СПОСОБ ДЕТЕКТИРОВАНИЯ ПАРАМАГНИТНЫХ КОМПЛЕКСОВ МАРГАНЦА КАК МАРКЕРОВ АТЕРОСКЛЕРОЗА Российский патент 2012 года по МПК G01N33/52 

Изобретение относится к медицине, преимущественная область его использования - диагностика атеросклероза.

Одной из составляющих в развитии атеросклеротического процесса является кальцификация атеросклеротической бляшки. Она рассматривается как индикатор нестабильности этой патологической структуры. Разрывы кальцифицированных бляшек приводят к грозным осложнениям в виде инфарктов и инсультов.

Причины и механизм кальцификации в атеросклеротической бляшке остаются неясными. Этот процесс вначале затрагивает липидную сердцевину атеромы вблизи клеток, вовлеченных в процесс воспаления и инфильтрирующих бляшку [1, 6]. Апоптозные тела и остатки клеток выступают в роли центров нуклеации [5], где в результате воспаления, накопления липопротеинов и фосфолипидов откладывается карбонизированный гидроксиапатит, как правило, с дефицитом кальция, замещенным водородными фосфатными группами. В крови в нормальных условиях присутствуют нанокристаллы гидроксиапатита. При атеросклерозе, обладая высокой адгезионной способностью, они задерживаются на поверхности просвета атеросклеротически измененных артерий, а затем проникают в сердцевину атеросклеротической бляшки.

Методами высокочастотной ЭПР спектроскопии нами ранее показано, что спектроскопические и релаксационные характеристики органоминеральных радикалов в атеросклеротической бляшке коррелируют со степенью ее кальцификации. Поиск маркеров, позволяющих охарактеризовать состояние органоминерального матрикса в атеросклеротической бляшке и предсказать возможность прогрессирования ее кальцификации, является актуальной задачей. Этими маркерами могут быть комплексы переходных металлов, таких как Fe, Mn, Сu. Валентность переходного металла, структуру и локализацию парамагнитного комплекса в органоминеральном матриксе атеросклеротической бляшки представляется возможным определить методом ЭПР.

Учитывая высокую абсорбционную способность гидроксиапатита, можно полагать, что этот биоминерал, сформированный в пределах атеросклеротической бляшки, будет активно поглощать комплексы металлов, которые локализованы в тканевом матриксе стенки сосуда и высвобождаются из присутствующих здесь клеток в ходе их функционирования и особенно в результате гибели. Одним из таких металлов является Мn, который наиболее значим в составе ключевой молекулы в системе антиоксидантной защиты - Мn-супероксиддисмутазы (MnSOD). Этот митохондриальный фермент катализирует реакцию дисмутации супероксидных анионов (O₂ ^•-) в перекись водорода (Н₂О₂) и О₂. MnSOD замедляет изъязвление атеросклеротической бляшки, уменьшает опосредованную окисленными липопротенинами низкой плотности (ox-LDL) гибель макрофагов [3, 7], сдерживает дисфункцию эндотелиальных клеток [4] и окисление липопротеинов низкой плотности (LDL) [2]. Известно, что в ходе атерогенеза происходит гибель клеток в атеросклеротической бляшке. При этом ион Мn из MnSOD митохондрий может оказаться в тканевом матриксе. Исследования по прямому обнаружению Мn из MnSOD митохондрий в доступных заявителю источниках информации из исследованного заявителем уровня техники не выявлено. Его присутствие в тканевом матриксе может дать существенную информацию о природе и выраженности атерогенеза.

Заявителем проведен анализ источников литературы. Работы по анализу содержания марганца в органоминеральном матриксе атеросклеротической бляшки отсутствуют. Из исследованного уровня техники на дату подачи заявки заявителем не выялены технические результаты, направленные на реализацию поставленной цели в заявленном техническом решении.

Аналогами заявленного технического решения могут быть данные по анализу:

- содержания переходных металлов (Fe, Сu, Мn, Zn) в минерализованном матриксе кости;

- эффектов введения марганца в синтетический гидроксианатит для улучшения его интеграции в костную ткань в условиях имплантации;

- содержания переходных металлов (Fe и Сu) в атеросклеротически измененной стенке артерий методом ЭПР.

