Данное изобретение относится к составу с анти-CD20 моноклональным антителом, к способу изготовления указанного состава и применениям данного состава.
Уровень техники
Молекула CD20 (также называемая человеческим В-лимфоцитарным антигеном дифференцировки или Вр35) представляет собой гидрофобный трансмембранный белок с молекулярной массой приблизительно 35 кДа, находящийся на пре-В и зрелых В-лимфоцитах (Valentine et al. (1989) J. Biol. Chem. 264(19):11282-11287; и Einfield et al. (1988) EMBO J. 7(3):711-717). CD20 находится на поверхности более 90% В-клеток периферической крови или лимфоидных органов, экспрессируется в раннем пре-В-клеточном развитии и сохраняется до этапа дифференциации плазматических клеток. CD20 присутствует и на нормальных В-клетках, и на злокачественных В-клетках. В частности, CD20 экспрессируется на более чем 90% В-клеток неходжкинских лимфом (non-Hodgkin's lymphomas, NHL) (Anderson et al. (1984) Blood 63(6): 1424-1433)), но он не найден на гемопоэтических стволовых клетках, про-В-клетках, нормальных плазматических клетках или других нормальных тканях (Tedder et al. (1985) J, Immunol. 135(2):973-979).
85-аминокислотный участок карбоксильного конца белка CD20 находится в цитоплазме. Длина этого участка отличается от длины других специфических В-клеточных поверхностных структур, таких как IgM, IgD и тяжелые цепи IgG или антигены гистосовместимости класса I1 α- или β-цепей, которые имеют сравнительно короткие внутрицитоплазматические участки из 3, 3, 28, 15 и 16 аминокислот соответственно (Komaromy et al. (1983) NAR 11:6775-6785). Из последних 61 аминокислот карбоксильного конца 21 является кислотным остатком, тогда как только 2 являются основными, указывая, что этот участок имеет сильный отрицательный заряд. Номер в ГенБанке (GenBank Accession No) NP-690605. Считается, что CD20 могут участвовать в регулировании первого этапа(ов) процессов активации и дифференцировки В-клеток (Tedder et al. (1986) Eur. J. Immunol. 25 16:881-887) и могут функционировать в качестве каналов для ионов кальция (Tedder et al. (1990) J. Cell. Biochem. 14D: 195).
Существует два различных типа анти-CD20-антител, значительно различающихся в характере их связывания CD20 и биологических активностей (Cragg, M.S., et al, Blood, 103 (2004) 2738-2743; и Cragg, M.S., et al, Blood, 101 (2003) 1045-1051). Антитела I типа, такие как ритуксимаб, являются мощными в отношении опосредованной комплементом цитотоксичности, в то время как антитела II типа, такие как тозитумомаб (Bexxar®, В1), 11В8 и АТ80, эффективно инициируют смерть клетки-мишени путем каспаза-независимого апоптоза с сопутствующим высвобождением фосфатидилсерина.
Общие особенности анти-CD20 антител I и II типа приведены в таблице 1.
Сущность изобретения
В одном аспекте изобретение относится к фармацевтическому составу, содержащему:
от 1 до 150 мг/мл анти-CD20 антитела;
от 1 до 100 мМ буфера;
возможно от 0,001 до 1% поверхностно-активного вещества; а также
возможно от 1 до 800 мМ тонического агента;
при рН в диапазоне от 4,5 до 7,0.
Предпочтительно указанное анти-CD20 антитело является антителом II типа. Более предпочтительно указанное анти-CD20 антитело является гуманизированным B-Ly1 антителом.
Подробное описание изобретения
Термин "антитело" включает в себя различные формы антител, в том числе, без ограничения, целые антитела, человеческие антитела, гуманизированные антитела и антитела, полученные путем генной инженерии, такие как моноклональные антитела, химерные антитела или рекомбинантные антитела, а также фрагменты таких антител до тех пор, пока сохраняются их характерные свойства в соответствии с изобретением.
"Фрагменты антитела" включают часть антитела полной длины, как правило, по меньшей мере связывающую часть антигена или его вариабельную область. Примеры фрагментов антител включают двойные антитела, одноцепочечные молекулы антител, иммунотоксины и полиспецифические антитела, сформированные из фрагментов антител. Кроме того, фрагменты антитела включают одноцепочечные полипептиды, имеющие характеристики цепи VH, а именно возможность объединяться с цепью VL, или характеристики цепи VL, связывающей антиген CD20, а именно возможность объединяться с цепью VH для формирования функционального антиген-связывающего кармана.
"Фрагменты антител" также включают такие фрагменты, которые сами по себе не способны обеспечивать эффекторные функции (ADCC/CDC), но обеспечивают эти функции в соответствии с изобретением после комбинирования с константным доменом(ами) соответствующего антитела.
Используемые в данном документе термины "моноклональное антитело" или "композиция с моноклональным антителом" относятся к изготовлению молекул антитела единого аминокислотного состава. Таким образом, термин "человеческое моноклональное антитело" относится к антителам, демонстрирующим одинаковую специфичность связывания, которые имеют вариабельные и константные области, полученные из человеческих зародышевых последовательностей иммуноглобулина. В одном воплощении человеческие моноклональные антитела производят с помощью гибридомы, которая включает В-клетки, полученные из трансгенного отличного от человека животного, например из трансгенной мыши, с геномом, содержащим трансген человеческой тяжелой цепи и трансген человеческой легкой цепи, слитым с иммортализованной клеткой.
Термин "химерное антитело" относится к моноклональному антителу, содержащему вариабельную область, т.е. связывающую область, из одного источника или вида и по меньшей мере часть константной области, полученной из различных источников и видов, как правило полученных с помощью методик рекомбинантной ДНК. Особенно предпочтительными являются химерные антитела, содержащие мышиный вариабельный участок и человеческий константный участок. Такие мышиные/человеческие химерные антитела являются продуктом экспрессированных генов иммуноглобулинов, содержащих сегменты ДНК, кодирующие вариабельные участки мышиного иммуноглобулина, и сегменты ДНК, кодирующие константные участки человеческого иммуноглобулина. Другими формами "химерных антител", охватываемыми данным изобретением, являются те, в которых класс или подкласс был модифицирован или изменен по сравнению с исходным антителом. Такие "химерные" антитела также называют "антителами с переключением класса". Способы получения химерных антител включают обычные методики рекомбинантной ДНК и генной трансфекции, в настоящее время хорошо известные в данной области. См., например, Morrison, S.L, et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 81 (1984) 6851-6855; патенты США 5202238 и 5204244.
Термин "гуманизированное антитело" относится к антителам, в которых были изменены каркасные участки или "участки, определяющие комплементарность" (CDR) так, чтобы они содержали CDR иммуноглобулина другой специфичности, отличной от родительского иммуноглобулина. В предпочтительном воплощении мышиный CDR прививают каркасному участку человеческого антитела для получения "гуманизированного антитела". См., например, Riechmann, L., et al., Nature 332 (1988) 323-327; и Neuberger, M.S., et al., Nature 314 (1985) 268-270. Особенно предпочтительные CDR соответствуют тем из представленных последовательностей, которые распознают отмеченные выше антигены для химерных и бифункциональных антител.
Термин "человеческое антитело", используемый в данном документе, включает антитела с вариабельными и константными участками, полученными из человеческих зародышевых последовательностей иммуноглобулина. Человеческие антитела хорошо известны в данной области (van Dijk, M.A., and van de Winkel, J.G., Curr. Opin. Pharmacol. 5 (2001) 368-374). На основе такой технологии можно получить человеческие антитела против самых разнообразных мишеней. Примерами человеческих антител являются, например, описанные в Kellermann, S. A., et al., Curr Opin Biotechnol. 13 (2002) 593-597.
Термин "рекомбинантное человеческое антитело", используемый в данном документе, охватывает все человеческие антитела, которые получают, экспрессируют, создают или выделяют с помощью рекомбинантных средств, таких как антитела, выделенные из принимающей клетки (клетки-хозяина), такой как клетка NS0 или СНО, или животного (например, мыши), которые являются трансгенными для человеческих генов иммуноглобулинов или антител, экспрессируемых с помощью рекомбинантного вектора экспрессии, трансфицированного в принимающую клетку (клетку-хозяина). Такие рекомбинантные человеческие антитела имеют вариабельный и константный участки, полученные из зародышевых последовательностей человеческого иммуноглобулина, в перегруппированной форме. Рекомбинантные человеческие антитела в соответствии с изобретением подвергали соматическому гипермутированию in vivo. Таким образом, аминокислотные последовательности участков VH и VL рекомбинантных антител являются последовательностями, которые, будучи полученными из и связанными с человеческими зародышевыми последовательностями VH и VL, не могут естественным образом существовать в наборе человеческих зародышевых антител in vivo.
Используемые в данном документе термины "специфически связывающийся" или "связывается специфически с" относятся к антителу, специфически связывающемуся с антигеном CD20. Предпочтительно аффинность связывания имеет значение KD 10-9 моль/л или ниже (например, 10-10 моль/л), предпочтительно значение KD 10-10 моль/л или ниже (например, 10-12 моль/л). Аффинность связывания определяют с помощью стандартного анализа связывания, такого как методика поверхностного плазменного резонанса (Biacore®).
Термин "нуклеиновокислотная молекула", используемый в данном документе, включает молекулы ДНК и РНК. Нуклеиновокислотная молекула может быть одноцепочечной или двуцепочечной, но предпочтительной является двуцепочечная ДНК.
"Константные домены" не участвуют непосредственно в связывании антитела с антигеном, но участвуют в эффекторных функциях (ADCC, реакция связывания комплемента и CDC).
