СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ РАКА МОЧЕВОГО ПУЗЫРЯ (ВАРИАНТЫ) И НАБОР ДЛЯ ЕГО ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ Российский патент 2012 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к области медицины, в частности онкологии и молекулярной биологии, и касается способа диагностики рака мочевого пузыря (РМП) и набора для его осуществления.

Рак мочевого пузыря (РМП) является распространенной патологией. Ежегодно в мире диагностируется около 356000 новых случаев заболевания РМП [Ploeg, М., К.К.Aben and L.A.Kiemeney, The present and future burden of urinary bladder cancer in the world. World J Urol, 2009. 27 (3): p.289-93]. Существующие методы диагностики РМП разделяют на две группы: инвазивные и неинвазивные. К инвазивным методам диагностики относятся цистоскопия, позволяющая визуализировать опухоль и провести биопсию мочевого пузыря, а также трансуретральное ультразвуковое исследование (трансуретральная ультрасонография) [Qu, X., X.Huang, L.Wu, et al., Comparison of virtual cystoscopy and ultrasonography for bladder cancer detection: A meta-analysis. Eur J Radiol, 2010]. Все инвазивные методы связаны с дискомфортом и риском для здоровья пациента, дороговизной и сложностью выполнения.

К неинвазивным относятся обнаружение в физиологических жидкостях организма маркеров РМП, трансабдоминальная ультразвуковая томография, рентгеновская компьютерная томография, магнитно-резонансная томография, цитологическое исследование мочи или промывной жидкости [Kenney, D.M., R.D.Geschwindt, M.R.Kary, et al., Detection of newly diagnosed bladder cancer, bladder cancer recurrence and bladder cancer in patients with hematuria using quantitative rt-PCR of urinary survivin. Tumour Biol, 2007. 28 (2): p.57-62, Van Tilborg, A.A., C.H.Bangma and E.C.Zwarthoff, Bladder cancer biomarkers and their role in surveillance and screening. Int J Urol, 2009. 16 (1): p.23-30].

Биомаркеры РМП подразделяют на следующие группы:

1) Маркеры, представляющие собой РНК генов, дифференциально экспрессирующихся в нормальных и опухолевых тканях.

2) Белковые маркеры, а также пептиды и продукты белковой деградации, специфично обнаруживаемые в моче или крови больного.

Для оценки содержания РНК-маркеров РМП используют различные методы, прежде всего микрочиповую гибридизацию и метод ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ) [Livak K.J., Flood S.J., Marmaro J., Giusti W., Deets K. 1995. Oligonucleotides with fluorescent dyes at opposite ends provide a quenched probe system useful for detecting PCR product and nucleic acid hybridization. PCR Methods Appl. 4, 357-362].

В качестве РНК-маркеров РМП используют:

- сурвивин (повышенный уровень мРНК обнаруживается в опухолевых тканях, моче и промывной жидкости) [Kenney, D.M., R.D.Geschwindt, M.R.Kary, et al., Detection of newly diagnosed bladder cancer, bladder cancer recurrence and bladder cancer in patients with hematuria using quantitative rt-PCR of urinary survivin. Tumour Biol, 2007. 28 (2): p.57-62];

- цитокератин 20 (повышенный уровень мРНК в моче и промывной жидкости) [Guo, В., С.Luo, С.Xun, et al., Quantitative detection of cytokeratin 20 mRNA in urine samples as diagnostic tools for bladder cancer by real-time PCR. Exp Oncol, 2009. 31 (1): p.43-7];

- гиалуронидазы (уровень мРНК повышен в моче) [Van Tilborg, A.A., C.H.Bangma and Е.С.Zwarthoff, Bladder cancer biomarkers and their role in surveillance and screening. Int J Urol, 2009. 16 (1): p.23-30];

- теломеразы (уровень мРНК повышен в моче) [Eissa, S., M.Swellam, R.Ali-Labib, et al.. Detection of telomerase in urine by 3 methods: evaluation of diagnostic accuracy for bladder cancer. J Urol, 2007. 178 (3 Pt 1): p.1068-72].

Однако же существенным недостатком всех существующих РНК-маркеров РМП является их низкая прогностическая ценность (менее 20% случаев РМП), что приводит к слабой воспроизводимости результатов и низкой клинической ценности таких тестов.