Наиболее близким прототипом заявленного технического решения с точки зрения заявленных целей (диагностика атеросклероза), конкретных задач (определение содержания переходных металлов) и применяемых методов (ЭПР) могут служить работы группы авторов из Института исследования сердца в г.Сиднее (Австралия) [8, 9].

Исследованиями этой группы авторов, проведенными с использованием метода ЭПР, было показано накопление меди и железа во внутренней оболочке артерии при атеросклерозе. Наибольшее внимание в этих работах было уделено железу. Накопление железа во внутренней оболочке артерии (но не в самой атеросклеротической бляшке, расположенной в составе этой оболочки) положительно коррелировало с уровнем холестерина и патологическим окислением биомолекул и не коррелировало с уровнем кальция. Полученные результаты позволили заявителю сформулировать представление об ухудшении прогноза течения атеросклероза при накоплении железа.

Анализ материалов прототипа, выполненный заявителем, выявил следующее:

- в указанных работах не было исследовано содержание марганца, одного из наиболее важных переходных металлов в антиоксидантной защите ткани, непосредственно в атеросклеротической бляшке;

- в кальцифицированной атеросклеротической бляшке не изучено присутствие парамагнитных комплексов марганца в органоминеральном матриксе и непосредственно в связи с главным его минеральным компонентом - гидроксиапатитом;

- не установлена отрицательная корреляция между степенью кальцификации атеросклеротической бляшки и присутствием в ней парамагнитных комплексов марганца, что важно для прогноза развития атеросклеротического процесса.

Целью заявленного способа является устранение вышеперечисленных недостатков прототипа, что позволит обеспечить достижение новых технических результатов, а именно:

- улучшить диагностику атеросклеротического поражения стенки артерии на основе регистрации парамагнитных центров Мn²⁺ в органоминеральном матриксе атеросклеротической бляшки методом высокочастотного ЭПР;

- повысить информативность диагностики атеросклеротического поражения стенки сосуда, связанного с процессом кальцификации, что открывает новые возможности для уточнения диагноза, в том числе и стадии заболевания.

Способ диагностики атеросклероза методом высокочастотной ЭПР-биопсии, заключающийся в получении образца ткани из стенки артерии в результате проведения биопсии или в ходе хирургической операции, лиофилизации образца биологической ткани, регистрирации спектра ЭПР и измерения времен релаксации парамагнитных комплексов Мn²⁺ на сертифицированном ЭПР спектрометре W-диапазона, позволяет оценить степень кальцификации атеросклеротической бляшки и прогнозировать течение атеросклеротического процесса.

Заявленный способ характеризуется следующей последовательностью этапов:

а) получение образца ткани из стенки артерии в результате проведения биопсии или в ходе хирургической операции с соблюдением процедурных и этических норм;

б) лиофилизация образца биологической ткани;

в) помещение образца в стандартную кварцевую ампулу спектрометра ЭПР;

г) регистрация спектра ЭПР парамагнитных центров Mn²⁺ и измерение времен релаксации этих центров на сертифицированном ЭПР спектрометре W-диапазона.

Достигнутый результат по заявленному решению состоит в улучшении диагностики атеросклеротического поражения стенки артерии на основе регистрации парамагнитных центров Мn²⁺ в тканевом матриксе атеросклеротической бляшки методом ЭПР.

Заявителем впервые:

- методом ЭПР определено присутствие в матриксе атеросклеротической бляшки парамагнитных центров Мn²⁺;

- методом электронного спинового эха установлено, что выраженность кальцификации выше в тех образцах атеросклеротической бляшки, в которых было зарегистрировано меньшее локальное содержание Мn²⁺. Эта отрицательная корреляции подтверждена методом атомной масс-спектрометрии с индуктивно-связанной плазмой при измерении содержания Мn в матриксе атеросклеротической бляшки.

Заявителем впервые сформулировано представление о том, что нанокристаллы гидроксиапатита, поступая из кровотока, накапливаются в тканевом матриксе формирующейся атеросклеротической бляшки во внутренней оболочке артерии, где активируют выработку супероксида О₂ ^- и благодаря высокой адгезии и ионообменным свойствам абсорбируют ионы Мn²⁺.

