ОПРЕДЕЛЕНИЕ СНИЖЕНИЯ УРОВНЯ мРНК ГЕНА ZG16 КАК СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ РАКА ТОЛСТОЙ КИШКИ И НАБОР ДЛЯ ЕГО ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ Российский патент 2010 года по МПК A61B10/00 C12Q1/68 

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к области медицины, в частности онкологии, и молекулярной биологии и может быть использовано для ранней диагностики рака толстой кишки.

Уровень техники

Рак толстой кишки занимает второе-третье место по смертности от онкологических заболеваний в России и индустриально-развитых странах Европы и Америки [Jemal A., Siegel R., Ward E., Murray Т., Xu J., Smigal С., Thun M.J. 2006, Cancer statistics, 2006. CA Cancer J. Clin., 56. 6-30]. В мире регистрируется ежегодно свыше 600000 случаев первичного рака толстой кишки (РТК), в России в последние 5 лет - более 50000 первичных случаев ежегодно [Вестник Российского онкологического научного центра им. Н.Н.Блохина РАМН 2006, Статистика злокачественных новообразований в России и странах СНГ в 2004 г., т.17, №3 (прил.1), стр.47]. Диагноз в половине случаев РТК устанавливают на далеко зашедшей стадии опухолевого процесса, что делает малореальным радикальное излечение. Успех лечения определяется возможностью раннего обнаружения опухолей.

В клинической практике многих стран используются коммерчески распространяемые иммунологические тесты для прогнозирования некоторых наиболее распространенных видов опухолей (например, антитела к рецептору ERBB2 и недавно одобренный FDA MammaPrint тест для прогнозирования рака молочной железы). В тоже время для прогнозирования РТК в клинической практике применяется лишь один иммунологический тест на повышение уровня эмбрионального ракового антигена (ЭРА/СЕА) в кровотоке. Тест имеет низкую прогностическую ценность и используется главным образом для определения риска повторного роста опухоли после операции. Кроме того, повышенный уровень ЭРА в крови может быть связан с курением, употреблением алкоголя и некоторыми неонкологическими заболеваниями (бронхит, пневмония и др.). Для диагностирования рака толстой кишки в настоящее время используются несколько малоэффективных разновидностей тестов:

1) FOBT-тест на присутствие гемоглобина в фекалиях позволяет диагностировать РТК в 30% случаев. Достоинства этого теста - относительная дешевизна и простота использования, а важнейшие недостатки - очень низкая чувствительность и неспецифичность (язва желудка, двенадцатиперстной кишки, геморрой также дают положительный ответ). Данный тест производится, например, компанией BioMerica (набор EZ Detect) и другими компаниями;

2) тест на присутствие ДНК в кале (PreGen-Plus, компания Exact Sciences) имеет большую чувствительность, чем тесты на гемоглобин, и результат анализа не зависит от диеты пациента. Тем не менее это неспецифичный и, кроме того, очень дорогой диагностикум;

3) тесты, основанные на детекции моноклональными антителами модифицированных гликолипидов и гликопротеинов (антигена СА 19-9, модифицированного антигена группы крови Льюиса, гликопротеина TAG-72 и др.). Такие тесты малоэффективны вследствие очень высоких различий в уровне синтеза антигена в первичных опухолях толстой кишки;

4) сывороточный тест, основанный на детекции повышенного уровня синтеза фермента гуанилилциклазы С (GCC) или кодирующей его мРНК (GCC-B1™ Blood TestGCC-B1™). Тест эффективен лишь на поздних стадиях заболевания при массовом проникновении опухолевых клеток в кровоток (в частности в результате повторного роста опухоли после операции или метастазирования), когда лечение бесперспективно.

Необходимость идентификации новых онкомаркеров определяется: 1) отсутствием диагностикумов на РТК российского производства; 2) исключительной дороговизной и недостаточной надежностью диагностикумов, выпускаемых за рубежом (один анализ обходится в среднем $500-600); 3) ростом числа заболеваний РТК в России, в том числе случаев, выявленных на поздних стадиях заболевания, когда лечение малоэффективно; 4) длительностью и высокой стоимостью лечения в стационаре; 5) необходимостью увеличения средней продолжительности жизни трудоспособного населения РФ для улучшения общей демографической ситуации.

Большинство злокачественных опухолей толстой кишки, как правило, возникает в результате превращения доброкачественных опухолей (аденом) в злокачественные (аденокарциномы) [Kashida H., Kudo S. Early colorectal cancer: concept, diagnosis, and management. Int. J. Oncol. 2006, 11, 1-8]. Канцерогенез характеризуется фенотипически различными стадиями: гиперплазия, аденомы, аденокарциномы, метастазы. Этот ступенчатый процесс сопровождается активацией транскрипции ряда онкогенов, а также уменьшением или полной потерей транскрипционной активности так называемых генов-супрессоров опухолевого роста. Изменения активности этих двух групп генов могут служить диагностическим признаком злокачественных опухолей, включая РТК. Это изменение может быть определено с помощью обратной транскрипции с последующей стандартной полимеразной цепной реакцией (стандартный, полуколичественный метод ОТ-ПЦР) или ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ) - наиболее совершенным способом количественной оценки активности генов, определяемой по количеству мРНК, транскрибируемой с ДНК этих генов на клетку опухоли.

РТК сопровождается изменением функциональной активности многих генов. Нами проведен биоинформатический поиск потенциальных генов-биомаркеров РТК на основе комплексного анализа баз данных клонотек экпрессирующихся нуклеотидных последовательностей (Expressed Sequence Tags - EST), полученных из РНК нормальных и опухолевых клеток РТК. При этом выявлены наиболее перспективные в качестве потенциальных биомаркеры генов, уровень мРНК которых, определенный по числу клонов EST, наиболее достоверно различается в норме и опухоли.