Для диагностики РМП с помощью белковых маркеров используют методы иммунохимического анализа, основанные на реакции взаимодействия специфических антител с белком-маркером. С помощью этих методов можно оценить количественное содержание белка-маркера РМП и его пространственное распределение в исследуемой ткани. Биологический образец, для которого проводится анализ белка, может быть иммобилизован на твердом носителе, например на полимерной мембране, на которой можно иммобилизовать клетки, части клеток или белки. Этот носитель в дальнейшем гибридизуют с мечеными антителами, специфичными к исследуемому белку. Затем оценивают количество связавшихся с носителем антител. Как правило, для этого используют первичные или вторичные антитела, меченые химически связанным с ними ферментом [Voller, A., The enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) (theory, technique and applications). Ric Clin Lab, 1978. 8 (4): p.289-98, de Savigny, D. and A.Voller, The communication of ELISA data from laboratory to clinician. J Immunoassay, 1980. 1 (1): p.105-28]. Фермент, связанный с антителом, реагирует с соответствующим субстратом, изменяющим свои спектральные характеристики в результате реакции, с образованием химической группировки или соединения, которое может быть обнаружено с помощью спектрометрических или флуореметрических методов, или визуально. Кроме того, антитела также метят радиоизотопами, наночастицами металлов и другими веществами. На этом принципе основаны коммерчески доступные методы диагностики РМП, такие как NMP-22 (детекция в моче ядерного белка, высвобождаемого при апоптозе). Эта диагностическая тест-система может служить прототипом данного изобретения [Landman J, Chang Y, Kavaler E, Droller MJ, Liu ВС., Sensitivity and specificity of NMP-22, telomerase, and BTA in the detection of human bladder cancer. Urology. 1998 Sep; 52 (3): 398-402]. В качестве диагностических признаков в ней используют следующие критерии: 1) статистически значимое повышение уровня содержания маркера в образце РМП относительно верхней границы нормы; 2) выраженная динамика снижения уровня маркера при успешном лечении РМП не менее чем на 50%. Эта система также может быть использована для обнаружения рецидивов и прогнозирования будущего течения болезни. Вместе с тем эта и другие доступные системы диагностики РМП, основанные на детекции белковых маркеров в физиологических жидкостях, обладают недостаточной чувствительностью (менее 25%) для эффективного применения в клинической практике.

Изобретение решает задачу повышения чувствительности маркеров РМП и позволяет проводить диагностику РМП с чувствительностью 93%.

Поставленная задача решается за счет способа диагностики рака мочевого пузыря:

методом ПЦР в режиме реального времени, включающего получение биоматериала и выделение РНК, синтез кДНК на матрице РНК, нормирование концентрации кДНК TRIB1 по контрольному гену, проведение количественной ПЦР-амплификации фрагмента гена TRIB1 и проведение диагностики путем определения количества амплифицированного фрагмента ДНК TRIB1 для образца биоматериала и набором для диагностики рака мочевого пузыря методом ПЦР в реальном времени, включающем праймеры с последовательностью SEQ ID NO: 1 и 2 при их молярном соотношении 1:1;

В настоящем изобретении в качестве маркера РМП используют продукты гена TRIB1, обладающего высокой специфичностью экспрессии именно в клетках РМП, но не в нормальной ткани мочевого пузыря. До настоящего изобретения никаких опубликованных данных о повышенной экспрессии гена TRIB1 в раковых, по сравнению с нормальными клетками мочевого пузыря, не имеется. В настоящем изобретении, в качестве показателя наличия раковых и/или предраковых изменений для РМП служит изменение содержания РНК гена TRIB1 у пациентов, больных РМП.

В ходе проведенного авторами поиска дифференциальных транскриптов с помощью анализа на микрочипах и идентификации дифференциально экспрессирующихся генов в нормальных и опухолевых образцах тканей мочевого пузыря на разных этапах злокачественного перерождения обнаружено значительное повышение содержания мРНК гена TRIB1 уже на ранних стадиях злокачественной трансформации клеток мочевого пузыря.

Настоящее изобретение относится к новому маркеру для диагностики рака мочевого пузыря (РМП), который представляет собой мРНК гена TRIB1 и/или белок TRIB1. Увеличение содержания мРНК гена в предположительно пораженных раком тканях мочевого пузыря человека по сравнению с его содержанием в нормальных/здоровых тканях, а также увеличение содержания белка TRIB1 (продукта гена TRIB1) в моче предположительно больного РМП человека по сравнению с содержанием белка в моче здорового человека служит диагностическим маркером РМП.

Настоящее изобретение относится к способу диагностики рака мочевого пузыря. Данный способ включает следующие стадии: получение исходных образцов биоматериала, например, тканей от пациента; выделение и очистка препаратов РНК из образцов тканей; синтез кДНК на матрице РНК, определение концентрации мРНК гена TRIB1 при помощи количественной ПЦР-амплификации с использованием матрицы кДНК; нормирование концентрации мРНК гена TRIB1 по контрольному гену, содержание мРНК которого относительно постоянно в здоровых и раковых тканях человека, в том числе и в мочевом пузыре; проведение диагностики РМП. Например, показанием для обнаружения РМП служит уровень содержания мРНК гена TRIB1 в тканях мочевого пузыря, превышающий 4% от уровня содержания в этих тканях мРНК гена бета-актина человека (АСТВ).

Олигонуклеотидные праймеры, используемые для синтеза одноцепочечной или двуцепочечной кДНК, выбирают из числа олиго(dT)-содержащих праймеров, случайных гексамеров, или их комбинации, а также геноспецифичных праймеров.

Для амплификации кДНК используют олигонуклеотидные праймеры и зонд, подобранные таким образом, что они специфически гибридизуются с кДНК даже в присутствии в препарате примеси геномной ДНК. Возможная последовательность праймеров представлена SEQ ID NO 1-2.

Количественная реакция амплификации фрагмента гена TRIB1 представляет собой ПЦР в реальном времени или ОТ-ПЦР.

В качестве контрольного гена используют ген АСТВ, кодирующий актин бета. Возможная последовательность праймеров для определения концентрации контрольного гена представлена SEQ ID NO 3-4. Последовательность кодирующей белок ДНК гена TRIB1 представлена на SEQ ID NO 5. Последовательность белка TRIB1 представлена на SEQ ID NO 6.

Набор праймеров для осуществления полимеразной цепной реакции для определения содержания мРНК гена TRIB1 имеют последовательности SEQ ID NO 1-2.