Термин "вариабельный участок" (вариабельный участок легкой цепи (VL), вариабельный участок тяжелой цепи (VH)), используемый в данном документе, означает пару из легкой и тяжелой цепей, которая непосредственно участвует в связывании антитела с антигеном. Домены вариабельной человеческой легкой и тяжелой цепей имеют одинаковые общие структуры, и каждый домен содержит четыре каркасных участка (framework region, FR), последовательности которых в значительной степени консервативны, соединенные тремя "гипервариабельными участками" (или участками, определяющими комплементарность, CDR). Каркасные участки принимают конформацию b-листа, и CDR могут образовывать петли, связывающие структуру b-листа. CDR в каждой цепи удерживаются в их трехмерной структуре с помощью каркасных участков и образуют вместе с CDR из другой цепи антиген-связывающий участок. CDR3-участки тяжелой и легкой цепи антитела играют особенно важную роль в специфичности связывания/аффинности антител в соответствии с изобретением и, следовательно, обеспечивают дальнейший предмет изобретения.
Термины "гипервариабельный участок" или "антигенсвязывающая часть антитела", используемые в данном документе, относятся к аминокислотным остаткам антитела, которые отвечают за связывание антигена. Гипервариабельный участок содержит аминокислотные остатки из "участков, определяющих комплементарность", или "CDR". "Каркасными участками", или "FR", являются те участки вариабельного домена, которые отличаются от остатков гипервариабельных участков, определенных здесь. Таким образом, легкие и тяжелые цепи антитела содержат от N-конца к С-концу домены FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 и FR4. В частности, CDR3 тяжелой цепи является участком, который вносит наибольший вклад в связывание антигена. Области CDR и FR определены в соответствии со стандартной системой определения Кабата, Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)) и/или этими остатками из "гипервариабельной петли".
Термины "CD20" и "CD20-антиген" используются в данном документе как взаимозаменяемые и включают в себя любые варианты, изоформы и виды гомологов человеческого CD20, которые естественным образом экспрессируются клетками или экспрессируются на клетках, трансфецированных геном CD20. Связывание антитела изобретения с антигеном CD20 опосредует уничтожение клеток, экспрессирующих CD20 (например, опухолевой клетки) путем инактивации CD20. Уничтожение клеток, экспрессирующих CD20, может осуществляться по одному или более из следующих механизмов.
Синонимы CD20, принятые в данной области, включают В-лимфоцитарный антиген CD20, В-лимфоцитарный поверхностный антиген В1, Leu-16, Bp35, BM5 и LF5.
Термин "анти-CD20 антитело" в соответствии с изобретением обозначает антитело, которое специфично связывает CD20-антиген. В зависимости от связывающих свойств и биологической активности анти-CD20 антител с CD20-антигеном можно различать два типа aнти-CD20 антител (тип I и тип II анти-CD20 антител) в соответствии с Cragg, M.S., et al, Blood 103 (2004) 2738-2743; и Cragg, M.S., et al Blood 101 (2003) 1045-1051, см. таблицу 2.
Одним из важнейших свойств анти-CD20 антител I и II типа является их способ связывания. Таким образом, анти-CD20 антитела I и II типа можно классифицировать по связывающей способности указанного анти-CD20 антитела с CD20 на клетках Raji (АТСС-№ CCL-86) по сравнению с ритуксимабом.
Используемый в данном документе термин "анти-CD20 антитело" может использоваться для антитела I или II типа. Предпочтительно это антитело II типа.
Aнти-CD20 антитела I типа имеют отношение связывающей способности указанного анти-CD20 антитела с CD20 на клетках Raji (АТСС-№ CCL-86) к связывающей способности с ритуксимабом от 0,8 до 1,2, предпочтительно от 0,9 до 1,1. Примеры таких анти-CD20 антител I типа включают ритуксимаб (WO 94/11026), 1F5 IgG2a (ЕСАСС, гибридома; Press et al., Blood 69/2:584-591 (1987)), HI47 IgG3 (ЕСАСС, гибридома), 2С6 IgG1 (раскрыто в WO 2005/103081), 2F2 IgG1 (раскрыто в WO 2004/035607 и WO 2005/103081) и 2Н7 IgG1 (раскрыто в WO 2004/056312). Предпочтительно указанное анти-CD20 антитело I типа представляет собой моноклональное антитело, которое связывается с таким же эпитопом, как ритуксимаб. AHTH-CD20 антитела II типа имеют отношение связывающей способности указанного анти-CD20 антитела с CD20 на клетках Raji (АТСС-№ CCL-86) к связывающей способности с ритуксимабом от 0,3 до 0,6, предпочтительно от 0,35 до 0,55, более предпочтительно от 0,4 до 0,5. Примеры таких анти-CD20 антител II типа включают тозитумомаб (В1 IgG2a), гуманизированное B-Ly1 антитело IgG1 (химерное гуманизированное антитело IgG1, раскрыто в WO 2005/044859), 11 В8 IgG1 (раскрыто в WO 2004/035607) и АТ80 IgG1. Предпочтительно указанное анти-CD20 антитело II типа представляет собой моноклональное антитело, которое связывается с таким же эпитопом, как гуманизированное B-Ly1 антитело (раскрыто в WO 2005/044859).
"Отношение связывающей способности анти-CD20 антител с CD20 на клетках Raji (АТСС-№CCL-86) к связывающей способности с ритуксимабом" определяют путем прямого иммунофлуоресцентного анализа (измеряют среднюю интенсивность флуоресценции (MFI, mean fluorescence intensity)) с использованием указанного анти-CD20 антитела, конъюгированного с Су5, и ритуксимаба, конъюгированного с Су5, в FACS-анализе (Becton Dickinson) с клетками Raji (ATCC-№ CCL-86), как описано в примере №2, и рассчитывают следующим образом.
MFI представляет собой среднюю интенсивность флуоресценции. Используемый здесь термин "степень Су5-мечения" означает число молекул Су5-метки на молекулу антитела.
Обычно указанное анти-CD20 антитело I типа имеет отношение связывающей способности указанного анти-CD20 антитела I типа с CD20 на клетках Raji (АТСС-№ CCL-86) к связывающей способности с ритуксимабом от 0,8 до 1,2, предпочтительно от 0,9 до 1,1.
Обычно указанное анти-CD20 антитело II типа имеет отношение связывающей способности указанного анти-CD20 антитела I типа с CD20 на клетках Raji (АТСС-№ CCL-86) к связывающей способности с ритуксимабом от 0,3 до 0,6, предпочтительно от 0,35 до 0,55, более предпочтительно от 0,4 до 0,5.
В предпочтительном воплощении указанное анти-CD20 антитело II типа, предпочтительно гуманизированное B-Ly1 антитело, имеет повышенную антителозависимую клеточную цитотоксичность (ADCC).
Под используемым в данном документе термином "антитело, имеющее повышенную антителозависимую клеточную цитотоксичность (ADCC)" понимается антитело с повышенной ADCC, что определяется любым подходящим способом, известным специалистам в данной области. Одним из принятых анализов ADCC in vitro является следующий:
1) анализ использует клетки-мишени, о которых известно, что они экспрессируют целевой антиген, распознаваемый антиген-связывающим участком антитела;
2) в качестве эффекторных клеток анализ использует мононуклеарные клетки периферической крови человека (МНПК, РВМС), выделенные из крови случайно выбранных здоровых доноров;
3) анализ проводится в соответствии со следующим протоколом:
I) МНПК выделяют с использованием стандартных процедур центрифугирования по плотности и суспендируют в количестве 5×106 клеток/мл в культуральной клеточной среде RPMI;
II) клетки-мишени выращивают с использованием стандартных способов культивирования тканей, собирают в экспоненциальной фазе роста с жизнеспособностью более 90%, промывают в культуральной клеточной среде RPMI, метят 100 мкКюри "CI-, дважды промывают в культуральной клеточной среде и ресуспендируют в клеточной культуральной среде с плотностью 1 0' клеток/мл;
III) 100 мкл конечной клеточной суспензии переносят в каждую лунку 96-луночной микропланшеты;
IV) антитела серийно разводят от 4000 нг/мл до 0,04 нг/мл в клеточной культуральной среде, и 50 мкл полученных растворов антитела добавляют к клеткам-мишеням в 96-луночной микропланшете, тестируя в трех экземплярах различные концентрации антитела, охватывающие весь спектр концентраций;
V) для контроля максимального высвобождения (maximum release, MR) в три дополнительные лунки в планшете с мечеными клетками-мишенями вносят по 50 мкл 2% (VN) водного раствора неионогенного поверхностно-активного вещества (Nonidet, Sigma, St. Louis) вместо раствора антитела (п. IV выше);
VI) для контроля спонтанного высвобождения (spontaneous release, SR) в три дополнительные лунки в планшете с мечеными клетками-мишенями вносят по 50 мкл клеточной культуральной среды RPMI вместо раствора антитела (п. IV выше);
VII) затем 96-луночную планшету центрифугируют при 50g в течение 1 минуты и инкубируют в течение 1 часа при 4°С;
VIII) 50 мкл суспензии РВМС (п. V выше) добавляют в каждую лунку для получения отношения эффекторные клетки: клетки-мишени, равного 25: 1, и помещают планшеты в инкубатор в атмосферу с 5% CO2 при 37°С на 4 часа;
IX) из каждой лунки собирают бесклеточный супернатант и с помощью гамма-счетчика оценивают экспериментальный выброс радиоактивных веществ (experimentally released radioactivity, ER);
X) процент специфического лизиса рассчитывают для каждой концентрации антитела в соответствии с формулой (ER-MR)/(MR-SR)×100, где ER представляет собой среднюю радиоактивность, подсчитанную (см. п. IX выше) для данной концентрации антитела, MR представляет собой среднюю радиоактивность, подсчитанную (см. п. IX выше) для контроля MR (см. п. V выше), a SR представляет собой среднюю радиоактивность, подсчитанную (см. п. IX выше) для контроля SR (см. п. VI выше);
4) "повышенная ADCC" определяется или как увеличение максимального процента специфического лизиса, наблюдаемого в пределах концентрации антитела, описанной выше, и/или как снижение концентрации антитела, необходимой для достижения половины максимального процента специфического лизиса, наблюдаемого в пределах концентрации антитела, описанной выше. Повышение ADCC соотносится с ADCC, измеренной в описанном выше анализе при посредничестве того же антитела, которое было получено с помощью того же типа принимающих клеток (клеток-хозяев) с использованием тех же стандартных способов получения, очистки, составления и хранения, которые хорошо известны специалистам в данной области, но которое не было получено с помощью принимающих клеток, созданных для сверхэкспрессии GnTIII.