EST-клонотеки широко используются для разнообразных целей, это один из базовых элементов в изучении геномных транскриптов [Nagaraj S.H., Gasser R.B., Ranganathan S. A hitchhiker's guide to expressed sequence tag (EST) analysis. Brief Bioinform. 2007 Jan; 8(1):6-21. Epub 2006 May 23]. EST представляет собой короткую, как правило, от 200 до 800 п.н., кДНК, полученную из клонотеки кДНК, синтезированной по матрице мРНК нормальной или опухолевой ткани. При проведении систематического секвенирования библиотек кДНК определяется только часть нуклеотидной последовательности каждой мРНК с 3'- или 5'-конца (в зависимости от метода получения EST). Количество клонов EST, соответствующих определенному гену, в каждой из клонотек в подавляющем большинстве случаев прямо пропорционально транскрипции данного гена. Эта предпосылка заложена в основу данной программы. Сравнивая нормированное количество клонов EST для рассматриваемого гена в клонотеках нормы и опухоли, можно судить не только об изменении уровня его транскрипции в опухоли по сравнению с нормой, но и о стабильности, а также частоте встречаемости такого изменения в разных опухолевых образцах, из которых получены клонотеки.

В результате биоинформатического поиска потенциальных генов-биомаркеров РТК нами выявлены гены с наиболее значительными изменениями уровня мРНК в опухолях по сравнению с нормой, среди которых одним из наиболее перспективных генов - потенциальных онкомаркеров - отобран ген ZG16 (zymogen granule protein 16). Этот ген кодирует секреторный белок (167 аа), запасаемый в гранулах зимогена и принадлежащий семейству лектинов, содержащих Jacalin-домен. Зимогенные гранулы - округлые образования диаметром 0,5-1,5 мкм в клетках различных желез человека, содержащие зимогены, или проферменты. Белок ZG16 может действовать как линкерная молекула между субмембранным матриксом в гранулах зимогена (zgm) и агрегированными секреторными белками при образовании гранул в tgn (транс-сеть аппарата Гольджи, где происходит разделение и сортировка секретируемых продуктов) [Dartsch, H., R.Kleene, H.F.Kern: In vitro condensation-sorting of enzyme proteins isolated from rat pancreatic acinar cells. Eur. J. Cell Biol. 75, 211-222 (1998); Kleene R, Dartsch H, Kern HF. The secretory lectin ZG16p mediates sorting of enzyme proteins to the zymogen granule membrane in pancreatic acinar cells. 1999 Feb; 78(2):79-90]. Белок ZG16 участвует в секреции гликопротеинов.

Ген ZG16 локализован на хромосоме 16р13.3, содержит 4 экзона, длина транскрипта 1,883 bps. В норме экспрессия гена выявлена в печени и кишечнике. Показано значительное понижение экспрессии гена при наиболее частой форме рака печени - гепатоцеллюлярной карциноме (Zhou YB, Cao JB, Yang HM, Zhu H, Xu ZG, Wang KS, Zhang X, Wang ZQ, Han ZG hZG16, a novel human secreted protein expressed in liver, was down-regulated in hepatocellular carcinoma. Biochem Biophys Res Commun. 2007 Apr 13; 355(3):679-86. Epub 2007 Feb 12). Данный аналог наиболее близок по технической сущности к заявленному изобретению и принят за прототип.

Однако изменение экспрессии гена ZG16 при других видах рака, включая РТК, не изучали. Следует отметить, что определение изменения транскрипционной активности этого гена в опухолях толстой кишки представляет большой интерес для диагностики РТК, так как с диагностической точки зрения существенную роль при выборе кандидата на роль диагностического маркера играет высокая стабильность образующегося транскрипта. Из изложенного ясно, что в данной области существует настоятельная потребность в поиске нового диагностического маркера РТК, позволяющего достоверно и уже на ранних этапах диагностировать заболевание, и в разработке на его основе простого, чувствительного, надежного, применимого в условиях клинических или поликлинических медицинских учреждений способа диагностики РТК.

Раскрытие изобретения

Данное изобретение стало возможным в результате проведенного авторами сравнительного анализа уровня экспрессии гена ZG16 в опухолевых тканях толстой кишки различного типа и на разных этапах их злокачественного перерождения и открытия того факта, что уже ранние стадии развития злокачественной трансформации сопровождаются значительным уменьшением уровня мРНК гена ZG16.

Настоящее изобретение в своем аспекте относится к новому маркеру для диагностики рака толстой кишки, который представляет собой изменение уровня содержания мРНК гена ZG16. Пониженный уровень в предположительно пораженной раком ткани человека по сравнению с ее уровнем в здоровой ткани служит диагностическим признаком РТК.

Данный способ включает следующие стадии:

а) получение исходной пары образцов ткани от пациента, где один из образцов получен из предположительно пораженной раком ткани, а второй получен из расположенной рядом гистологически нормальной (условно-нормальной) ткани;

б) выделение и очистка препаратов РНК из исходной пары образцов;

в) синтез одноцепочечной кДНК на матрице РНК с использованием олигонуклеотидных праймеров;

г) нормирование концентрации кДНК ZG16 по контрольному гену, уровень транскрипции которого постоянен в норме и при раке толстой кишки;

д) проведение количественной или полуколичественной реакции амплификации фрагмента гена ZG16 с использованием кДНК, полученной на стадии в), в качестве матрицы и пары геноспецифичных олигонуклеотидных праймеров;

е) сравнение количества амплифицированного фрагмента ДНК ZG16 для образца, полученного из предположительно пораженной раком ткани, с количеством амплифицированного фрагмента ДНК для образца, полученного из нормальной ткани, где указанные количества амплифицированного фрагмента ДНК отражают уровень транскрипции гена ZG16, причем понижение уровня мРНК гена ZG16 служит диагностическим признаком рака толстой кишки.

В одном из воплощений способа изобретения на стадии в) олигонуклеотидные праймеры, используемые для синтеза одноцепочечной кДНК, выбирают из числа олиго(dT)_n-содержащих праймеров, случайных гексамеров или их комбинации, а также геноспецифичных праймеров.

В следующем воплощении способа настоящего изобретения для амплификации кДНК на стадии д) используют олигонуклеотидные праймеры, подобранные таким образом, что они специфически гибридизуются с кДНК даже в присутствии в препарате примеси геномной ДНК.

В отдельном предпочтительном воплощении данного изобретения последовательность праймеров представлена SEQ ID NO: 1 и 2.

В еще одном воплощении способа настоящего изобретения на стадии д) количественная или полуколичественная реакция амплификации фрагмента гена ZG16 представляет собой ПЦР в реальном времени или стандартную ОТ-ПЦР.