В данном изобретении предложен вариант способа диагностики рака мочевого пузыря методами ПЦР в реальном времени, основанный на измерении содержания мРНК гена TRIB1, а также набор для осуществления этого способа. Достоверно обнаруживаемое различие в содержании мРНК гена TRIB1 в нормальных и опухолевых тканях и/или крови больных РМП и здоровых людей может быть использовано для обнаружения РМП в исследуемых образцах.

В качестве образцов для проведения анализа берут биоптаты, пунктаты, в том числе материал, полученный при цистоскопии с прямой биопсией, моча и периферическая кровь.

Для выделения РНК могут быть использованы различные методы. В классических методах выделения РНК используют сильные хаотропные агенты, такие как гуанидинхлорид и гуанидинизотиоцианат, растворяющие белки, и последовательные экстракции фенолом и хлороформом для денатурации и удаления белков [Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis Т., Molecular Cloning. A laboratory Manual. 2^nd Edition ed. 1989, Cold Spring Harbour: CSHL Press]. Широко используют также метод с использованием реагента Trizol [GIBCO/Life Technologies].

Для предотвращения разрушения РНК ферментами РНКазами используют ингибиторы, такие как ингибитор RNAsin плацентарного или рекомбинантного происхождения или, например, ванадил-рибозидный комплекс - неспецифический ингибитор РНКаз широкого спектра действия.

Быстрое и качественное выделение РНК также проводят с использованием ряда коммерчески доступных наборов (Клоноген, Санкт-Петербург; RNeasy kits (Qiagen); SV Total RNA Isolation System, Promega (США) и т.д.). Использование различных приборов, например QuickGene-810 (Life Science, Япония), позволяет минимизировать работу с агрессивными агентами и средами, ускорить и упростить выделение РНК.

Реакция обратной транскрипции, в результате которой на РНК-матрице синтезируют одноцепочечную цепь кДНК, при необходимости, с достройкой второй цепи, позволяет перейти от нестабильных молекул РНК к более стабильным молекулам ДНК. ПЦР-амплификация позволяет использовать малые количества исходной РНК (на уровне нескольких нанограмм), что соответствует минимальным количествам исследуемой ткани. Реакцию обратной транскрипции проводят с использованием коммерчески доступных препаратов обратных транскриптаз, таких как обратная транскриптаза вируса лейкоза мышей Молони (M-MLV), вируса миелобластоза птиц (AMV), PowerScript (точечная мутация M-MLV-RT), C.Therm Polymerase, MINT-полимераза и др. Для обратной транскрипции используют различные праймеры, например:

1) Олиго(dT)n-содержащие праймеры связываются с поли(А)-хвостом на 3'-конце мРНК (число n обычно равно 12-18, но может достигать и большей величины). Эти праймеры используют для получения полноразмерных кДНК.

2) Наборы случайных гексануклеотидных праймеров (статистические затравки) гибридизуются с РНК в многочисленных участках. При обратной транскрипции с этими праймерами получают кДНК, укороченные относительно размеров исходных РНК. Случайные гексамеры используют для преодоления трудностей, связанных с прохождением обратной транскриптазой вторичной структуры РНК, они более эффективны при обратной транскрипции 5'-областей мРНК.

3) Гексамеры или другие короткие олигонуклеотиды случайного состава (до 12 нуклеотидов) могут быть использованы в комбинации с олигоdT-содержащими праймерами;

4) Специфические олигонуклеотидные праймеры используют для обратной транскрипции участка мРНК, представляющего интерес для исследования.

Анализ транскрипции генов проводят, используя кДНК в качестве матрицы для количественной ПЦР.

Для подбора специфических праймеров и зондов используют специальные программы, многие из которых находятся в свободном доступе в Интернете. Среди таких программ можно упомянуть Oligo (версия 6.42), PrimerSelect из пакета Lasergene (www.dnastar.com). Primer Express (Applied Biosystems, USA), Primer Designer (ИМБ), FastPCR (http://www.biocenter.helsinki.fi/bi/Programs/fastpcr.htm), PrimerQuest (http://scitools.idtdna.com/Primerquest/) и др., а также таких программ, как Vector NTI (Informax), Gene Runner и т.д. Кроме того, возможен подбор праймеров и без использования специального программного обеспечения.

В предпочтительном воплощении используют праймеры с последовательностью SEQ ID NO 1-2.

Все варианты детекции продуктов ПЦР можно разделить на специфичные и неспецифичные к определенной последовательности ДНК. Неспецифичные системы можно разделить на системы с использованием интеркалирующих красителей и системы с мечением праймеров флуоресцентными красителями.

Наиболее недорогой, но в то же время высоко чувствительной системой является ПЦР в присутствии интеркалирующих красителей, например бромистого этидия, YOYO [Srinivasan, К., S.C. Morris, J.E. Girard, et al., Enhanced detection of PCR products through use of TOTO and YOYO intercalating dyes with laser induced fluorescence-capillary electrophoresis. Appl Theor Electrophor, 1993, 3 (5): p.235-9], YO-PRO-1 [Ishiguro, Т., J.Saitoh, H.Yawata, et al., Homogeneous quantitative assay of hepatitis С virus RNA by polymerase chain reaction in the presence of a fluorescent intercalater. Anal Biochem, 1995, 229(2): p.207-13], SYBR Green I [Morrison, T.B., J.J.Weis and C.T.Wittwer, Quantification of low-copy transcripts by continuous SYBR Green I monitoring during amplification. Biotechniques, 1998, 24 (6): р.954-8, 960, 962], SYBR Gold, Eva Green и др. Эти красители встраиваются в двуцепочечную молекулу ДНК, изменяют спектральные характеристики красителей, что выражается в изменении флуоресцентного сигнала, усиливающемся по мере накопления продукта ПЦР.