По мнению заявителя, выявление в органоминеральном матриксе атеросклеротической бляшки парамагнитных центров Мn²⁺ позволяет уточнить степень его кальцификации и прогнозировать тяжесть течения патологического процесса.

Заявленное техническое решение поясняется Фиг.1, Фиг.2.

На Фиг.1 представлены спектры высокочастотного ЭПР в образцах из всех слоев лиофилизированной стенки сосуда с атеросклеротической бляшкой (Высокочастотная ЭПР-спектроскопия образцов из всех слоев лиофилизированной стенки артерии с атеросклеротической бляшкой). Сверху вниз: внутренняя оболочка без минеральных отложений; интима с минеральными отложениями; средняя оболочка сосуда (без минеральных отложений); наружная оболочка (без минеральных отложений). Во всех исследованных образцах наблюдается спектр ЭПР ионов Мn²⁺, состоящий из шести линий сверхтонкой структуры. Константа сверхтонкого взаимодействия А (т.е. взаимодействия магнитных моментов электронной оболочки и ядра иона Мn²⁺⁾ одинакова для всех спектров ЭПР и равняется 9.28 мТ. В магнитном поле, соответствующем g-фактору (фактор спектроскопического расщепления Ланде) 2.06, наблюдается дополнительный сигнал, интерпретируемый как ЭПР Сu-содержащей биомолекулы.

Фиг.2 (Распад поперечной намагниченности ионов Мn²⁺ в атеросклеротических бляшках с различной степенью кальцификации) иллюстрирует распад поперечной намагниченности ионов Мn²⁺ в атеросклеротических бляшках с различной степенью кальцификации: ● - сильная степень кальцификации; ■ - средняя степень кальцификации. В образцах со слабой степенью кальцификации сопоставление сигналов ЭПР стационарного и импульсного режимов позволяет определить, что время поперечной релаксации ионов Мn²⁺ меньше 100 не, что свидетельствует о высокой локальной концентрации этих ионов.

Заявленное техническое решение представлено следующими примерами конкретного выполнения.

Заявителем изучен 21 образец из стенки аорты больных атеросклерозом мужчин в возрасте 40-60 лет. Материал получен в ходе патологоанатомических исследований, проведенных в соответствии с требованиями комитета по этике Межрегионального клинико-диагностического центра (г.Казань). Часть материала изучена при помощи стандартных гистологических методов. Образцы были классифицированы по степени кальцификации. Образцы промывали физиологическим раствором и лиофилизировали (Р=5·10^-5 мбар, Т=-50°С). Полученные образцы изучали методами электронной сканирующей микроскопии (Philips XL30ESEM), рентгеноспектрального электронно-зондового (микрозондового) (приставка EDAX) и рентгеноструктурного анализов.

Спектры ЭПР регистрировали на спектрометре W-диапазона (93.5 ГГц) Elexsys 680 (Bruker), с применением стационарного и импульсного режимов. Применяли стандартные двух- и трехимпульсные последовательности для измерения времен релаксации и спектров ЭПР по амплитуде первичного электронного спинового эха.

Спектры двойного электронно-ядерного резонанса (ДЭЯР) измеряли с использованием импульсной последовательности Мимса. Исследования проводили в диапозоне температур (20-300)К.

Образцы аорты человека были препарированы с выделением характерных областей, таких как интима без минеральных отложений; интима с минеральными отложениями; средняя оболочка сосуда (без минеральных отложений), наружная оболочка (без минеральных отложений). На Фиг.1 представлены спектры высокочастотного ЭПР в полученных образцах. Во всех исследованных образцах наблюдается спектр ЭПР ионов Мn²⁺ состоящий из шести линий сверхтонкой структуры. Константа сверхтонкого взаимодействия А (т.е. взаимодействия магнитных моментов электронной оболочки и ядра иона Мn²⁺) одинакова для всех спектров ЭПР и равняется 9.28 мТ. В магнитном поле, соответствующем g-фактору (фактор спектроскопического расщепления Ланде) 2.06, наблюдается дополнительный сигнал, интерпретируемый как ЭПР Cu-содержащей биомолекулы.