В одном воплощении заявленного способа на стадии г) в качестве контрольного гена используют так называемый «house-keeping» ген, кодирующий бета-актин, характеризующийся наиболее постоянным уровнем экспрессии как в нормальной слизистой оболочке кишечника, так и в опухолевых клетках толстой кишки. В качестве эндогенного контроля могут быть использованы и другие «гены домашнего хозяйства», например ген, кодирующий бета-2-микроглобулин (В2М).

Еще одним аспектом настоящего изобретения является набор праймеров для осуществления полимеразной цепной реакции для определения уровня мРНК гена ZG16, имеющих последовательность SEQ ID NO: 1 и 2.

Перечень чертежей

Далее изобретение будет более подробно раскрыто со ссылкой на отдельные иллюстративные примеры и чертежи.

Фиг.1 показывает результаты подбора условий определения уровня мРНК гена ZG16 в образцах тканей толстой кишки. Электрофоретическое разделение в агарозном геле продуктов ПЦР (размер 79 п.н.), полученных после 28, 30, 32 и 34 циклов, проводили в 1,8%-ном агарозном геле. М - маркер молекулярных масс ДНК (ДНК плазмиды pBR222/AluI).

Фиг.2 показывает результаты ОТ-ПЦР-анализа уровня мРНК гена ZG16 при РТК (после 30-х циклов). Номера образцов указаны над дорожками. О - опухоль, Н - норма (нормальная слизистая оболочка толстой кишки на расстоянии около 10 см от опухоли). Ген, кодирующий бета-2-микроглобулин (В2М) (25 циклов ПЦР), использовали как внутренний контроль. Электрофоретическое разделение продуктов ПЦР проводили в 1,8%-ном агарозном геле.

Фиг.3 показывает результаты количественного определения изменения уровня мРНК гена ZG16 при РТК с помощью ПЦР в реальном времени в 76 парных образцах норма-опухоль. В качестве контрольных генов использованы гены, кодирующие бета-2-микроглобулин (В2М) и бета-актин (АСТВ). На чертеже сверху показана локализация опухолей (дистальная или проксимальная) и внизу - стадии опухолей (I, IIA, IIB, IIIB, IIIC, IV).

Осуществление изобретения

Данное изобретение обеспечивает новый генетический маркер для диагностики рака толстой кишки и основанный на определении уровня мРНК этого маркера простой, надежный способ диагностики РТК на разных стадиях развития злокачественной трансформации, включая начальные. Достоверно обнаруживаемое различие в уровне мРНК гена ZG16 в нормальных и опухолевых тканях может быть использовано для обнаружения РТК.

Образцы тканей толстой кишки для анализа

В качестве образцов для проведения анализа может быть использован операционный и биоптатный материал, полученный при колоноскопии с прямой биопсией нормальной и предположительно пораженной раком слизистой оболочки толстой кишки.

Выделение РНК из образцов ткани кишечника

Способы выделения суммарной РНК из образцов ткани млекопитающих хорошо известны специалистам и, как правило, включают следующие стадии: измельчение в жидком азоте образцов опухолевых и нормальных тканей, лизис клеток, выделение РНК и ее очистку, проверку качества РНК электрофорезом в 1%-ном агарозном геле в присутствии красителя бромида этидия или в денатурирующем полиакриламидном геле, а также спектрофотометрическое определение количества РНК. Гомогенизацию кусочков ткани можно проводить вручную, растирая пестиком в керамической ступке, или с помощью механических гомогенизаторов, например Omni Mixer или Micro-Dismembrator U фирмы Sartorius (Германия). Для выделения РНК могут быть использованы различные протоколы, широко известные специалистам в данной области. В классических методах выделения РНК используют сильные хаотропные агенты, такие как гуанидинхлорид и гуанидинизотиоцианат, растворяющие белки, и последовательные экстракции фенолом и хлороформом для денатурации и удаления белков [Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis Т., Molecular Cloning. A laboratory Manual. 2nd Edition ed. 1989, Cold Spring Harbour: CSHL Press]. Широко используют также метод с использованием реагента Trizol (GIBCO/Life Technologies). Для предотвращения разрушения РНК РНКазами могут быть использованы ингибиторы, такие как игибитор RNAsin плацентарного или рекомбинантного происхождения или, например, ванадил-рибозидный комплекс - неспецифический ингибитор РНКаз широкого спектра действия.

Быстрое и качественное выделение РНК можно проводить с использованием ряда коммерчески доступных наборов (Клоноген, Санкт-Петербург; RNeasy mini и RNeasy micro kits (Qiagen); SV Total RNA Isolation System, Promega (США) и т.д.).

Чтобы исключить работу с агрессивными агентами, ускорить и упростить выделение РНК, применяют различные приборы, например QuickGene-810 (Life Science, Япония). Для экстракции РНК в этом приборе используют 80 мкм пористую мембрану, которая в 12,5 раз тоньше обычно используемого в таких приборах стеклянного фильтра (1000 мкм). Это позволяет уменьшить деградацию РНК и увеличить ее выход.

Реакция обратной транскрипции: синтез кДНК на матрице РНК, выделенной из образцов ткани кишечника.

Процесс обратной транскрипции, в результате которой на РНК-матрице синтезируют одноцепочечную цепь ДНК, позволяет от нестабильных молекул РНК перейти к более стабильным молекулам ДНК и амплифицировать с помощью полимеразной цепной реакции до количеств, необходимых для детекции. ОТ-ПЦР-амплификация позволяет использовать очень малые количества исходной РНК (на уровне 1 нанограмма), а следовательно, и количество исследуемой ткани, из которой выделяют РНК.

Реакцию обратной транскрипции можно проводить с использованием ряда коммерчески доступных препаратов обратных транскриптаз, таких как обратная транскриптаза вируса лейкоза мышей Молони (M-MLV), вируса миелобластоза птиц (AMV), PowerScript (точечная мутация M-MLV-RT), С. Therm Polymerase и др., с помощью которых можно получать продукты амплификации длиною до нескольких тысяч и даже несколько десятков тысяч пар нуклеотидов (т.п.н.). Может быть использована термостабильная ДНК-полимераза Thermus thermophilus (Tth), обладающая обратной транскриптазной активностью в присутствии ионов Mn²⁺.