Высокая специфичность ПЦР-РВ может быть достигнута за счет использования зонда (система TaqMan), содержащего на 5'-конце флуорофор или флуоресцентный краситель (например, FAM - 6-carboxy-fluoroscein), а на 3'-конце - т.н. гаситель (например, DABCYL - 4-(dimethylammoazo)benzene-4-carboxylic acid). В процессе ПЦР взаимодействие FAM и DABCYL нарушается за счет расщепления зонда Taq ДНК полимеразой благодаря ее 5'-экзонуклеазной активности, при этом происходит эмиссия флуоресценции, регистрируемая прибором [Holland, P.M., R.D.Abramson, R.Watson, et al., Detection of specific polymerase chain reaction product by utilizing the 5'----3' exonuclease activity of Thermus aquaticus DNA polymerase. Proc Natl Acad Sci USA, 1991, 88 (16): p.7276-80]. Подбор зондов для проведения ПЦР-РВ осуществляется в соответствии со стандартными рекомендациями и требованиями метода (протоколы фирмы Applied Biosystems, http://docs.appliedbiosystems.com). Кроме того, могут быть использованы и другие модификации этого метода, такие как метод вытесняющих проб (displacing probes), молекулярных маячков (molecular beacons), метод примыкающих проб [Solinas, A., L.J.Brown, С.McKeen, et al., Duplex Scorpion primers in SNP analysis and FRET applications. Nucleic Acids Res, 2001. 29 (20): p.E96, Li, Q., G.Luan, Q.Guo, et al., A new class of homogeneous nucleic acid probes based on specific displacement hybridization. Nucleic Acids Res, 2002, 30 (2): p.E5, Tyagi, S. and F.R.Kramer, Molecular beacons: probes that fluoresce upon hybridization. Nat Biotechnol, 1996, 14 (3): p.303-8, Didenko, V.V., DNA probes using fluorescence resonance energy transfer (FRET): designs and applications. Biotechniques, 2001, 31 (5): p.1106-16, 1118, 1120-1].

Количественная оценка содержания мРНК достигается с помощью параллельного проведения ПЦР-РВ с тестируемым и контрольным образцами (Фиг.2). В качестве внутреннего контроля, относительно которого осуществляется нормирование продуктов амплификации исследуемого гена TRIB1, выбран «ген домашнего хозяйства» - АСТВ, кодирующий основной белок цитоскелета бета-актин. Согласно предпочтительной форме осуществления количественной оценки содержания мРНК необходимо выбрать контрольный ген, имеющий низкую вариабельность содержания мРНК в опухолевых и нормальных тканях мочевого пузыря по сравнению с вариабельностью содержания мРНК исследуемых генов [Radonic A., Thuike S., Mackay I.M., Landt О., Siegert W., Nitsche A. 2004. Guideline to reference gene selection for quantitative real-time PCR. Biochem Biophys Res Commun. 313, 856-862]. Как правило, в качестве контрольных выбирают гены «домашнего хозяйства», экспрессирующиеся на высоком уровне в каждой клетке организма, хотя для этой цели может быть использован любой ген с относительно постоянным содержанием мРНК в исследуемых образцах. Решение о выборе того или иного гена в качестве контрольного зависит от степени выбранной/требуемой точности. В предпочтительном воплощении настоящего изобретения выбран традиционный и часто используемый контрольный ген АСТВ.

Оценка содержания мРНК генов может быть основана на абсолютном и относительном измерении количества копий исследуемых транскриптов - абсолютный метод (метод стандартной кривой) и метод относительных измерений (ΔΔСt - метод, http://docs.appliedbiosystems.com/pebiodocs/04303859.pdf). Согласно предпочтительной форме осуществления количественной оценки содержания мРНК генов, в качестве основного метода измерений выбран второй из них. Этот метод позволяет проводить двойное сравнение данных для исследуемого и контрольного генов в опухоли и норме и не требует выравнивания концентраций опухолевых и нормальных образцов РНК/кДНК, которое необходимо при использовании других методов, например ОТ-ПЦР.

Согласно предпочтительной форме осуществления количественной оценки содержания мРНК генов важно проверить пригодность образцов сравнения, в данном случае условных норм. «Условной нормой» принято считать образец ткани мочевого пузыря с отсутствующими макро- и микроскопическими признаками опухолевого роста или образец венозной крови пациента. Кроме того, использованы дополнительные образцы сравнения, полученные от условно здоровых доноров после смерти (доноры, не страдавшие при жизни раком мочевого пузыря).

Поскольку не для всех опухолевых образцов имелись пригодные парные условные нормы, расчеты относительного содержания мРНК гена TRIB1 проводили, используя разные образцы сравнения - парные условные нормы, если они были, и нормы от условно здоровых доноров, если парных норм не было.

Изобретение иллюстрируют графические материалы.