Указанная "повышенная ADCC" может быть получена с применением гликотехнологии к указанным антителам, это означает повышение указанных естественных клеточно-опосредованных эффекторных функций моноклональных антител путем разработки их олигосахаридного компонента, как описано в Umana, Р. et al., Nature Biotechnol. 17:176-180 (1999) и патенте США №6602684.
Термин "комплемент-зависимая цитотоксичность (CDC)" относится к лизису человеческих опухолевых клеток-мишеней с помощью антитела в соответствии с изобретением в присутствии комплемента. CDC измеряют предпочтительно путем обработки препарата клеток, экспрессирующих CD20, антителом анти-CD20 в соответствии с изобретением в присутствии комплемента. CDC считается найденной, если антитело в концентрации 100 нМ в течение 4 часов индуцирует лизис (клеточную гибель) 20% или более опухолевых клеток. Анализ проводят предпочтительно с опухолевыми клетками, мечеными 51Cr или Eu, и измеряют высвобождение 51Cr или Eu. Для контроля проводят инкубацию опухолевых целевых клеток с комплементом, но без антитела.
Обычно анти-CD20 антитела I и II типа изотипа IgG1 демонстрируют характерные свойства CDC. Анти-CD20 антитела I типа имеют повышенную CDC (изотип IgG1), а анти-CD20 антитела II типа имеют сниженную CDC (изотип IgG1) по сравнению друг с другом. Предпочтительно анти-CD20 антитела и I, и II типа являются антителами изотипа IgG1.
Антитело "ритуксимаб" является генно-инженерным химерным моноклональным антителом, содержащим человеческий гамма 1 и мышиный константный домен, направленным против человеческого антигена CD20. Это химерное антитело содержит человеческие гамма-1 константные домены и называется "С2В8" в W094/11026 (Anderson et al.). Ритуксимаб одобрен для лечения пациентов с рецидивирующей или рефракторной, низкой степени злокачественности или фолликулярной, CD20-положительной В-клеточной неходжкинской лимфомой. Исследования механизма действия in vitro показали, что ритуксимаб демонстрирует человеческую комплемент-зависимую цитотоксичность (CDC) (Reff et. al, Blood 83(2): 435-445 (1994)). Кроме того, он проявляет значительную активность в анализах, которые измеряют антитело-зависимую клеточную цитотоксичность (ADCC).
Термин "гуманизированное B-Ly1 антитело" относится к гуманизированному B-Ly1 антителу, раскрытому в WO 2005/044859, которое было получено из мышиного моноклонального анти-CD20 антитела B-Ly1 (вариабельный участок мышиной тяжелой цепи (VH): SEQ ID №1; вариабельный участок мышиной легкой цепи (VL): SEQ ID №2 - см. Poppema, S. and Visser, L, Biotest Bulletin 3: 131-139 (1987)) путем химеризации с человеческим константным доменом из IgG1 и последующей гуманизации (см. WO 2005/044859). Эти "гуманизированные B-Ly1 антитела" раскрыты подробно в WO 2005/044859.
Предпочтительно "гуманизированное B-Ly1 антитело" имеет вариабельный участок тяжелой цепи (VH), выбранный из группы с SEQ ID №3 по SEQ ID №20 (с В-НН2 по В-НН9 и с B-HL8 по B-HL17 из WO 2005/044859). Особенно предпочтительными являются SEQ ID №№3, 4, 7, 9, 11, 13 и 15 (В-НН2, ВНН-3, В-НН6, В-НН8, B-HL8, B-HL11 и B-HL13 из WO 2005/044859). Наиболее предпочтительным из указанных VH является ВНН6. Предпочтительно "гуманизированное B-Ly1 антитело" имеет вариабельный участок легкой цепи (VL) из SEQ ID №20 (B-KV1) из WO 2005/044859. Кроме того, гуманизированное B-Ly1 антитело является предпочтительно IgG1-антителом. Предпочтительно такие гуманизированные B-Ly1 антитела получены путем модификации углевода, ассоциированного с молекулой белка (glycoengineered, GE) в Fc-области в соответствии с процедурами, описанными в WO 2005/044859, WO 2004/065540, Umana, P. et al., Nature Biotechnol. 17:176-180 (1999) и WO 99/154342. Большинство подвергшихся гликомодификации гуманизированных B-Ly1 антител имеют измененную структуру гликозилирования в Fc-области, предпочтительно имея сниженный уровень фукозных остатков. Предпочтительно по меньшей мере 40% или более (в одном воплощении между 40% и 60%, в другом воплощении по меньшей мере 50%, а в еще одном воплощении по меньшей мере 70% или более) олигосахаридов Fc-области являются нефукозилированными. Кроме того, олигосахариды Fc-области предпочтительно имеют симметричное разветвление. Наиболее предпочтительно "гуманизированное B-Ly1 антитело" содержит VH В-НН6 и VL B-KV1 из WO 2005/044859. В данном документе указанное антитело также называют "HuMab <CD20>". В другом наиболее предпочтительном воплощении указанное антитело имеет сниженный уровень фукозных остатков, как это определено выше, и/или олигосахариды Fc-области наиболее предпочтительно имеют симметричное разветвление. В еще одном наиболее предпочтительном воплощении указанное антитело демонстрирует увеличенную ADCC, как она определена в данном документе.
Олигосахаридный компонент может существенно влиять на свойства, имеющие отношение к эффективности терапевтического гликопротеина, включая физическую стабильность, устойчивость к разрушению протеазой, взаимодействия с иммунной системой, фармакокинетику и специфическую биологическую активность. Такие свойства могут зависеть не только от наличия или отсутствия олигосахаридов, но также от их специфических структур. Можно сделать некоторые обобщения между олигосахаридной структурой и функцией гликопротеина. Например, некоторые олигосахаридные структуры опосредуют быстрое выведение гликопротеина из кровотока через взаимодействие со специфическими углеводосвязывающими белками, тогда как другие могут связываться с антителами и вызывать нежелательные иммунные реакции (Jenkins et al., Nature Biotechnol. 14:975-81 (1996)).
Клетки млекопитающих являются предпочтительными хозяевами для продукции терапевтических гликопротеинов из-за их способности гликозилировать белки в более подходящей для применения у человека форме (Cumming et al., Glycobiology 1:115-30 (1991); Jenkins et al., Nature Biotechnol. 14:975-81 (1996)). Бактерии очень редко гликозилируют белки, и как другие типы общепринятых хозяев, таких как дрожжи, мицелиальные грибы, клетки насекомых и растений, вырабатывают структуры гликозилирования, связанные с быстрым выведением из кровотока, нежелательными иммунными взаимодействиями, а также в некоторых конкретных случаях сокращением биологической активности. Среди клеток млекопитающих в течение последних двух десятилетий наиболее часто используются клетки яичника китайского хомячка (Chinese hamster ovary, CHO). В дополнение к данной подходящей структуре гликозилирования эти клетки позволяют получить постоянное потомство генетически стабильных высокопроизводительных клональных клеточных линий. Они могут культивироваться с высокой плотностью в простых биореакторах с использованием бессывороточных сред и позволяют разработать безопасные и воспроизводимые биологические процессы. Другие часто используемые клетки животных включают клетки почек детенышей хомяка (baby hamster kidney, BHK), мышиные миеломные клетки NSO и SP2/0. Совсем недавно также была испытана продукция с помощью трансгенных животных (Jenkins et al., Nature Biotechnol. 14: 975-981 (1996)).
Все антитела содержат углеводные структуры в консервативных позициях в константных участках тяжелых цепей, с каждым изотипом, обладающим различной сетью N-связанных углеводных структур, которые с различной силой влияют на белковую конструкцию, секрецию или функциональную активность (Wright, A., and Morrison, S.L, Trends Biotech. 15: 26-32 (1997)). Структура присоединенных N-связанных углеводов значительно варьирует в зависимости от степени процессинга, а также может включать высокоманнозные сложные олигосахариды, широко разветвленные и с двумя ветвями (Wright, A., and Morrison, S.L., Trends Biotech. 15: 26-32 (1997)). Как правило, существует гетерогенный процессинг основных олигосахаридных структур, присоединенных к конкретному сайту гликозилирования, так что даже моноклональные антитела существуют в нескольких гликоформах. Кроме того, было показано, что между клеточными линиями происходят значительные различия в гликозилировании антител, и даже при культивировании данной линии клеток в различных условиях наблюдаются незначительные различия (Lifely, M.R. et al., Glycobiology 5(8):813-22 (1995)).
Один из способов достижения значительного увеличения активности, сохраняя при этом простой процесс продукции и, возможно, избегая значительных нежелательных побочных эффектов, заключается в усилении природных клеточно-опосредованных эффекторных функций моноклональных антител путем проектирования их олигосахаридного компонента, как описано в Umana, P. et al., Nature Biotechnol. 17:176-180 (1999) и патенте США №6602684. Антитела типа IgG1, наиболее часто используемые в иммунотерапии рака, являются гликопротеинами, которые имеют консервативный N-связанный сайт гликозилирования Asn297 в каждом СН2-домене. Два сложных олигосахарида с двумя ветвями, присоединенные к Asn297, скрыты между CH2-доменами, образуя обширные контакты с полипептидным остовом, и их присутствие имеет важное значение для опосредования эффекторных функций антитела, таких как антитело-зависимая клеточная цитотоксичность (ADCC) (Lifely, M. R., et al., Glycobiology 5: 813-822 (1995); Jefferis, R., et al., Immunol. Rev. 163: 59-76 (1998); Wright, A. and Morrison, S.L., Trends Biotechnol. 15: 26-32 (1997)).