Для обратной транскрипции могут быть использованы различные праймеры, например:

1) олиго(dT)_n-содержащие праймеры, которые связываются с эндогенным полиА-хвостом на 3'-конце мРНК (число n обычно равно 12-18, но может достигать и большей величины). Эти праймеры наиболее часто используют для получения полноразмерных кДНК. К олиго(dT)-последовательности часто добавляют на 3'-конце нуклеотиды А, С или G, чтобы «заякорить» праймер на границу транскрипта и поли-А тракта;

2) случайные гексануклеотидные праймеры (статистические затравки), которые гибридизуются с РНК в многочисленных участках. При обратной транскрипции с этими праймерами получают короткие кДНК. Случайные гексамеры используют для преодоления трудностей, связанных с прочной вторичной структурой РНК, они более эффективны при обратной транскрипции 5'-областей мРНК;

3) гексамеры или другие короткие олигонуклеотиды (10-12 нуклеотидов) случайного состава могут быть также использованы в комбинации с олиго(dT)-содержащими праймерами;

4) специфические олигонуклеотидные праймеры используют для транскрипции участка мРНК, представляющего интерес для исследования. Эти праймеры успешно применяют для диагностических целей.

Анализ уровня мРНК гена ZG16 с помощью ПЦР.

Используя первую цепь кДНК как матрицу, коммерчески доступную от широко спектра производителей термостабильную ДНК-полимеразу (например, Taq, Pfu, Tfl, Tth, Tma и т.д.) и специфические праймеры, сайты для которых расположены в представляющем интерес транскрипте, проводят стандартный, полуколичественный ПЦР, в котором амплифицируемый фрагмент транскрипта детектируется простым гель-электорофорезом, или количественный ПЦР в реальном времени. Выбор специфических праймеров осуществляют способом, хорошо известным специалистам в данной области. Для подбора праймеров и температур отжига целесообразно использовать коммерчески доступные программы или программы, находящиеся в свободном доступе в Интернете. Среди таких программ можно упомянуть Oligo (версия 6.42), PrimerSelect из пакета Lasergene (www.dnastar.com). Primer Premier 5, primers3 (http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgiC), EasyExonPrimer (Wu X., Munroe D.J. 2006. EasyExonPrimer: Automated Primer Design for Exon Sequences. Appl Bioinformatics. 5, 119-120), ExPrimer (Sandhu K.S., Acharya K.K. 2005. ExPrimer: to design primers from exon-exon junctions. Bioinformatics. 21, 2091-2092), PerlPrimer, FastPCR (http://www.biocenter.helsinki.fi/bi/Programs/fastpcr.htm), PrimerQuest (http://scitools.idtdna.com/Primerquest/), а также программу PrimerDesigner, разработанную в Институте молекулярной биологии РАН. С учетом сложности анализируемого генома длина праймеров может быть выбрана в диапазоне от 18 до 25 п.н.

Праймеры для ПЦР можно подобрать таким образом, чтобы они специфически гибридизовались с кДНК даже в присутствии в препарате примеси геномной ДНК. Этого можно достигнуть, например, путем подбора праймеров к разным экзонам гена ZG16. При использовании геноспецифичных праймеров, комплементарных участкам разных экзонов, длина продукта ПЦР, амплифицированного с примесной геномной ДНК, будет значительно больше длины ожидаемого продукта ПЦР, амплифицированного с кДНК. Если хотя бы один из подобранных праймеров перекрывает границу между экзонами, примеси геномной ДНК не будут влиять на результаты реакции амплификации.

Специфичность подобранных праймеров проверяют выравниванием по мРНК и ДНК человека (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi).

В предпочтительном воплощении используют праймеры:

SEQ ID NO:1, (ZG16_F 5'-TCGTAGGTCTTCAGGTGCGCTATG-3') и

SEQ ID NO: 2, (ZG16_R 5'-AAGATCTCCTCCAGGTCTCCGTTG-3').

Специалисту в данной области будет понятно, что могут быть подобраны и другие пары праймеров, различающиеся, например, по своей длине, по своей локализации относительно последовательности транскрипта гена ZG16, которые будут обеспечивать специфическую и эффективную амплификацию фрагмента транскрипта гена ZG16 даже в присутствии примеси геномной ДНК.

Количественная оценка уровня мРНК достигается с помощью параллельного проведения ПЦР с тестируемым транскриптом и контрольным/стандартным транскриптом. В качестве эндогенного внутреннего контроля, относительно которого проводилось нормирование продуктов амплификации исследуемого гена ZG16, выбраны «гены домашнего хозяйства», кодирующие бета-2-микроглобулин (В2М) - низкомолекулярный белок поверхностных антигенов клеточных ядер и глобулярный белок бета-актин (АСТВ). Экспрессия «генов домашнего хозяйства» (housekeeping genes) во всех клетках обычно примерно одинакова. Для этих двух выбранных генов в случае РТК показан наименьший разброс уровней транскрипции в нормальных и опухолевых тканях в сравнении с другими контрольными генами [Rubie С., Kempf К., Hans J., Su Т., Tilton В., Georg Т., Brittner В., Ludwig В., Schilling M. Housekeeping gene variability in normal and cancerous colorectal, pancreatic, esophageal, gastric and hepatic tissues. Mol. Cell Probes. 2005, 19:101-119].

Для анализа уровня транскрипции генов может быть использована стандартная ПЦР и ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ). В отличие от стандартного метода, где фиксируются только конечные продукты реакции, ПЦР в реальном времени использует флуоресцентно меченые олигонуклеотидные зонды для детекции ДНК в процессе ее амплификации, поэтому позволяет наблюдать накопление амплифицированных фрагментов в экспоненциальной фазе реакции, что увеличивает чувствительность метода. Зонд, комплементарный средней части амплифицируемого фрагмента, содержит на концах флуорофор и тушитель. Когда флуорофор и тушитель связаны с олигонуклеотидным зондом, наблюдается лишь незначительная флуоресцентная эмиссия. Во время процесса амплификации за счет 5'-экзонуклеазной активности Taq-полимеразы флуоресцентная метка переходит в раствор, освобождаясь от соседства с тушителем, и генерирует флуоресцентный сигнал, усиливающийся в реальном времени пропорционально накоплению амплификата.