Фигура 1. Схематичное изображение структуры гена TRIB1, кДНК TRIB1 и получаемого продукта амплификации с помощью ПЦР и/или ПЦР-РВ.

Фигура 2. Электрофоретическое разделение в 1,5%-ном агарозном геле продукта ПЦР-РВ (35 циклов ПЦР) - транскрипта гена TRIB1 (размер 158 п.н.), 1-я и 2-я дорожки - транскрипт гена TRIB1 ожидаемого размера в опухолевых тканях, 3-я и 4-я дорожки - в нормальных тканях мочевого пузыря, 5-я дорожка - маркер молекулярных масс ДНК от 100 до 1500 п.н.

Фигура 3. Относительный уровень экспрессии гена TRIB1 в опухолевых и нормальных тканях мочевого пузыря, измеренный путем ПЦР-РВ после нормализации его экспрессии относительно экспрессии гена АСТВ в тех же образцах тканей. Образцы №1-9 - опухолевые ткани мочевого пузыря, 10-12 - нормальные (не имеющие злокачественной трансформации) ткани мочевого пузыря.

Изобретение иллюстрируют примеры.

Пример 1. Определение уровня мРНК гена TRIB1 в нормальных и раковых тканях мочевого пузыря.

1) Образцы тканей

Образцы тканей различных гистологических типов ПРМП (Т), морфологически нормальные ткани, прилегающие к опухолям (т.н. условные нормы (N), а также нормальные ткани мочевого пузыря (NB) от скоропостижно скончавшихся доноров собраны и охарактеризованы независимо двумя различными группами сотрудников ФГУ МНИОИ им. П.А.Герцена Росмедтехнологии и факультета фундаментальной медицины МГУ им. М.В.Ломоносова). Клинический диагноз установлен с учетом данных ретроспективного анализа первичной медицинской документации больных, цито- и гистологических исследований биоптатов, полученных при цистоскопии, а также образцов тканей мочевого пузыря, полученных после трансуретральной резекции и операционного материала. Образцы тканей мочевого пузыря (опухоль, условно-нормальная ткань) получены непосредственно после удаления опухоли. Каждый образец хранят в растворе RNALater Reagent (QIAGEN), стабилизирующем молекулы РНК, при температуре -70°С. Все опухолевые образцы охарактеризованы согласно международной системе клинико-морфологической классификации опухолей ТНМ, где Т (tumor) - Т0-Т4 - категории, отражающие увеличение размера и/или местного распространения первичной опухоли, N (nodules) - N0-N3 - категории, отражающие различную степень поражения метастазами регионарных лимфатических узлов; M (metastasis) - М0-М1 - характеризирует отдаленные метастазы. Все возможные комбинации ТНМ объединяют в более крупные группы - стадии, отражающие течение опухолевого процесса.

2) Выделение препаратов РНК из тканей

Суммарную РНК выделяют из замороженных, хранящихся в растворе RNALater Reagent (QIAGEN) образцов опухолевых и нормальных тканей с использованием TRIZOL Reagent (Invitrogen). Основные этапы включают:

а) разрушение ткани, замороженной в жидком азоте, с использованием микродесмембратора («Sartorius», Германия) и гомогенизацию разрушенного образца в лизирующем растворе, содержащем гуанидинизотиоцианат и фенол;

б) добавление хлороформа и центрифугирование в течение 10 минут при ≤12000×g при температуре 4°С;

в) осаждение РНК из водной фазы, образующейся после центрифугирования, путем добавления изопропилового спирта и повторного центрифугирования в течение 10 минут при ≤12000×g при температуре 4°С.

Далее осадок РНК после повторного центрифугирования промывают водным 75% этиловым спиртом, высушивают и растворяют в воде, очищенной от нуклеаз.

Концентрацию РНК определяют спектрофотометрически. Качество выделенной РНК проверяют электрофорезом в 1%-ной агарозе в присутствии бромистого этидия и спектрофотометрически («Nanodrop», США).

3) Реакция обратной транскрипции

На матрице РНК, выделенной, как описано в пункте 2), синтезируют одноцепочечную кДНК. Для проведения реакции обратной транскрипции берут по 1 мкг РНК, полученной одним из двух вышеописанных методов с использованием наборов реагентов Trizol Reagent (Invitrogen) или реагентов RNeasy Mini Kit (Qiagen), предварительно обработанной не содержащей РНКаз ДНКазой I (Sigma-Aldrich) и инкубируют 5 мин при 70°С, затем помещают в лед.

На каждую пробу готовят 20 мкл смеси, содержащей:

5 мМ MgCl₂;

1 × Буфер для обратной транскриптазы AMV, содержащий 250 мМ Tris-HCl (pH 8.3, 25°С), 250 мМ KCl, 50 мМ MgCl₂, 2,5 мМ спермидин и 50 мМ DTT (Promega);

100 нг гексануклеотидных праймеров;

1 мМ dNTP (Evrogen);

200 единиц обратной транскриптазы AMV (Promega).

К смеси добавляют РНК и воду до конечного объема 20 мкл и проводят реакцию при следующем температурном режиме: 25°С - 10 мин, 42°С - 60 мин, 70°С - 10 мин.