Ранее было показано, что сверхэкспрессия в клетках яичника китайского хомячка (СНО) β(1,4)-N-ацетилглюкозаминилтрансферазы I11 ("GnTII17y), гликозилтрансферазы, катализирующей образование олигосахаридов с двумя ветвями, значительно увеличивает in vitro ADCC-активность антинейробластомного химерного моноклонального антитела (chCE7), полученного путем проектирования клеток СНО (см. Umana, P. et al., Nature Biotechnol. 17: 176-180 (1999); и WO 99/154342, содержание которого полностью включено данной ссылкой). Антитело chCE7 относится к широкому классу неконъюгированных моноклональных антител, которые имеют высокую опухолевую аффинность и специфичность, но слишком низкую активность, чтобы быть клинически полезными, когда производятся в стандартных промышленных клеточных линиях, в которых отсутствует фермент GnTIII (см. Umana, P. et al., Nature Biotechnol. 17: 176-180 (1999)). Это исследование впервые показало, что значительное увеличение ADCC-активности может быть достигнуто путем создания клеток, продуцирующих антитела, чтобы они экспрессировали GnTIII, что также ведет к увеличению доли константного участка (Fc)-ассоциированных олигосахаридов с двумя ветвями, включая нефукозилированные олигосахариды с двумя ветвями, выше уровней, обнаруженных в природных антителах.
Термин "экспрессия CD20-антигена" призван подчеркнуть значительный уровень экспрессии антигена CD20 в клетке, предпочтительно на клеточной поверхности Т- и В-клетки, более предпочтительно В-клетки, от опухоли или рака соответственно, предпочтительно несолидной опухоли. Пациентов с "CD20-экспрессирующим раком" можно выявить с помощью стандартных анализов, известных в данной области. "Экспрессия CD20-антигена" также предпочтительно используется для указания значительного уровня экспрессии антигена CD20 в клетке, предпочтительно на клеточной поверхности Т- и В-клетки, более предпочтительно В-клетки, при аутоиммунных заболеваниях. Например, экспрессию антигена CD20 измеряют с помощью иммуногистохимического исследования (IHC, immunohistochemical detection), FACS-анализа (проточного цитометрического анализа) или путем основанного на ПЦР выявления соответствующей мРНК.
Термин "CD20-экспрессирующий рак", используемый в данном документе, относится предпочтительно к лимфомам (предпочтительно В-клеточным неходжкинским лимфомам (НХЛ)) и лимфоцитарным лейкемиям. Такие лимфомы и лимфоцитарные лейкемии включают, например, а) фолликулярные лимфомы, b) лимфомы из мелких клеток с нерасщепленными ядрами/лимфому Беркитта (включая эндемическую лимфому Беркитта, спорадическую лимфому Беркитта и неходжкинскую лимфому Беркитта) с) лимфомы маргинальной зоны (включая экстранодальную В-клеточную лимфому маргинальной зоны (лимфомы, связанные с лимфатической тканью слизистой оболочкой, MALT), узловую В-клеточную лимфому маргинальной зоны и лимфому маргинальной зоны селезенки), d) лимфому из клеток зоны мантии (MCL), е) крупноклеточную лимфому (включая диффузную В-крупноклеточную лимфому (DLCL), диффузную лимфому смешанного клеточного типа, иммунобластную лимфому, первичную В-клеточную лимфому средостения, ангиоцентричную лимфому/легочную В-клеточную лимфому), f) волосатоклеточную лейкемию, g) лимфоцитарную лимфому, макроглобулинемию Вальденстрема, h) острый лимфолейкоз (ALL), хронический лимфолейкоз (CLL)/лимфому из малых лимфоцитов (SLL), В-клеточный пролимфоцитарный лейкоз, i) новообразования из плазматических клеток, миелому из плазматических клеток, множественную миелому, плазмоцитому, j) болезнь Ходжкина.
Предпочтительно CD20-экспрессирующий рак является В-клеточной неходжкинской лимфомой (NHL). Особенно CD20-экспрессирующим раком является лимфома клеток мантии (MCL), острый лимфолейкоз (ALL), хронический лимфолейкоз (CLL), В-клеточная диффузная крупноклеточная лимфома (DLCL), лимфома Беркитта, волосатоклеточная лейкемия, фолликулярная лимфома, множественная миелома, лимфома маргинальной зоны, посттрансплантационное лимфопролиферативное расстройство (PTLD), ВИЧ-ассоциированная лимфома, макроглобулинемия Вальденстрема или первичная лимфома ЦНС.
Используемый в данном документе термин "аутоиммунное заболевание" относится к болезни или расстройству, связанному с и направленному против собственных тканей организма. Примеры аутоиммунных заболеваний или расстройств включают артрит (ревматоидный артрит, ювенильный ревматоидный артрит, остеоартроз, псориатический артрит), псориаз, дерматит, полимиозит/дерматомиозит, токсический эпидермальный некролиз, системную склеродермию и склероз, ответы, связанные с 1 5 воспалительными заболеваниями кишечника, болезнь Крона, язвенный колит, респираторный дистресс-синдром, респираторный дистресс-синдром взрослых (ARDS), менингит, энцефалит, увеит, колит, гломерулонефрит, аллергические состояния, экзему, астму, состояния, сопровождающиеся инфильтрацией Т-клеток и хроническими воспалительными реакциями, атеросклероз, аутоиммунный миокардит, дефицит лейкоцитарной адгезии, системную красную волчанку (СКВ), ювенильный диабет, рассеянный склероз, аллергический энцефаломиелит, иммунные реакции, связанные с гиперчувствительностью немедленного и замедленного типа, опосредованные цитокинами и Т-лимфоцитами, туберкулез, саркоидоз, гранулематоз, включая гранулематоз Вегенера, агранулоцитоз, васкулит (включая АNСА-ассоциированный), апластическую анемию, анемию Даймонда-Блэкфана, иммунную гемолитическую анемию, включая аутоиммунную гемолитическую анемию (AIHA), злокачественную анемию, парциальную красноклеточную аплазию (PRCA), дефицит фактора VIII, гемофилию А, аутоиммунную нейтропению, панцитопению, лейкопению, заболевания, сопровождающиеся лейкоцитарным диапедезом, воспалительные заболевания центральной нервной системы (ЦНС), синдром множественных органных поражений, миастению гравис, заболевания, опосредованные комплексом антиген-антитело, болезнь аутоантител к базальным мембранам, антифосфолипидный синдром, аллергический неврит, болезнь Бехчета, синдром Кастлемена, синдром Гудпасчера, миастенический синдром Ламберта-Итона, синдром Рейно, синдром Шегрена, синдром Стивенса-Джонсона, буллезный пемфигоид, пузырчатку, аутоиммунные полиэндокринопатии, нефропатию, IgM-полинейропатии или IgM-опосредованную нейропатию, идиопатическую тромбоцитопеническую пурпуру (ITP), тромботическую тромбоцитопеническую пурпуру (ТТР), аутоиммунную тромбоцитопению, аутоиммунные заболевания семенников и яичников, включая аутоиммунный орхит и оофорит, первичный гипотиреоз; аутоиммунные эндокринные заболевания, включая аутоиммунный тиреоидит, хронический тиреоидит (тиреоидит Хашимото), подострый тиреоидит, идиопатический гипотиреоз, болезнь Аддисона, Базедову болезнь, аутоиммунные полигландулярные синдромы (или полигландулярные синдромы I типа), диабет I типа, также называемый инсулинозависимым сахарным диабетом I типа (IDDM) и синдром Шихана; аутоиммунный гепатит, лимфоидную интерстициальную пневмонию (ВИЧ-ассоциированную), облитерирующий бронхиолит (без пересадки) при NSIP (non-specific interstitial pneumonia, неспецифическая интерстициальная пневмония), синдром Гийена-Барре, васкулит крупных сосудов (включая ревматическую полимиалгию и гигантоклеточный артериит (Такаясу)), васкулит средних сосудов (включая болезнь Кавасаки и узелковый полиартрит), анкилозирующий спондилит, болезнь Берже (IgA-нефропатию), быстро прогрессирующий гломерулонефрит, первичный билиарный цирроз печени, трофические афты (глютеновую энтеропатию), криоглобулинемию, боковой амиотрофический склероз (ALS), ишемическую болезнь сердца, но не ограничиваются ими.
Терапевтические составы антител, используемые в соответствии с данным изобретением, готовят для хранения путем смешивания антитела, имеющего желаемую степень чистоты, с возможными фармацевтически приемлемыми носителями, эксципиентами и стабилизаторами (Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)), в форме лиофилизированных составов или водных растворов. Приемлемые носители, эксципиенты или стабилизаторы нетоксичны для реципиентов в рабочих дозах и концентрациях.