Подбор зондов для проведения ПЦР-РВ может осуществляться в соответствии со стандартными рекомендациями производителя приборов для ПЦР-РВ. Если отсутствует необходимость мультиплексного анализа нескольких генов одновременно, экономичной альтернативой может быть система, использующая специфические к двухспиральной ДНК красители, например SYBR Green или EvaGreen, интенсивность флуоресценции которых возрастают в реальном времени пропорционально увеличению количества ампликонов. В таком варианте можно использовать праймеры без зонда. EvaGreen - насыщающий флуоресцентный краситель третьего поколения, специфически связывающийся с двухцепочечной ДНК. Этот краситель обладает низкой токсичностью и ингибирует полимеразную цепную реакцию в значительной меньшей степени, чем традиционные красители (такие как SYBR Green), что позволяет использовать краситель в больших концентрациях и получать более высокий флуоресцентный сигнал. Использование насыщающего красителя позволяет также получать более точную информацию о содержании двухцепочечного фрагмента ДНК при данной температуре.

Для проведения ПЦР-РВ широко распространены реактивы фирм Applied Biosystems (США), BioRad (США) и др. Однако высокая стоимость реактивов ограничивает выполнение крупномасштабных исследований. Сравнение универсальных фирменных наборов фирмы Applied Biosystems (США) с отечественными наборами для ПЦР-РВ GenePakTM PCR Core («Изоген», Россия), набор («Синтол», Россия) и РиалитиТМ («Биочип-ИМБ», Россия) показало, что последний не уступает по всем основным параметрам фирменным наборам. Набор РиалитиТМ выбран для дальнейших исследований.

Варьирование концентраций праймеров для каждого контрольного и исследуемого генов от 100 до 500 нМ позволяет выбрать оптимальные концентрации, при которых амплитуда кривой, полученной в ходе ПЦР-РВ была максимальна, а эффективность реакции (Е) близка к 100%.

Для проведения ПЦР в реальном времени различными фирмами разработаны амплификаторы, например: ABI Prism 7000 Sequence Detection System фирмы Applied Biosystems (США), Chromo4, MiniOpticon или iCycler iQ5 MJ Research (Bio-Rad), а также отечественные приборы ДТ-322 (ДНК-Технология), АНК-32 (Институт аналитического приборостоения РАН, http://www.syntol.ru/productank.htm) и т.д.

Применение ПЦР-РВ позволяет также уменьшить риск контаминации и автоматизировать процесс диагностики. Процесс продолжается от 40 минут до трех часов (в зависимости от используемого амплификатора) и включает одновременное проведение ПЦР, детекцию флуоресцентного сигнала, обработку данных и их представление в графическом виде (полной кинетической кривой) с помощью специального программного обеспечения. Результаты анализа становятся доступными сразу после завершения процесса и не требуют дополнительно очистки и анализа продуктов ПЦР.

Экспоненциальная стадия PCR описывается уравнением: где P_n - количество молекул продукта/репортерной флуоресценции к циклу n, P₀ - исходное количество молекул, содержащих амплифицируемый фрагмент, Е - эффективность амплификации. В идеальных условиях Е=2, т.е. на каждом цикле цепной реакции происходит удвоение количества продукта. После логарифмирования обеих частей уравнения 1 преобразуют его к виду:

Пороговым циклом (threshold cycle, С(Т)) называют такой цикл n, на котором достигается некий заданный уровень репортерной флуоресценции - пороговая флуоресценция P_C(T)=const. Для n=C(T) уравнение 2 принимает вид:

Т.е. значение С(Т) прямо пропорционально логарифму количества субстрата. Таким образом, ПЦР-РВ позволяет сравнивать количества субстрата при условии, что эффективность реакции и заданный уровень пороговой флуоресценции одинаковы для каждой из сравниваемых реакций.

Методы обработки данных ПЦР-РВ основаны на применении уравнения 3. Для обработки данных ПЦР-РВ используют два основных принципа: метод калибровочного графика и прямое сравнение данных.

1. Метод калибровочного графика: этот метод предполагает построение калибровочного графика в координатах С(Т)-log Р₀ с серией разведений ДНК-стандарта, из которого находят концентрацию субстрата (P₀) в экспериментальных образцах. Предложены следующие варианты стандартов: очищенный RT-PCR-продукт; рекомбинантная ДНК; рекомбинантная РНК с последующей обратной транскрипцией; синтетический олигонуклеотид, содержащий амплифицируемую последовательность.

2. Метод прямого сравнения данных. Из уравнения 3 следует, что при равной эффективности реакции Е в образцах 1 и 2 относительная концентрация субстрата

Если провести нормализацию этих результатов по данным амплификации с контрольной последовательностью REF и, допуская, что реакция REF в обоих образцах протекает с эффективностью E_ref, получаем:

Если эффективности "контрольной" и "опытной" реакций сходны, приближенно можно записать: И, наконец, если обе реакции протекают со сходной эффективностью, близкой к 2, формула упрощается до вида: Свободно распространяемая программа REST выполняет расчеты по формуле 4 с дополнительным статистическим анализом для определения средних значений С(Т).

Далее настоящее изобретение будет подробно проиллюстрировано со ссылкой на конкретные примеры, представляющие собой наиболее предпочтительные воплощения данного изобретения. При этом должно быть понятно, что изобретение не ограничивается этими описанными воплощениями. Напротив, предполагается, что оно включает любые альтернативы, модификации или эквиваленты, допустимые с учетом сущности и объема изобретения.

Пример 1. Образцы тканей толстого кишечника.

Анализировали 76 пар образцов тканей толстого кишечника (опухоль/норма) пациентов с РТК. Средний возраст пациентов, среди которых 52 (68%) мужчины и 24 (32%) женщины, составляет 61,3 года (диапазон 35-84 года). Доля пациентов старше 50 лет составляет 81,3%. Диагноз в каждом случае устанавливали на основании результатов клинического, морфологического, эндоскопического и рентгенологического обследований. Все опухолевые образцы охарактеризованы согласно международной системе клинико-морфологической классификации опухолей TNM, где Т (tumor) - Т0-Т4 - категории, отражающие нарастание размера и/или местного распространения первичной опухоли, N (nodulus) - N0-N3 - категории, отражающие различную степень поражения метастазами регионарных лимфатических узлов; М (metastasis) - М0-М1 - характеризует отдаленные метастазы. Все возможные комбинации TNM объединяют в более крупные группы - стадии, отражающие течение опухолевого процесса. I-я стадия заболевания установлена у трех больных, II-я - у тринадцати, III-я - у четырех, IV-я - у шести. Число пациентов, подвергнутых до операции лучевой терапии и химиотерапии, 4.