4) Подбор условий определения содержания мРНК гена TRIB1 в образцах тканей мочевого пузыря

Для ОТ-ПЦР и ПЦР-РВ используют одинаковые праймеры TRIB1_F (SEQ ID NO: 1) и TRIB1_R (SEQ ID NO: 2) при их молярном соотношении 1:1, специфичные для разных экзонов гена TRIB1, причем один из праймеров перекрывает границу между экзонами. Размер ампликона - 158 п.н.

Последовательности выбранных праймеров для контрольного гена: SEQ ID NO 3-4, при их молярном соотношении 1:1, размер ампликона - 145 п.н.

Для проведения ПЦР-РВ подбирают оптимальные концентрации праймеров исследуемого и контрольного генов (Фиг.3).

5) Количественная оценка содержания мРНК гена TRIB1

Для количественных измерений используют прибор Stratagene MX3000P (США).

Протокол определения содержания мРНК методом ПЦР-РВ с использованием набора «Комплект реагентов для проведения ПЦР-РВ в присутствии SYBR Green I» или «Комплект реагентов для проведения ПЦР-РВ в присутствии EVA Green» (Синтол, Россия):

1. Готовят реакционные смеси для генов TRIB1 и АСТВ, осторожно смешав все компоненты реакции, кроме матрицы (кДНК), из расчета 1 реакция объемом 25 мкл для каждого образца +1 дополнительная реакция по 25 мкл.

Таблица 1 Состав реакционной смеси для гена АСТВ: Реагент Концентрация исходных растворов Объем в расчете на одну реакцию (мкл) Конечные концентрации в реакции ПЦР Буфер Б 10Х 2,5 1X dNTPs 2,5 мМ 2,5 250 мкМ MgCl₂ 25 мМ 2,5 2,5 мМ Праймер ACTB_F 10 мкМ 1 0,4 мкМ Праймер ACTB_R 10 мкМ 1 0,4 мкМ Taq ДНК-полимераза 5 ед./мкл 0,5 0,1 ед./мкл Н₂О   13,2   кДНК   2  

Таблица 2 Состав реакционной смеси для гена TRIB1: Реагент Концентрация исходных растворов Объем в расчете на одну реакцию (мкл) Конечные концентрации в реакции ПЦР Буфер Б 10Х 2,5 1X dNTPs 2,5 мМ 2,5 250 мкМ MgCl₂ 25 мМ 2,5 2,5 мМ Праймер TRIB1_F 10 мкМ 1 0,4 мкМ Праймер TRIB1_R 10 мкМ 1 0,4 мкМ Taq ДНК-полимераза 5 ед./мкл 0,5 0,1 ед./мкл H₂O   13,2   кДНК   2  

2. В 0,2 мл пробирки, предназначенные для ПЦР-РВ, добавляют по 23 мкл приготовленных реакционных смесей без матрицы.

3. Вносят по 2 мкл матрицы, плотно закрывают пробирки крышками.

4. Помещают пробирки в приборное отделение, задают названия ячеек, температурный режим для 35 циклов: 95°С - 5 мин - денатурация и активация фермента, 95°С - 20 сек - денатурация, 60°С - 20 сек - отжиг зонда и полимеризация, 72°С - 30 сек - элонгация цепей.

5. Реакции проводят в режиме относительных количественных измерений (программное обеспечение Stratagene MxPro, США).

6. После завершения реакции амплификации сохраняют данные.

7. Проводят анализ продуктов реакции с помощью гель-электрофореза в ТВЕ-буфере, содержащем 10 мг/л этидий бромида. Для этого отбирают 5 мкл продуктов амплификации (40 циклов), наносят образцы на 1.8% агарозный гель, содержащий 0.5 мг/л этидий бромида, и маркер молекулярных масс ДНК, позволяющий оценить размер продуктов амплификации (НПО «СибЭнзим»).

6) Математическая обработка данных ПЦР-РВ

Данные ПЦР-РВ переносят в виде текстового файла в Microsoft Excel и проводят математическую обработку данных. Относительное содержание мРНК гена TRIB1 - R_кднк (далее R) в опухолевых и нормальных тканях мочевого пузыря нормируют относительно содержания мРНК гена АСТВ по формуле:

R=2^(Ct(ACTB)-Ct(TRIB1), где Ct - пороговый цикл.

Интервал крайних значений R вычисляют с учетом рассчитанных отклонений Е для значений Ct:

Е=((Σ(x-х_ср)²)/(n-1))^1/2,

где x - значения, полученные в результате измерения (число 1, число 2…),

x_cp=Σx/n,

n - размер выборки (число повторов реакции).

Достоверность наблюдаемых изменений оценивают, исходя из нормального распределения данных. Данные считают достоверными при Р<0.05, где Р - показатель статистической значимости данных (Фиг.4).

7) Результаты

В результате, для всех исследованных образцов РМП (n=26) выявлено 7-83-кратное превышение уровня мРНК гена TRIB1 относительно нормальных образцов ткани мочевого пузыря (n=47)

Пример 2. Определение концентрации мРНК гена TRIB1 в моче и крови больных РМП и здоровых людей.