Термин "поверхностно-активное вещество", используемый в данном документе, обозначает фармацевтически приемлемый поверхностно-активный агент. В составе изобретения количество поверхностно-активного вещества описывается процентом, выраженным как вес/объем. Наиболее часто используемыми единицами веса/объема являются мг/мл. Подходящие фармацевтически приемлемые поверхностно-активные вещества включают неионогенные поверхностно-активные вещества, такие как TWEEN™, PLURONICS™ или полиэтиленгликоль (ПЭГ, PEG), но не ограничиваются ими. Кроме того, они включают сложные эфиры жирных кислот и полиэтиленсорбита, полиэтилен-полипропиленгликоли, полиоксиэтиленстеараты и додецилсульфаты натрия, но не ограничиваются ими. Предпочтительными полиэтиленсорбитами являются сложные эфиры полиэтилен(20)-сорбита (синоним полисорбата 20, продается под торговой маркой Tween 20™) и полиоксиэтилен(20)-сорбитмоноолеат (синоним полисорбата 80, продается под торговой маркой Tween 80™). Предпочтительными полиэтилен-полипропиленгликолями являются те, которые продаются под именами Pluronic® F68 или Poloxamer 188™. Наиболее предпочтительным является Poloxamer 188™. Предпочтительными полиоксиэтиленстеаратами являются те, которые продаются под торговой маркой Myrj™. Предпочтительными монолауриловыми эфирами полиоксиэтилена являются те, которые продаются под торговой маркой Brij™. При применении сложного эфира полиэтиленсорбит-полиэтилен(20)-сорбита (Tween 20™) и полиоксиэтилен(20)сорбитмоноолеата (Tween 80™) они используются главным образом в количестве от примерно 0,001 до примерно 1%, предпочтительно от примерно 0,005 до примерно 0,1%, еще более предпочтительно от примерно 0,01% до примерно 0,04% (масса/объем).
Термин "буфер", используемый в данном документе, обозначает фармацевтически приемлемый буфер. Подходящий фармацевтически приемлемый буфер включает гистидиновые буферы, цитратные буферы, сукцинатные буферы, ацетатные буферы и фосфатные буферы, но не ограничивается ими. Предпочтительные буферы содержат L-гистидин или смеси L-гистидина с гидрохлоридом L-гистидина с изотоническими агентами и возможно подвергаются корректировке рН с помощью кислоты или основания, известных в данной области. Наиболее предпочтительным является L-гистидин. Указанные выше гистидиновые буферы, как правило, используются в концентрации от примерно 1 мМ до примерно 100 мМ, предпочтительно от примерно 5 мМ до примерно 50 мМ, и еще более предпочтительно примерно 20 мМ. Независимо от используемого буфера рН будет скорректирована до значения, составляющего от примерно 4,5 до примерно 7,0, предпочтительно от примерно 5,5 до примерно 6,5, еще более предпочтительно примерно 6,0, или с помощью кислоты или основания, известных в данной области, или с помощью адекватных смесей буферных компонентов, или обоими способами.
Термин "изотонические агенты", используемый в данном документе, обозначает фармацевтически приемлемые изотонические агенты. Изотонические агенты используются для получения изотонического состава. Изотонический состав представляет собой жидкость или жидкость, восстановленную из твердой формы, например лиофилизированной, и обозначает раствор, имеющий такую же тоничность, как и некоторые другие растворы, с которыми его сравнивают, например физиологический солевой раствор и сыворотка крови. Подходящие изотонические агенты включают (но не ограничиваются ими) соли, в том числе хлорид натрия (NaCl) или хлорид калия, но не ограничиваясь ими, сахара, в том числе глюкозу, сахарозу, трегалозу, но не ограничиваясь ими, глицерин и любой компонент из группы аминокислот, сахара, соли и их комбинации. Изотонические агенты, как правило, используются в конечной концентрации от примерно 5 мМ до примерно 350 мМ.
Термин "жидкость", который используется в данном документе в связи с составом в соответствии с изобретением, означает состав, который является жидким при температуре по меньшей мере от примерно 2 до примерно 8°С.
Термин "лиофилизированный", который используется в данном документе в связи с составом в соответствии с изобретением, означает состав, который высушивают путем замораживания состава, а затем подвергают возгонке льда из замороженного содержимого с помощью любого из способов высушивания замораживанием, известных в данной области, например с помощью коммерчески доступных устройств высушивания замораживанием.
Термин "соли", используемый в данном документе, обозначает соль в количестве от примерно 1 мМ до примерно 500 мМ. Неограничивающими примерами солей являются соли любых комбинаций катионов натрия, калия, кальция или магния с хлоридными, фосфатными, цитратными, сукцинатными, сульфатными анионами или их смесей.
Термин "аминокислота", используемый в данном документе, обозначает аминокислоту в количестве от примерно 1 до примерно 100 мг/мл, включая аргинин, глицин, орнитин, глутамин, аспарагин, лизин, гистидин, глутаминовую кислоту, аспарагиновую кислоту, изолейцин, лейцин, аланин, фенилаланин, тирозин, триптофан, метионин, серин, пролин, но не ограничиваясь ими.
Термин "сахар", используемый в данном документе, обозначает фармацевтически приемлемый сахар, используемый в количестве от примерно 25 мМ до примерно 500 мМ. Предпочтительным является количество от 100 до 300 мМ. Более предпочтительным является количество от 220 до 260 мМ. Наиболее предпочтительным является количество 240 мМ. Подходящие сахара включают моносахариды и дисахариды, но не ограничиваются ими. Неограничивающими примерами сахара в соответствии с изобретением являются трегалоза, сахароза, маннитол, сорбитол, лактоза, глюкоза, манноза, мальтоза, галактоза, фруктоза, сорбоза, раффиноза, глюкозамин, N-метилглюкозамин (так называемый "меглумин"), галактозамин и нейраминовая кислота и их комбинации. Наиболее предпочтительной является трегалоза.
Термин "стабилизатор" относится к фармацевтически приемлемым стабилизаторам, таким как, например, аминокислоты и сахара, описанные в предыдущих разделах, а также имеющиеся в продаже декстраны любого типа и молекулярного веса, известные в данной области, но не ограничивается ими.
Термин "антиоксидант" означает фармацевтически приемлемый антиоксидант. Он может включать эксципиенты, такие как метионин, бензиловый спирт или любой другой эксципиент, используемый для сведения окисления к минимуму.
Термин "способ лечения" или его эквивалент, применяемый, например, к раку, относится к процедуре или курсу действий, которые предназначены для уменьшения или устранения количества раковых клеток у пациента или облегчения симптомов рака. "Способ лечения" рака или другого пролиферативного расстройства не обязательно означает, что раковые клетки или другое расстройство в действительности могут быть устранены, что число клеток или расстройство в действительности могут быть сокращены или что симптомы рака или другого расстройства в действительности могут быть ослаблены. Часто способ лечения рака будет выполняться даже при низкой вероятности успеха, но когда тем не менее считается, с учетом истории болезни и предполагаемой продолжительности выживания пациента, что это будет иметь улучшающее действие.
В одном аспекте изобретение относится к составу с антителом анти-CD20, содержащему:
- от примерно 1 до примерно 150 мг/мл антитела анти-CD20,
- от примерно 0,001 до примерно 1% по меньшей мере одного ПАВ, а также
- от примерно 1 до примерно 100 мМ буфера
при рН от примерно 4,5 до примерно 7,0.
В более предпочтительном воплощении состав в соответствии с изобретением содержит:
- от примерно 1 до примерно 150 мг/мл антитела анти-CD20,
- от примерно 0,005 до примерно 0,05% по меньшей мере одного ПАВ, а также
- от примерно 1 до примерно 100 мМ буфера
при рН от примерно 4,5 до примерно 7,0.
В предпочтительном воплощении состав в соответствии с изобретением содержит:
- от примерно 10 до примерно 30 мг/мл анти-CD20 антитела II типа,
- 20 мМ L-гистидина,
- 240 мМ трегалозы, а также
- 0,02% (масса/объем) полисорбата 20
при рН примерно 6.
В еще одном предпочтительном воплощении состав в соответствии с изобретением содержит:
- от примерно 10 до примерно 30 мг/мл анти-CD20 антитела II типа,
- 0,02% (масса/объем) полоксамера 188™,
- 20 мМ L-гистидина, а также
- 240 мМ трегалозы
при рН примерно 6.
Предпочтительно анти-CD20 антитело является антителом 1 типа. Более предпочтительно анти-CD20 антитело является антителом II типа. Еще более предпочтительно анти-CD20 антитело является "гуманизированным B-Ly1 антителом", как подробно описано в WO 2005/044859. Наиболее предпочтительно антитело является HuMab <CD20>. Состав содержит указанное антитело в количестве от 1 до примерно 150 мг/мл, более предпочтительно от примерно 5 до примерно 100 мг/мл указанного антитела, еще более предпочтительно от примерно 10 до примерно 30 мг/мл указанного антитела, либо его количество выбрано среди примерно 5, 10, 15, 20, 25 или 30 мг/мл указанного антитела, и наиболее предпочтительно 25 мг/мл указанного антитела.
Состав в соответствии с изобретением может быть в жидкой форме, в лиофилизированной форме или в жидкой форме, восстановленной из лиофилизированной формы.
В одном воплощении состав в соответствии с изобретением представляет собой лиофилизированный состав. Лиофилизированный состав в соответствии с изобретением обладает преимуществом, заключающимся в повышении стабильности в связи с образованием частиц и агрегатов с более высоким молекулярным весом, что, как правило, является трудно достижимым с жидкими составами с той же концентрацией описанного анти-CD20 антитела.
Состав в соответствии с изобретением можно вводить внутривенно (в/в), подкожно (п/к) или любым другим парентеральным путем, известным в фармацевтической области.
Кроме того, состав в соответствии с изобретением может содержать консерванты (например, хлорид октадецилдиметилбензил-аммония; хлорид гексаметония, хлорид бензалкония, хлорид бензетония; фенол, бутиловый или бензиловый спирт; алкилпарабены, такие как метиловый или пропиловый парабен; катехол; резорцин; циклогексанол; 3-пентанол и м-крезол); низкомолекулярные (менее 10 остатков) полипептиды; белки, такие как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины; хелатирующие агенты, такие как ЭДТА; солеобразующие противоионы, такие как натрий; металлокомплексы (например Zn-белковые комплексы).
Также активные ингредиенты могут быть введены в изготовленных микрокапсулах, например путем методик коацервации или путем полимеризации на границе раздела фаз, например в гидроксиметилцеллюлозных или желатиновых микрокапсулах и полиметилметацилатных микрокапсулах соответственно, в коллоидных системах доставки лекарственных средств (например липосомах, альбуминовых микросферах, микроэмульсиях, наночастицах и нанокапсулах) или в макроэмульсиях. Такие методики раскрыты в Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980).