Пример 2. Выделение РНК из образцов тканей

Суммарную РНК выделяли из замороженных, измельченных в жидком азоте образцов опухолевых и нормальных тканей. Образцы тканей гомогенизировали на приборе Micro-Dismembrator U (Sartorius, Германия). Выделение РНК проводили с помощью набора "Rneasy Mini kit" или "Rneasy Micro kit" (Qiagen, США) согласно прилагаемым изготовителем протоколам, что позволяло эффективно избавиться не только от белков, труднорастворимых осадков гликопротеидов, ДНК, но и от низкомолекулярных РНК. Качество препарата РНК проверяли электрофорезом в 1%-ном агарозном геле в присутствии бромида этидия. Количество РНК определяли на спектрофотометре ND 1000 (NanoDrop Technologies). Для определения концентрации с помощью этого прибора достаточно 1 мкл раствора.

Пример 3. Реакция обратной транскрипции.

Синтез первой цепи кДНК

На матрице РНК, выделенной, как описано в Примере 2, синтезировали одноцепочечную кДНК. Для получения кДНК использовали 10 пг - 5 мкг суммарной РНК, 200-500 нг oligo(dT)_12-18 или 50-250 нг случайных гексамеров или 2 пмоля гено-специфичного праймера. Superscript™ III обратную транскриптазу (Invitrogen) -модифицированную M-MLV обратную транскриптазу с уменьшенной активностью РНКазы Н.

Условия реакции:

Состав реакционной смеси (13 мкл):

РНК (1 мкг/мкл) 1,0 мкл праймер oligo(dT)₁₈ (50 мкМ) 1,0 мкл dNTP (10 мМ) 1,0 мкл стерильная деионизованная вода 10,0 мкл

Прогревали пробу при 65°С, 5 мин, помещали в лед и выдерживали 1 мин.

Добавляли 5 мкл смеси:

буфер (Invitrogen) для построения 1-ой цепи (5х) 4,0 мкл обратная транскриптаза SuperScript™ III (Invitrogen) 1,0 мкл

Инкубировали при 50°С, 50 мин. Реакцию останавливали прогреванием при 70°С, 15 мин, и доводили объем пробы до 20 мкл.

Пример 4. Нормирование концентрации кДНК по контрольному гену.

Образцы кДНК нормировали по контрольному гену АСТВ. Использовали праймеры, подобранные к разным экзонам гена АСТВ, причем один из праймеров перекрывает границу между экзонами:

ACTB_F: 5'-CCTTCCTGGGCATGGAGTC-3' и

ACTB_R: 5'-CTTGATCTTCATTGTGCTGGGT-3'

Размер ПЦР-фрагмента составляет 191 п.н. Подбор условий проведения ПЦР осуществляли на нескольких образцах кДНК. Условия амплификации: предварительный прогрев при 94°С 3 мин; 94°С 30 с, 59°С 30 с и 72°С 30 с - 26, 28 и 30 циклов; 72°С 5 мин - 1 цикл.

ПЦР проводили на амплификаторе MasterCycler, Eppendorf (Германия) с нагревающейся крышкой или амплификаторе Терцик, ДНК-технология (Россия). Продукты амплификации анализировали в 1,8%-ном агарозном геле с 0,5 мкг/мл бромида этидия. В результате были подобраны оптимальные условия ОТ-ПЦР для АСТВ (26-28 циклов), при которых получали линейную зависимость между количеством продукта ПЦР и числом циклов. Все реакции амплификации повторяли трижды.

Интенсивность флуоресценции полос после электрофоретического разделения продуктов ПЦР оценивали количественно с помощью программы для денситометрии фотографий GeneProfiler (http://www/scanalytics.com) и выражали в виде значений относительной интенсивности норма/опухоль (Н/O).

Пример 5. Подбор условий определения уровня мРНК гена ZG16 в образцах тканей кишечника стандартным полуколичественным методом ОТ-ПЦР.

Протокол определения уровня мРНК

При подборе условий определения количества мРНК для амплификации одноцепочечной кДНК использовали геноспецифичные праймеры ZG16_F (SEQ ID NO: 1) и ZG16_R (SEQ ID NO: 2), которые были подобраны к разным экзонам гена ZG16, причем один из праймеров перекрывает границу между экзонами. В этих условиях примеси геномной ДНК не влияют на результаты амплификации.

Размер ПЦР-фрагмента составлял 79 п.н. Подбор условий проведения ПЦР осуществляли на нескольких образцах кДНК. Амплификацию проводили в 25 мкл смеси, содержащей 67 мМ Трис-HCl, рН 8,8, 16,6 мМ (NH₄)₂SO₄, 0,1% Tween-20, 2,5 мМ MgCl₂ 0,2 мМ каждого из dNTP, 0,1 мкг кДНК, 0,2 мкМ каждого из праймеров, 2 ед. активности ДНК-полимеразы SmarTaq (Dialat Ltd., Москва).

Условия проведения ПЦР

Состав реакционной смеси (25 мкл):

ПЦР-буфер (10×) 2,5 мкл MgCl₂ (25 мМ) 2,5 мкл dNTP (10 мМ) 0,5 мкл праймер ZG16_F, 10 мкМ 0,5 мкл праймер ZG16_R, 10 мкМ 0,5 мкл кДНК (0,1 мкг/мкл) 1,0 мкл SmarTaq ДНК-полимераза, 5 ед/мкл 0,3 мкл стерильная деионизованная вода 17,2 мкл

Условия амплификации:

94°С 3 мин - 1 цикл

94°С 30 с; 56°С 30 с; 72°С 45 с - 28, 30, 32 и 34 циклов

72°С 5 мин - 1 цикл

В результате были подобраны оптимальные условия ОТ-ПЦР для ZG16 (30-32 цикла), при которых получали линейную зависимость между количеством продукта ПЦР и числом циклов (Фиг.1). Все реакции амплификации повторяли трижды.