1) Образцы мочи и крови

Образцы крови и мочи от пациентов с диагнозом РМП, а также от здоровых доноров собраны и охарактеризованы группой сотрудников ФГУ МНИОИ им. П.А.Герцена Росмедтехнологии. Клинический диагноз установлен с учетом данных ретроспективного анализа первичной медицинской документации больных, цито- и гистологических исследований биоптатов, полученных при цистоскопии, а также образцов тканей мочевого пузыря, полученных после трансуретральной резекции и операционного материала. Кровь смешивают с раствором антикоагулянта (например, цитратом натрия, ЭДТА и др.) в соотношении 9:1 (9 частей крови и 1 часть антикоагулянта), отделяют плазму от форменных элементов крови путем центрифугирования в течение 15 минут при 1500×g и сразу же смешивают с раствором, стабилизирующем молекулы РНК (RNAlater Reagent, QIAGEN). Полученный раствор хранят при температуре - 20°С. Образцы мочи смешивают с раствором RNAlater Reagent, QIAGEN, замораживают и хранят при температуре -20°С.

2) Выделение препаратов РНК из тканей

Суммарную РНК выделяют из замороженных, хранящихся в растворе RNALater Reagent (QIAGEN) образцов мочи и крови, полученных от больных и здоровых доноров, с использованием TRIZOL Reagent (Invitrogen). Основные этапы включают:

а) Обработка крови и мочи лизирующим раствором, содержащим гуанидинизотиоцианат и фенол;

б) добавление хлороформа и центрифугирование в течение 10 минут при 12000×g при температуре 4°С;

в) осаждение РНК из водной фазы, образующейся после центрифугирования, путем добавления изопропилового спирта и повторного центрифугирования в течение 10 минут при 12000×g при температуре 4°С.

Далее осадок РНК после повторного центрифугирования промывают водным 75% этиловым спиртом, высушивают и растворяют в воде, очищенной от нуклеаз.

Концентрацию РНК определяют спектрофотометрически. Качество выделенной РНК проверяют электрофорезом в 1%-ной агарозе в присутствии бромистого этидия и спектрофотометрически («Nanodrop», США).

3) Реакция обратной транскрипции

На матрице РНК, выделенной, как описано в пункте 2), синтезируют одноцепочечную кДНК. Для проведения реакции обратной транскрипции берут по 1 мкг РНК, полученной одним из двух вышеописанных методов с использованием наборов реагентов Trizol Reagent (Invitrogen) или реагентов RNeasy Mini Kit (Qiagen), предварительно обработанной не содержащей РНКаз ДНКазой I (Sigma-Aldrich) и инкубируют 5 мин при 70°С, затем помещают в лед.

На каждую пробу готовят 20 мкл смеси, содержащей:

5 мМ MgCl₂;

1 × Буфер для обратной транскриптазы AMV, содержащий 250 мМ Tris-HCl (pH 8.3, 25°С), 250 мМ KCl, 50 мМ MgCl₂ 2,5 мМ спермидин и 50 мМ DTT (Promega);

100 нг гексануклеотидных праймеров;

1 мМ dNTP (Evrogen);

200 единиц обратной транскриптазы AMV (Promega).

К смеси добавляют РНК и воду до конечного объема 20 мкл и проводят реакцию при следующем температурном режиме: 25°С - 10 мин, 42°С - 60 мин, 70°С - 10 мин.

4) Подбор условий определения содержания мРНК гена TRIB1

Для ОТ-ПЦР и ПЦР-РВ используют одинаковые праймеры TRIB1_F (SEQ ID NO: 1) и TRIB1_R (SEQ ID NO: 2), специфичные для разных экзонов гена TRIB1, при их молярном соотношении 1:1, причем один из праймеров перекрывает границу между экзонами. Размер ампликона - 158 п.н.

Последовательности выбранных праймеров для контрольного гена: SEQ ID NO 3-4, размер ампликона - 145 п.н.

Для проведения ПЦР-РВ подбирают оптимальные концентрации праймеров исследуемого и контрольного генов.

5) Количественная оценка содержания мРНК гена TRIB1

Для количественных измерений используют прибор Stratagene MX3000P (США).

Протокол определения содержания мРНК методом ПЦР-РВ с использованием набора «Комплект реагентов для проведения ПЦР-РВ в присутствии SYBR Green I» или «Комплект реагентов для проведения ПЦР-РВ в присутствии EVA Green» (Синтол, Россия):

1. Готовят реакционные смеси для генов TRIB1 и АСТВ, осторожно смешав все компоненты реакции, кроме матрицы (кДНК), из расчета 1 реакция объемом 25 мкл для каждого образца +1 дополнительная реакция по 25 мкл.

Таблица 3 Состав реакционной смеси для теш АСТВ: Реагент Концентрация исходных растворов Объем в расчете на одну реакцию (мкл) Конечные концентрации в реакции ПЦР Буфер Б 10Х 2,5 1X dNTPs 2,5 мМ 2,5 250 мкМ MgCl₂ 25 мМ 2,5 2,5 мМ Праймер ACTB_F 10 мкМ 1 0,4 мкМ Праймер ACTB_R 10 мкМ 1 0,4 мкМ Taq ДНК-полимераза 5 ед./мкл 0,5 0,1 ед./мкл H₂O   13,2   кДНК   2  

Таблица 4 Состав реакционной смеси для гена TRIB1: Реагент Концентрация исходных растворов Объем в расчете на одну реакцию (мкл) Конечные концентрации в реакции ПЦР Буфер Б 10Х 2,5 IX dNTPs 2,5 мМ 2,5 250 мкМ MgCl₂ 25 мМ 2,5 2,5 мМ Праймер TRIB1_F 10 мкМ 1 0,4 мкМ Праймер TRIB1_R 10 мкМ 1 0,4 мкМ Taq ДНК-полимераза 5 ед./мкл 0,5 0,1 ед./мкл H₂O   13,2   кДНК   2  

2. В 0,2 мл пробирки, предназначенные для ПЦР-РВ, добавляют по 23 мкл приготовленных реакционных смесей без матрицы.