Могут быть изготовлены препараты замедленного высвобождения. Подходящими примерами препаратов замедленного высвобождения являются полупроницаемые матрицы из твердых гидрофобных полимеров, содержащие антитело, которые формируют в виде округлых частиц, например пленок или микрокапсул. Примеры матриц для замедленного высвобождения включают полиэфиры, гидрогели (например поли(2-гидроксиэтил-метакрилат) или поливиниловый спирт), полилактиды (патент США 3773919), сополимеры L-глутаминовой кислоты и гамма-этил-1-глутамата, неразлагающийся этиленвинилацетат, разлагающиеся сополимеры молочной кислоты и гликолевой кислоты, такие как LUPRON DEPOT™ (инъекционные микросферы, состоящие из сополимера молочной кислоты и гликолевой кислоты и ацетата лейпролида), а также поли-D-(-)-3-гидроксимасляную кислоту.
Составы, которые будут применяться для введения in vivo, должны быть стерильными. Это легко осуществляется путем фильтрации через мембраны для стерилизующей фильтрации.
Предпочтительно состав изобретения содержит один или более изотонический агент в количестве от примерно 5 мМ до примерно 350 мМ, как было определено в данном документе выше.
Предпочтительно состав изобретения содержит сахар в количестве от примерно 25 мМ до до примерно 500 мМ, как было определено выше.
Также предпочтительно состав изобретения также содержит один или более из следующих ингредиентов: антиоксиданты, аскорбиновую кислоту, глутатион, консерванты, например м-крезол, фенол, бензиловый спирт, метилпарабен, пропилпарабен, хлорбутанол, тиомерсал, бензалкониумхлорид, полиэтиленгликоль, например ПЭГ 3000, 3350, 4000, 6000, альбумин, человеческий сывороточный альбумин (HSA), бычий сывороточный альбумин (BSA), многоатомный спирт, глицерин, этанол, маннитол, соли, ацетаты солей (например ацетат натрия), хлорид магния, хлорид кальция, трометамин, ЭДТА (например Na-ЭДТА).
Также предпочтительно состав изобретения также содержит один или более стабилизатор, определенный выше, и ингредиенты, также известные в данной области как «лиопротектант» (lyoprotectant), такие как сахара, сахарные спирты, аминокислоты и декстраны, известные в данной области.
В определенном воплощении состав изобретения содержит следующие составы в жидкой форме, лиофилизированной форме или в жидкой форме, восстановленной из лиофилизированных форм:
15 мг/мл анти-CD20 антитела II типа, предпочтительно гуманизированного В-Ly1 антитела, наиболее предпочтительно HuMab <CD20>,
0,01% (масса/объем) полисорбата 20,
20 мМ L-гистидина, а также
140 мМ хлорида натрия
при рН 6,0;
или
10 мг/мл анти-CD20 антитела II типа, предпочтительно гуманизированного B-Ly1 антитела, наиболее предпочтительно HuMab <CD20>,
0,01% (масса/объем) полисорбата 20,
20 мМ L-гистидина, а также
140 мМ хлорида натрия
при рН 6,0;
или
15 мг/мл анти-CD20 антитела II типа, предпочтительно гуманизированного B-Ly1 антитела, наиболее предпочтительно HuMab <CD20>,
возможно от 0,001 до 1% (масса/объем) поверхностно-активного вещества,
20 мМ L-гистидина
при рН 6,0;
или
10 мг/мл анти-CD20 антитела II типа, предпочтительно гуманизированного B-Ly1 антитела, наиболее предпочтительно HuMab <CD20>,
0,02% полисорбата 20 (масса/объем),
20 мМ L-гистидина, а также
240 мМ трегалозы
при рН 6,0;
или
25 мг/мл анти-CD20 антитела II типа, предпочтительно гуманизированного B-Ly1 антитела, наиболее предпочтительно HuMab <CD20>,
0,02% полисорбата 20 (масса/объем),
20 мМ L-гистидина, и
240 мМ трегалозы
при рН 6,0;
или
25 мг/мл анти-CD20 антитела II типа, предпочтительно гуманизированного B-Ly1 антитела, наиболее предпочтительно HuMab <CD20>,
0,02% (масса/объем) полоксамера 188™,
20 мМ L-гистидина, а также
240 мМ трегалозы
при рН 6,0;
или
25 мг/мл анти-CD20 антитела II типа, предпочтительно гуманизированного B-Ly1 антитела, наиболее предпочтительно HuMab <CD20>,
0,01% (масса/объем) полоксамера 188™,
20 мМ L-гистидина, а также
240 мМ трегалозы
при рН 6,0;
или
25 мг/мл анти-CD20 антитела II типа, предпочтительно гуманизированного B-Ly1 антитела, наиболее предпочтительно HuMab <CD20>,
0,01% (масса/объем) полоксамера 188™,
20 мМ L-гистидина, а также
240 мМ трегалозы
при рН 6,0;
или
25 мг/мл анти-CD20 антитела II типа, предпочтительно гуманизированного B-Ly1 антитела, наиболее предпочтительно HuMab <CD20>,
0,1% (масса/объем) полоксамера 188™,
20 мМ L-гистидина, а также
240 мМ трегалозы
при рН 6,0;
или
25 мг/мл анти-CD20 антитела II типа, предпочтительно гуманизированного B-Ly1 антитела, наиболее предпочтительно HuMab <CD20>,
0,02% (масса/объем) полисорбата 80,
20 мМ L-гистидина, а также
240 мМ трегалозы
при рН 6,0;
или
25 мг/мл анти-CD20 антитела II типа, предпочтительно гуманизированного B-Ly1 антитела, наиболее предпочтительно HuMab <CD20>,
0,1% (масса/объем) полисорбата 80,
20 мМ ацетата, а также
240 мМ трегалозы
при рН 5,5;
или
25 мг/мл анти-CD20 антитела II типа, предпочтительно гуманизированного B-Ly1 антитела, наиболее предпочтительно HuMab <CD20>,
0,1% (масса/объем) полисорбата 80,
20 мМ ацетата, а также
140 мМ хлорида натрия
при рН 5,5;
или
30 мг/мл анти-CD20 антитела II типа, предпочтительно гуманизированного B-Ly1 антитела, наиболее предпочтительно HuMab <CD20>,
0,01% (масса/объем) полоксамера 188™,
20 мМ L-гистидина, а также
200 мМ трегалозы
при рН 6,5.
В предпочтительном воплощении состава в соответствии с изобретением состав находится в лиофилизированной форме и содержит после восстановления с соответствующим количеством воды для инъекций:
10 мг/мл анти-CD20 антитела II типа, предпочтительно гуманизированного B-Ly1 антитела, наиболее предпочтительно HuMab <CD20>,
0,02% (масса/объем) полисорбата 20,
20 мМ L-гистидина, а также
240 мМ трегалозы
при рН 6,0.
Этот состав демонстрирует хорошую стабильность при хранении его при температуре 2-8°С и 25°С с достаточной устойчивостью в отношении физических конечных пунктов, таких как агрегация, и химических конечных пунктов, таких как фрагментация.
В предпочтительном воплощении состава в соответствии с изобретением состав является жидкой формой:
25 мг/мл анти-CD20 антитела II типа, предпочтительно гуманизированного BLy1 антитела, наиболее предпочтительно HuMab <CD20>,
0,02% (масса/объем) полоксамера 188™,
20 мМ L-гистидина, а также
240 мМ трегалозы
при рН 6,0.
В предпочтительном воплощении состав применяют для предотвращения или уменьшения метастазов или дальнейшей диссеминации у такого пациента, страдающего от CD20-экспрессирующего рака. Состав применяют для увеличения продолжительности жизни такого пациента, увеличения выживаемости такого пациента без прогрессии, увеличения продолжительности ответа, что приводит к статистически значимому и клинически заметному улучшению состояния леченых пациентов, определяемому по продолжительности жизни, выживаемости без прогрессии, доли ответивших на лечение или продолжительности ответа. В предпочтительном воплощении состав применяют для увеличения доли ответов на лечение в группе пациентов.
В контексте этого изобретения в сочетании с составом с анти-CD20 антителом в соответствии с изобретением могут быть использованы дополнительные другие цитотоксические, химиотерапевтические или противораковые агенты или соединения, которые усиливают эффект таких агентов.
Такие агенты включают, например: алкилирующие агенты или агенты с алкилирующим действием, например циклофосфамид (СТХ, например, цитоксан®), хлорамбуцил (CHL, например, лейкеран®), цисплатин (CisP, например, platinol®), бусульфан (например, милеран®), мелфалан, кармустин (BCNU), стрептозотоцин, триэтиленмеламин (TEA), митомицин С и т.п.; антиметаболиты, такие как метотрексат (МТХ), этопозид (VP16, например, вепезид®), 6-меркаптопурин (6МР), 6-тиогуанин (6TG), цитарабин (Ara-С), 5-фторурацил (5-FU), капецитабин (например, кселода®), дакарбазин (DTIC) и т.п.; антибиотики, такие как актиномицин D, доксорубицин (DXR, например, адриамицин®), даунорубицин (дауномицин), блеомицин, митрамицин и т.п.; алкалоиды, такие как алкалоиды Винка, например винкристин (VCR), винбластин и т.п.; и другие противоопухолевые препараты, такие как паклитаксел (например, таксол®) и производные паклитаксела, цитостатические агенты, глюкокортикоиды, такие как дексаметазон (DEX, например, декадрон®) и кортикостероиды, такие как преднизон, нуклеозидные ингибиторы ферментов, такие как гидроксимочевину, ферменты, разрушающие аминокислоты, такие как аспарагиназу, лейковорин и другие производные фолиевой кислоты, и подобные различные противоопухолевые агенты. В качестве дополнительного средства также могут быть использованы следующие агенты: амифостин (например, этиол®), дактиномицин, мехлоретамин (азотистый аналог иприта), стрептозоцин, циклофосфамид, ломустин (CCNU), липосомальный доксорубицин (например, доксил®), гемцитабин (например, гемзар®), липосомальный даунорубицин (например, дауноксом®), прокарбазин, митомицин, доцетаксел (например, таксотер®), алдеслейкин, карбоплатин, оксалиплатин, кладрибин, камптотецин, СРТ 11 (иринотекан), 10-гидрокси-этил-7-камптотецин (SN38), флоксуридин, флударабин, ифосфамид, идарубицин, месна, бета-интерферон, альфа-интерферон, митоксантрон, топотекан, лейпролид, мегестрол, мелфалан, меркаптопурин, пликамицин, митотан, пегаспаргаза, пентостатин, пипоброман, пликамицин, тамоксифен, тенипозид, тестолактон, тиогуанин, тиотепа, горчичный урацил, винорельбин, хлорамбуцил. Предпочтительно используется комбинация для лечения с анти-CD20 антителом без таких дополнительных агентов.