Амплифицированные фрагменты гена ZG16 клонировали в векторе pGEM®-T Easy (Promega) и секвенировали. Их нуклеотидные последовательности полностью совпадали с последовательностями соответствующего фрагмента кДНК. Секвенирование проводили с помощью набора реактивов ABI PRISM® BigDye™ Terminator v. 3.1 с последующим анализом продуктов реакции на автоматическом секвенаторе ДНК ABI PRISM 3100-Avant.

Пример 6. Определение изменения уровня мРНК гена ZG16 в образцах опухолевых тканей по сравнению с нормальными тканями методом ОТ-ПЦР.

Протокол определения уровня мРНК

1. Приготовить master-mix, смешав все компоненты ПЦР кроме матрицы. Master-mix следует готовить из расчета 1 реакция объемом 25 мкл для каждого образца + 1 дополнительная реакция объемом 25 мкл. Состав реакционной смеси (25 мкл):

ПЦР-буфер (10×) 2,5 мкл MgCl₂ (25 мМ) 2,5 мкл dNTP (10 мМ) 0,5 мкл праймер ZG16_F, 10 мкМ 0,5 мкл праймер ZG 16_R, 10 мкМ 0,5 мкл кДНК 1,0 мкл SmarTaq ДНК-полимераза, (Dialat Ltd., Москва), 5 ед/мкл 0,3 мкл стерильная деионизованная вода 17,2 мкл

2. В пробирки на 0,6 мл или 0,2 мл (помеченные для проведения 32 циклов амплификации) добавить по 24 мкл master-mix.

3. Добавить в пробирки по 1 мкл матрицы, перемешать пипетированием несколько раз.

4. В отдельной пробирке (контроль) смешать 24 мкл master-mix и 1 мкл стерильной деионизованной воды.

5. Добавить в каждую пробирку по 1 капле минерального масла (МР Biomedicals, LLC) и закрыть крышки пробирок (если ПЦР проводили на амплификаторе Терцик, ДНК-технология). В том случае, если ПЦР проводили на амплификаторе MasterCycler, Eppendorf, масло не добавляли.

6. Поместить пробирки в амплификатор и провести 30 циклов реакции амплификации.

7. После завершения реакции амплификации отобрать 4 мкл продуктов амплификации (30 циклов), продолжить реакции амплификации еще на 2 цикла, отобрать 4 мкл (32 цикла) и смешать с 2 мкл краски 6× Orange Loading Dye. Наносили образцы на 1,8%-ный агарозный гель, содержащий 0,5 мг/л бромида этидия. Также наносили на гель маркер молекулярных масс ДНК, позволяющий оценить размер продуктов амплификации (использовали ДНК плазмиды pBR222/AluI, производства Сибэнзим, Россия). Гель-электрофорез проводили в ТВЕ-буфере, содержащем 10 мг/л бромида этидия. Длина разделения составляет 3-5 см геля. После гель-электрофореза визуализацию продуктов амплификации и их документирование проводить в ультрафиолете при длине волны 302 нм.

Результаты анализа уровня мРНК гена ZG16.

Подсчет средних значений изменения уровней мРНК исследуемых генов и стандартных ошибок проводили с помощью компьютерной программы SPSS 13.0 (SPSS Inc., США). Достоверность наблюдаемых изменений оценивали, исходя из нормального распределения данных. Данные считали достоверными при Р<0,05, где Р - показатель статистической значимости (достоверности) данных.

Установлено, что в 80% (16/20) образцов РТК количество мРНК гена ZG16 понижено в 2 и более раз (Р<0,05) по сравнению с условной нормой (часть результатов представлена на Фиг.2).

Пример 7. Определение изменения уровня мРНК гена ZG16 в образцах опухолевых тканей по сравнению с нормой методом ПЦР-РВ.

Количественный анализ изменения содержания мРНК гена ZG16 проводили методом ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ) на амплификаторе Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System. В качестве контрольных генов выбраны гены В2М и АСТВ.

Последовательности праймеров приведены в таблице 1.

Таблица 1 Праймеры для ПЦР-РВ Гены Праймеры   F 5'-TCGTAGGTCTTCAGGTGCGCTATG-3' ZG16 R 5'-AAGATCTCCTCCAGGTCTCCGTTG-3' В2М F 5'-TATCCAGCGTACTCCAAAGA-3'   R 5'-GACAAGTCTGAATGCTCCAC-3' АСТВ F 5'-CCTTCCTGGGCATGGAGTC-3'   R 5'-CTTGATCTTCATTGTGCTGGGT-3'

Оптимизированная концентрация праймеров для ZG16, АСТВ и В2М- 800 нМ.

Реакции проводили в объеме 25 мкл в стандартных 96-луночных оптических плашках (MicroAmp™ Fast Optical 96-Well Reaction Plate). Реакционная смесь включала в себя интеркалирующий краситель EvaGreen™ (Biotium, Inc. http://biotium.com), праймеры, матрицу (кДНК), пассивный краситель ROX, термостабильную реакционную смесь Riality™ [Манзенюк О.Ю., Малахо С.Г., Пехов В.М., Косорукова И.С., Полтараус А.Б. Характеристика универсальных отечественных наборов реагентов для ПЦР в реальном времени. Молекулярная биология. 2006. 40(2), С.349-356], содержащую Taq полимеразу, дНТФ, MgCl₂, ПЦР-буфер. Каждая плашка содержала три отрицательных контроля (образцы без ДНК). Каждый образец был нанесен в трех повторностях. Температурный профиль реакции: 95°С 10 мин; 40 циклов: 95°С 15 с, 60°C 1 мин.

Продукты ПЦР проверяли на специфичность методом кривой плавления и электрофоретическим разделением в 1,8% агарозном геле. Эти фрагменты были секвенированы, их нуклеотидные последовательности совпадали с фрагментами аннотированных последовательностей.

Относительный количественный анализ проводили с помощью AEGIS software [Dmitriev et al. Engelhardt Institute of Molecular Biology].

