расположенных треугольником под ней округлых отростков и нижнего (3-го) радиального ряда, состоящего из 5 отростков; все элементы пробочки имеют бело-желтый цвет.