Применение цитотоксических и противоопухолевых агентов, описанных выше, также как и антипролиферативных специфических к мишеням противоопухолевых препаратов, таких как ингибиторы протеинкиназы в химиотерапевтических схемах, как правило, хорошо охарактеризовано в области терапии рака, и их применение здесь основано на тех же соображениях мониторинга толерантности и эффективности и для контроля путей введения и доз с некоторыми изменениями. Например, фактические дозы цитотоксических агентов могут варьировать в зависимости от ответа культуры клеток пациента, определенного с помощью способов культивирования тканей. Как правило, доза будет снижена по сравнению с количеством, используемым в отсутствие дополнительных других агентов.
Типичные дозы эффективного цитотоксического агента могут находиться в диапазоне, рекомендованном изготовителем, и, будучи обозначенными как ответы in vitro или ответы на животных моделях, они могут быть сокращены до примерно одного порядка величины концентрации или количества. Таким образом, фактическая доза будет зависеть от решения врача, состояния пациента, а также эффективности терапевтического способа, основанного на реакции in vitro первично культивированных злокачественных клеток или культивированного образца ткани, или на реакции, наблюдаемой на соответствующих животных моделях.
В контексте данного изобретения можно проводить ионизирующее облучение в эффективном количестве и/или в дополнение к составу с анти-CD20 антителом в соответствии с изобретением можно использовать радиоактивный препарат. Источник излучения может быть внешним или внутренним для пациента, получающего лечение. Если источник является внешним по отношению к пациенту, то терапия называется наружной лучевой терапией (EBRT, external beam radiation therapy). Если источник является внутренним по отношению к пациенту, то терапия называется брахитерапией (ВТ, brachytherapy). Радиоактивные атомы для применения в контексте данного изобретения могут быть выбраны из группы, включающей радий, цезий-137, иридий-192, америций-241, золото-198, кобальт-57, медь-67, технеций-99, йод-123, йод-131 и индий-111, но не ограничивающейся ими. Также можно пометить антитела такими радиоактивными изотопами. Предпочтительно состав с анти-CD20 антителом в соответствии с изобретением применяется без такого ионизирующего облучения.
Радиационная терапия является стандартным способом контроля нерезектабельной или неоперабельной опухоли и/или метастазов опухоли. Улучшенные результаты были замечены при объединении лучевой терапии с химиотерапией. Лучевая терапия основана на том принципе, что высокие дозы излучения, поступаемые в целевую область, приводят к гибели репродуктивных клеток как опухолевых, так и нормальных тканей. Режим дозы облучения, как правило, задается в форме поглощенной дозы излучения (Гр), времени и фракционирования и должен быть тщательно определен онкологом. Количество радиации, которое получает пациент, будет зависеть от различных факторов, но двумя наиболее важными являются локализация опухоли по отношению к другим критическим структурам или органам тела и степень распространения опухоли. Типичный курс лечения для пациента, который проходит лучевую терапию, течет по графику от 1 до 6 недель с суммарной дозой от 10 до 80 Гр, вводимой пациенту 5 дней в неделю частями примерно от 1,8 до 2,0 Гр в день. В предпочтительном воплощении данного изобретения введение людям с опухолью состава в соответствии с изобретением и радиация действуют синергично. Другими словами, торможение опухолевого роста с помощью агентов, содержащих комбинацию изобретения, усиливается в сочетании с излучением, возможно с дополнительными химиотерапевтическими или противоопухолевыми агентами.
Параметры адъювантной радиационной терапии содержатся, например, в WO 99/60023.
Состав с антителом вводят пациенту в соответствии с известными способами путем внутривенного введения в виде болюса или непрерывной инфузии в течение периода времени, внутримышечным, внутрибрюшинным, внутриспинномозговым, подкожным, внутрисуставным, интрасиновиальным или интратекальным путем. Внутривенное или подкожное введение антител является предпочтительным.
Изобретение также содержит набор, характеризующийся содержанием контейнера, композиции внутри контейнера, содержащей указанный состав антитела анти-CD20, а также вкладыш с инструкцией пользования состава для введения указанного состава с анти-CD20 антителом пациенту, страдающему от CD20-экспрессирующего рака.
Термин "вкладыш" относится к инструкциям, обычно включаемым в коммерческие упаковки терапевтических продуктов, которые могут содержать информацию о показаниях, применении, дозировке, введении, противопоказаниях и/или предостережениях, касающихся использования таких терапевтических продуктов.
В предпочтительном воплощении продукт производства контейнер может также включать фармацевтически приемлемый носитель. Продукт производства может также включать стерильный растворитель, который предпочтительно хранится в отдельном дополнительном контейнере.
Используемый в данном документе термин "фармацевтически приемлемый носитель" включает любые или все материалы, совместимые с введением лекарственных препаратов, включая растворители, дисперсные среды, покрытия, антибактериальные и противогрибковые средства, изотонические и задерживающие абсорбцию агенты, а также другие материалы и соединения, совместимые с введением лекарственных препаратов. За исключением случаев, когда любая обычная среда или агент несовместимы с активным соединением, ее применение в композиции изобретения может рассматриваться. Дополнительные активные соединения также могут быть включены в композиции.
В еще одном воплощении изобретения состав в соответствии с изобретением содержит анти-CD20 антитело 1 типа, которое вводят вместе с анти-CD20 антителом II типа в соответствии с изобретением. Составы в соответствии с изобретением могут быть двумя отдельными составами для каждого из анти-CD20 антител. Альтернативно состав в данном случае может также содержать оба антитела в одном составе.
В еще одном воплощении изобретения состав в соответствии с изобретением содержит анти-CD20 антитело, и указанное анти-CD20 антитело вводят вместе с анти-Всl-2 активным агентом. Термин "Всl-2", используемый в данном документе, относится к белку Всl-2 (ID в Swiss Prot (Швейцарской базе данных по аминокислотным последовательностям) №Р10415), члену семейства белков Bcl-2. Термин "активный агент анти-Bcl-2" включает в себя "анти-Bcl-2 антисмысловые нуклеотиды" и "Bcl-2 ингибиторы". "Анти-Bcl-2 антисмысловые нуклеотиды" уменьшают уровни мРНК Bcl-2 и снижают экспрессию белка Bcl-2. Примеры таких анти-Bcl-2 антисмысловых нуклеотидов включают облимерсен и SPC-2996. Термин "АВТ-737", используемый в данном документе, означает N-[4-[4-(4'-хлорбифенил-2-илметил)пиперазин-1-ил]бензоил]-3-[3-(диметиламино)-1(R)-(фенилсульфанилметил)пропиламино]-4-нитробензенсульфонамид; 4-[4-(4'-хлорбифенил-2-илметил)пиперазин-1-ил]-N-[3-[3-(диметиламино)-1(R)-(фенилсульфанилметил)пропиламино]-4-нитрофенилсульфонил]бензамид, Bcl-2 ингибитор, который описан в WO 2006/099667 или Corey, S., et al., Cancer Cell (2005) 5-6. Термин "ВТ-263", используемый в данном документе, означает Bcl-2 ингибитор, описанный в патенте США 2007027135. Предпочтительно активный агент анти-Bcl-2 выбирают среди облимерсена, SPC-2996, ТА-402, госсипола, АТ-101, препарата Obatoclax mesylate (обатоклакс мезилат), А-371191, А-385358, А-438744, АВТ-737, АТ-101, BL-11, BL-193, GX-15-003, 2-метоксиантимицина А3, НА-14-1, KF-67544, пурпурогаллина, TP-TW-37, YC-137 и Z-24. Предпочтительно активным агентом анти-Bcl-2 является Bcl-2-белок-связывающий ингибитор с IС50 анти-Bcl-2 ингибиторной активности 5 мкМ или менее. Такой Bcl-2-белок-связывающий ингибитор предпочтительно выбирают среди госсипола, АТ-101, препарата Obatoclax mesylate, АВТ-263 и АВТ-737, более предпочтительно из АВТ-263 или АВТ-737.