В дальнейшем для исследований отбиралась только область интимы с минеральными отложениями, где и присутствуют атеросклеротические бляшки. Для определения кальцификации тканевого матрикса с помощью электронной сканирующей микроскопии были получены микрофотографии рельефа поверхности разреза внутренней оболочки аорты больных атеросклерозом. Выявлены изменения в структуре ткани, связанные с увеличением доли минеральной компоненты в атеросклеротической бляшке в виде сферических глобул гидроксиапатита.

Для определения степени кальцификации тканевого матрикса было определено отношение Са/Р во всех образцах методом микрозондового анализа. Это отношение характеризует степень кальцификации органоминеральных агрегатов.

Были выбраны образцы атеросклеротических бляшек, отличающиеся по степени кальцификации - «сильная» Са/Р=1.66, «средняя» Са/Р=0.64 и «слабая» Са/Р=0.18. В этих образцах методом высокочастотного ЭПР были измерены релаксационные характеристики парамагнитных центров Мn²⁺. Время продольной релаксации не выявило каких-либо значительных изменений в зависимости от степени кальцификации. Распад поперечной намагниченности ионов Мn²⁺ в атеросклеротических бляшках существенно отличается для образцов с различной степенью кальцификации (Фиг.2). В образцах со слабой степенью кальцификации сопоставление сигналов ЭПР стационарного и импульсного режимов позволяет определить, что время поперечной релаксации ионов Мn²⁺ меньше 100 нс, что соответсвует результам измерения времени поперечной релаксации в эталонных образцах препарата MnSOD.

Таким образом, методами высокочастотной ЭПР-биопсии, ДЭЯР и электронного спинового эха заявителем впервые обнаружено присутствие Mn²⁺ в атеросклеротической бляшке и установлена отрицательная корреляция между степенью кальцификации атеросклеротической бляшки и содержанием в ней Мn²⁺.

Использование заявленного способа диагностики атеросклероза методом ЭПР-спектроскопии в W-диапазоне путем обнаружения присутствия Мn²⁺ в атеросклеротической бляшке обеспечивает возможность установления корреляция между степенью кальцификации атеросклеротической бляшки и содержанием в ней Mn²⁺, что позволяет:

1) поставить точный диагноз атеросклероза,

2) определить стадию развития заболевания,

3) прогнозировать характер его дальнейшего развития,

4) выбрать оптимальную терапевтическую стратегию.

Заявленное техническое решение соответствует критерию «новизна», предъявляемому к изобретениям, так как из уровня техники не выявлены признаки, приведенные в заявленном техническом решении.

Заявленное техническое решение соответствует критерию «изобретательский уровень», т.к. заявленное техническое решение не является очевидным для специалиста в данной области техники.

Заявленное техническое решение соответствует критерию «промышленная применимость», т.к. заявителем достигнуты поставленные цели в результате проведения исследований на клиническом материале.

Изобретение относится к медицине, в частности к методам диагностики атеросклероза. Способ заключается в получении образца ткани из стенки артерии в результате проведения биопсии или в ходе хирургической операции, лиофилизации образца, регистрации ЭПР-спектра методом высокочастотного электронного парамагнитного резонанса (ЭПР), измерения времен релаксации парамагнитных комплексов Mn²⁺ на сертифицированном спектрометре электронного парамагнитного резонанса W-диапазона. При выявлении времени поперечной релаксации ионов Mn²⁺ меньше 100 не определяют слабую степень кальцификации атеросклеротической бляшки. Осуществление способа позволяет прогнозировать течение атеросклеротического процесса. 2 ил.

Способ определения степени кальцификации атеросклеротической бляшки путем регистрации парамагнитных комплексов марганца методом высокочастотного электронного парамагнитного резонанса (ЭПР), заключающийся в получении образца ткани из стенки артерии в результате проведения биопсии или в ходе хирургической операции, лиофилизации образца, регистрации ЭПР-спектра, измерения времен релаксации парамагнитных комплексов Mn²⁺ на сертифицированном спектрометре электронного парамагнитного резонанса W-диапазона - выявление времени поперечной релаксации ионов Mn²⁺ меньше 100 нс определяет слабую степень кальцификации атеросклеротической бляшки.