3. Вносят по 2 мкл матрицы, плотно закрывают пробирки крышками.

4. Помещают пробирки в приборное отделение, задают названия ячеек, температурный режим для 35 циклов: 95°С - 5 мин - денатурация и активация фермента, 95°С - 20 сек - денатурация, 60°С - 20 сек - отжиг зонда и полимеризация, 72°С - 30 сек - элонгация цепей.

5. Реакции проводят в режиме относительных количественных измерений (программное обеспечение Stratagene MxPro, США).

6. После завершения реакции амплификации сохраняют данные.

7. Проводят анализ продуктов реакции с помощью гель-электрофореза в ТВЕ-буфере, содержащем 10 мг/л этидий бромида. Для этого отбирают 5 мкл продуктов амплификации (40 циклов), наносят образцы на 1.8% агарозный гель, содержащий 0.5 мг/л этидий бромида, и маркер молекулярных масс ДНК, позволяющий оценить размер продуктов амплификации (НПО «СибЭнзим»).

6) Математическая обработка данных ПЦР-РВ

Данные ПЦР-РВ переносят в виде текстового файла в Microsoft Excel и проводят математическую обработку данных. Относительное содержание мРНК гена TRIB1 - R_кднк (далее R) в опухолевых и нормальных тканях мочевого пузыря нормируют относительно содержания мРНК гена АСТВ по формуле:

R=2^(Ct(ACTB)-Ct(TRIB1), где Ct - пороговый цикл.

Интервал крайних значений R вычисляют с учетом рассчитанных отклонений Е для значений Ct:

Е=((Σ(х-х_ср)²)/(n-1))^1/2,

где x - значения, полученные в результате измерения (число 1, число 2…),

x_ср=Σx/n,

n - размер выборки (число повторов реакции).

Достоверность наблюдаемых изменений оценивают, исходя из нормального распределения данных. Данные считают достоверными при Р<0.05, где Р - показатель статистической значимости данных.

7) Результаты

В результате, для всех исследованных образцов мочи и крови, полученных от больных РМП (n=26), выявлено 11-75-кратное превышение концентрации мРНК гена TRIB1 относительно образцов мочи и крови, полученных от здоровых доноров (n=62).

Пример 3.

Оценка эффективности проведенной терапии РМП по изменению уровня экспрессии гена TRIB1 в моче и/или крови обследуемых пациентов.

Оценка эффективности проведенной терапии РМП проводится путем анализа уровня экспрессии гена TRIB1 в моче и/или крови больных РМП до начала лечения и после проведенной терапии способом, указанным в примере 2. В результате, для всех обследованных пациентов (n=12) с установленным диагнозом РМП выявлено снижение уровня экспрессии гена TRIB1 в моче и крови в 2-8 раз после проведенной терапии по сравнению с исходным уровнем экспрессии данного гена в моче и крови, выявленным до начала лечения. Это указывает на возможность использования настоящего изобретения при мониторинге эффективности проводимой противораковой терапии, причем анализ способами настоящего изобретения следует проводить до начала и после окончания курса лечения, а также при необходимости по ходу курса лечения. Снижение содержания мРНК гена TRIB1 по ходу или по завершении курса лечения может свидетельствовать о положительных сдвигах при лечении. Дальнейшее повышение содержания мРНК гена TRIB1 указывает на низкую эффективность лечения.

Группа изобретений относится к области медицины, в частности онкологии и молекулярной биологии, касается способа диагностики рака мочевого пузыря (РМП) и набора для его осуществления. Группа изобретений включает способ диагностики рака мочевого пузыря, основанный на измерении содержания мРНК гена TRIB1 методом ПЦР и набор для его осуществления. Повышенное содержание мРНК TRIB1 в предположительно пораженном раком мочевом пузыре и/или моче по сравнению с ее уровнем в здоровой ткани и/или крови служит диагностическим признаком рака мочевого пузыря. Группа изобретений позволяет с высокой достоверностью диагностировать рак мочевого пузыря, в том числе на ранней стадии прогрессии опухолевой трансформации. 2 н.п. ф-лы, 4 табл., 3 ил., 3 пр.

1. Способ диагностики рака мочевого пузыря методом ПЦР в реальном времени, включающий получение биоматериала и выделение РНК, синтез кДНК на матрице РНК, нормирование концентрации кДНК TRIB1 по контрольному гену, проведение количественной ПЦР-амплификации фрагмента гена TRIB1 и проведение диагностики путем определения концентрации амплифицированного фрагмента ДНК TRIB1 в исследуемом образце и его сравнению с концентрацией амплифицированного фрагмента ДНК TRIB1 от здорового донора, и при превышении концентрации амплифицированного фрагмента ДНК TRIB1 в исследуемом образце по сравнению с полученной от здорового донора в 11-75 раз диагностируют рак мочевого пузыря.

2. Набор для диагностики рака мочевого пузыря по п.1 методом ПЦР в реальном времени, включающий праймеры с последовательностью SEQ ID NO: 1 и 2 при их молярном соотношении 1:1.