Количественная оценка уровня мРНК гена AKR1B10 при раке толстой кишки

Установлено, что в 84% (64/76) образцов РТК количество мРНК гена ZG16 понижено в 2 и более раз (Р<0,05) по сравнению с нормой, причем в 68% (52/76) образцов эта разница значительно превышает десятикратную (Фиг.3).

Уровень снижения мРНК для ZG16 в среднем изменяется в 39,3 раза (от 2 до 3175 раз), при этом в 68% случаев (52/76) это снижение превышает 10 раз. Уменьшение содержания мРНК наблюдается уже на начальных стадиях заболевания.

Результаты количественной оценки представлены в таблице 2.

Таким образом, обнаружена очень высокая частота (84%) и степень понижения мРНК гена ZG16 при РТК (в 68% (52/76) образцов эта разница превышает десятикратную) (Фиг.3). Корреляций между степенью понижения содержания мРНК и возрастом, полом, стадией опухоли, наличием метастазов, не выявлено. Снижение уровня мРНК в опухолевых образцах происходит уже на 1-ой стадии, что свидетельствует об инактивации гена на ранних этапах развития опухоли. Полученные данные количественной оценки уровня мРНК гена ZG16 при РТК указывают на их инактивацию в опухолях кишечника, что свидетельствует о функциональной важности этого гена в процессе канцерогенеза.

Представленные результаты для гена ZG16 получены впервые.

Настоящим изобретением также предусмотрено, что определение уровня мРНК гена ZG16 будет полезным при мониторинге эффективности проводимой противораковой терапии, причем анализ способом настоящего изобретения следует проводить до начала и после окончания курса лечения, а также при необходимости по ходу курса лечения. Повышение количества мРНК гена ZG16 по ходу или по завершении курса лечения будет свидетельствовать о восстановлении активности гена ZG16, что может говорить о положительных сдвигах при лечении.

Представленное выше подробное описание изобретения и его конкретных воплощений, приведенных в примерах со ссылкой на чертежи, предназначено исключительно для более полного уяснения сущности заявленного изобретения, но не для его ограничения. Специалисту будет ясно, что могут быть сделаны различные изменения, которые тем не менее будут соответствовать сущности и объему настоящего изобретения, которые определяются прилагаемой формулой изобретения.

Настоящее изобретение относится к области медицины, в частности к онкологии, и молекулярной биологии и может быть использовано для диагностики рака толстой кишки. В способе осуществляют получение исходной пары образцов ткани от пациента, где один из образцов получен из предположительно пораженной раком ткани, а второй получен из прилегающей или расположенной на небольшом расстоянии от опухоли гистологически нормальной (условно-нормальной) ткани; выделение и очистку препаратов РНК из исходной пары образцов; синтез одноцепочечной кДНК на матрице РНК с использованием олигонуклеотидных праймеров; нормирование концентрации кДНК по контрольному гену, уровень транскрипции которого постоянен в норме и при раке толстой кишки; проведение количественной или полуколичественной реакции амплификации фрагмента гена ZG16 с использованием кДНК, полученной на стадии в), в качестве матрицы и пары геноспецифичных олигонуклеотидных праймеров с последовательностями SEQ ID NO: 1 и 2; сравнение количества амплифицированного фрагмента ДНК ZG16 для образца, полученного из предположительно пораженной раком ткани, с количеством амплифицированного фрагмента ДНК для образца, полученного из нормальной ткани, где указанные количества амплифицированного фрагмента ДНК отражают уровень мРНК гена ZG16, причем понижение количества мРНК гена ZG16 служит диагностическим признаком рака толстой кишки. А для осуществления способа заявлен набор, включающий праймеры для проведения полимеразной цепной реакции для определения уровня мРНК гена ZG16, имеющие последовательности SEQ ID NO: 1 и 2. Способ и набор позволяют с высокой достоверностью диагностировать рак толстой кишки, в том числе на ранних стадиях прогрессии опухолевой трансформации. 2 н. и 3 з.п. ф-лы, 3 ил., 2 табл.

1. Способ диагностики рака толстой кишки, включающий следующие стадии:
а) получение исходной пары образцов ткани от пациента, где один из образцов получен из предположительно пораженной раком ткани, а второй получен из прилегающей или расположенной на небольшом расстоянии от опухоли гистологически нормальной (условно-нормальной) ткани;
б) выделение и очистка препаратов РНК из исходной пары образцов;
в) синтез одноцепочечной кДНК на матрице РНК с использованием олигонуклеотидных праймеров;
г) нормирование концентрации кДНК по контрольному гену, уровень транскрипции которого постоянен в норме и при раке толстой кишки;
д) проведение количественной или полуколичественной реакции амплификации фрагмента гена ZG16 с использованием кДНК, полученной на стадии в), в качестве матрицы и пары геноспецифичных олигонуклеотидных праймеров с последовательностями SEQ ID NO: 1 и 2;
е) сравнение количества амплифицированного фрагмента ДНК ZG16 для образца, полученного из предположительно пораженной раком ткани, с количеством амплифицированного фрагмента ДНК для образца, полученного из нормальной ткани, где указанные количества амплифицированного фрагмента ДНК отражают уровень мРНК гена ZG16, причем понижение количества мРНК гена ZG16 служит диагностическим признаком рака толстой кишки.

2. Способ по п.1, в котором на стадии в) олигонуклеотидные праймеры, используемые для синтеза одноцепочечной кДНК, выбирают из числа олиго(dT)-содержащих праймеров, случайных гексамеров или их комбинации, а также геноспецифичных праймеров.

3. Способ по п.1, в котором на стадии д) количественная или полуколичественная реакция амплификации фрагмента гена ZG16 представляет собой ПЦР в реальном времени или стандартную ОТ-ПЦР.

4. Способ по п.1, в котором на стадии г) в качестве контрольного гена используют ген АСТВ, кодирующий глобулярный белок бета-актин или ген В2М, кодирующий низкомолекулярный белок поверхностных антигенов клеточных ядер, бета-2-микроглобулин.

5. Набор для диагностики рака толстой кишки по п.1, включающий праймеры для осуществления полимеразной цепной реакции для определения уровня мРНК гена ZG16, имеющих последовательности SEQ ID NO: 1 и 2.