В еще одном воплощении изобретения состав в соответствии с изобретением содержит анти-CD20 антитело, и указанное анти-CD20 антитело вводят вместе с ингибитором протеасомы. Термин "ингибитор протеасомы", используемый в данном документе, относится к агентам, которые ингибируют активность протеасомы 26S. Такие ингибиторы протеасом включают, в частности, производные пептидов, такие как альдегиды пептидов (например, MG132, MG115, СЕР-1615, PSI или специфический ингибитор иммунопротеасомы IPSI-001 (Cbz-LnL-CHO = N-карбобензилокси-лейцил-норлейцинал, см. патент США 20060241056), боронаты пептидов (например, бортезомиб (PS-341) или DFLB), эпоксикетоны пептидов (например, эпоксомицин, дигидроэпонемицин или производное эпонемицина карфилзомиб (PR-171)) или винилсульфоны пептидов (например, NLVS), и непептидные производные, такие как салиноспорамид A (NPI-0052), производные салиноспорамида А, лактацистин или производные лактацистина (например, класто-лактацистин-L-лактон (омуралид) или PS-519). Описаны различные типы и структуры указанных ингибиторов протеасом, например в Kisselev, A.L, et al., Chem Biol (2001) 739-758, WO 2004/004749 и Joazeiro, С., et al., Res 66(16) (2006) 7840-7842), Kanagasabaphy, et al., Curr Opin Investig Drugs 8 (2007) 447-51, Adams, J., Nat Rev Cancer 4 (2004) 349-360 и в патенте США 20060241056.
Предпочтительно такой ингибитор протеасом выбирают среди пептидных альдегидов (предпочтительно N-карбобензилокси-лейцил-норлейцинал (IPSI-001)), пептидных боронатов (предпочтительно бортезомиб (PS-341)), пептидных эпоксикетонов (предпочтительно производное эпоксимицина карфилзомиб (PR-171)) или салиноспорамид A (NPI-0052). Более предпочтительно такой ингибитор протеасом выбирают среди бортезомиба (PS-341), карфилзомиба (PR-171), салиноспорамида А (NPI-0052) или N-карбобензилокси-лейцил-норлейцинала (IPSI-001).
В предпочтительном воплощении ингибитор протеасом является пептидным производным, выбранным среди пептидных альдегидов (предпочтительно N-карбобензилокси-лейцил-норлейцинал (IPSI-001)), пептидных боронатов (предпочтительно бортезомиб (PS-341)) или пептидных эпоксикетонов. В другом предпочтительном воплощении ингибитор протеасом является пептидным боронатом (предпочтительно бортезомибом (PS-341), см., например, Adams, Cur. Opin. Chem Biol. 6 (2002) 493-500 и патент США 5780454)).
Предпочтительно ингибитор протеасом обладает антипротеасомной ингибиторной активностью с IC50 5 мкМ или менее, более предпочтительно 1 мкМ или менее. Клеточный анализ для выявления таких ингибиторов протеасом и для определения IC50 антипротеасомной ингибиторной активности (через последовательные разведения и расчеты с использованием соответствующей нелинейной кривой (XLfit программного обеспечения (ID Business Solution Ltd, Гилфорд, графство Суррей, Великобритания)) описан в Moravec, et al., Cell Notes 15 (2006) 4-7 и использует реагент для клеточного анализа Proteasome-Glo™ из Promega с клетками U266 (человеческая плазматическая миелома). Этот анализ "измерение с добавлением микса" измеряет химотрипсин-подобную протеазную активность, связанную с протеасомой в культивируемых клетках.
Кроме IPSI-001 (Cbz-LnL-CHO = N-карбобензилокси-лейцил-норлейцинал) предпочтительными ингибиторами протеасом также являются следующие производные пептидов патента США 20060241056:
N-карбобензилокси-гомофенилаланил-фенилаланилал, N-карбобензилокси-лейцил-фенилаланилал, N-карбобензилокси-аланил-фенилаланилал, N-карбобензилокси-глицил-пролил-аланил-фенилаланилал, N-карбобензилокси-глицил-пролил-фенилаланил-фенилаланилал, N-карбобензилокси-глицил-фенилаланил-фенилаланилал, N-карбобензилокси-лейцил-норлейцинбороновая кислота, N-карбобензилокси-фенилаланил-фенилаланинбороновая кислота, N-карбобензилокси-гомофенилаланил-фенилаланинбороновая кислота, N-карбобензилокси-лейцил-фенилаланинбороновая кислота, N-карбобензилокси-глицил-пролил-аланил- фенилаланинбороновая кислота, N-карбобензилокси-глицил-пролил-фенилаланил-фенилаланинбороновая кислота, N-карбобензилокси-лейцил-лейцил-фенилаланинбороновая кислота, N-карбобензилокси-глицил-фенилаланил-фенилаланинбороновая кислота, N-карбобензилокси-лейцил-норлейцин-метилвинилсульфон, N-карбобензилокси-фенилаланил-фенилаланин-метилвинилсульфон, N-карбобензилокси-гомофенилаланин-фенилаланин-метилвинилсульфон, N-карбобензилокси-лейцил-фенилаланин-метилвинилсульфон, N-карбобензилокси-аланил-фенилаланин-метилвинилсульфон, N-карбобензилокси-глицил-пролил-аланил-фенилаланин-метилвинилсульфон, N-карбобензилокси-глицил-пролил-фенилаланил-фенилаланин-метилвинилсульфон, N-карбобензилокси-лейцил-лейцил-фенилаланин-метилвинилсульфон, N-карбобензилокси-глицил-фенилаланил-фенилаланин-метилвинилсульфон, N-карбобензилокси-лейцил-норлейцин-эпоксикетон, N-карбобензилокси-фенилаланил-фенилаланин-эпоксикетон, N-карбобензилокси-гомофенилаланил-фенилаланин-эпоксикетон, N-карбобензилокси-лейцил-фенилаланин-эпоксикетон, N-карбобензилокси-аланил-фенилаланин-эпоксикетон, N-карбобензилокси-глицил-пролил-аланил-фенилаланин-эпоксикетон, N-карбобензилокси-глицил-пролил-фенилаланил-фенилаланин-эпоксикетон, N-карбобензилокси-лейцил-лейцил-фенилаланин-эпоксикетон и N-карбобензилокси-глицил-фенилаланил-фенилаланин-эпоксикетон.
Следующие примеры и графические материалы приводятся с целью облегчить понимание данного изобретения, истинные пределы которого изложены в прилагаемой формуле изобретения. Необходимо понимать, что в изложенных процедурах могут быть сделаны изменения без отступления от сущности изобретения.
ПРИМЕРЫ
Пример 1
Были изготовлены следующие составы в жидкой, лиофилизированной форме или в жидкой форме, восстановленной из лиофилизированной:
15 мг/мл HuMab <CD20>,
0,01% (масса/объем) полисорбата 20,
20 мМ L-гистидина, а также
140 мМ хлорида натрия,
при рН 6,0;
10 мг/мл HuMab <CD20>,
0,01% (масса/объем) полисорбата 20,
20 мМ L-гистидина, а также
140 мМ хлорида натрия,
при рН 6,0;
15 мг/мл HuMab <CD20>,
20 мМ L-гистидина,
при рН 6,0;
10 мг/мл HuMab <CD20>,
0,02% (масса/объем) полисорбата 20,
20 мМ L-гистидина, а также
240 мМ трегалозы,
при рН 6,0;
25 мг/мл HuMab <CD20>,
0,02% (масса/объем) полисорбата 20,
20 мМ L-гистидина, а также
240 мМ трегалозы,
при рН 6,0.
Также изготавливают лиофилизированную форму, которая содержит после восстановления с соответствующим количеством воды для инъекций:
10 мг/мл HuMab <CD20>,
0,02% (масса/объем) полисорбата 20,
20 мМ L-гистидина,
240 мМ трегалозы,
при рН 6,0.
Этот состав демонстрирует хорошую стабильность при хранении его при температуре 2-8°С и 25°С с достаточной устойчивостью в отношении физических конечных пунктов, таких как агрегация, и химических конечных пунктов, таких как фрагментация.
Жидкие и лиофилизированные составы лекарственных продуктов для парентерального введения в соответствии с изобретением были разработаны следующим образом.
Изготовление жидких составов.
Составы HuMab <CD20> были изготовлены путем гомогенизации растворов HuMab <CD20> в буфере для продукции (например, 20 мМ гистидиновом буфере при рН примерно 6,0 или 20 мМ гистидиновом буфере при рН примерно 6,0, содержащем 140 мМ хлорида натрия и 0,01% (масса/объем)) полисорбата 20). Составы HuMab <CD20> также можно получить путем подгонки концентрации белка до нужной концентрации с помощью разбавления буфером. При необходимости добавляли эксципиенты для стабилизации белка и для подгонки тоничности, их можно добавлять в растворенной форме или альтернативно в твердом виде. При необходимости в составы добавляли поверхностно-активное вещество в виде стокового раствора. Все составы стерилизовали путем фильтрации с помощью фильтров с размером пор 0,22 мкм, асептически аликвотировали в стерильные стеклянные флаконы и закрывали резиновыми пробками и крышками Alucrimp. Эти составы хранили при разных температурах в течение различных интервалов времени и использовали для анализа во время, указанное в отдельных пунктах. Составы анализировали 1) с помощью УФ-спектрофотометрии, 2) с помощью эксклюзионной хроматографии (size exclusion chromatography, SEC), 3) на наличие видимых и невидимых частиц, 4) с помощью ионообменной хроматографии (ion exchange chromatography, IEC) и 5) на мутность раствора.
Изготовление лиофилизированных составов.
Раствор HuMab <CD20> либо готовили в соответствии с описанием выше для жидких составов, либо изготавливали как гомогенизированный раствор HuMab <CD20> из HuMab <CD20> в 20 мМ гистидиновом буфере при рН примерно 6,0, содержащем сахар и поверхностно-активное вещество. Все составы стерилизовали путем фильтрации с помощью фильтров с размером пор 0,22 мкм и асептически аликвотировали в стерильные стеклянные флаконы. Флаконы частично закрывали резиновыми пробками, подходящими для использования в процессах лиофилизации, и переносили в сушильную камеру лиофилизатора. В рамках данного изобретения используется любой способ лиофилизации, известный в данной области. Например, процесс лиофилизации, используемый для данного исследования, включает охлаждение состава с комнатной температуры до приблизительно 5°С (предварительное охлаждение), а затем замораживание при -40°С (заморозка I) с изменением температуры от примерно 1°С/мин до 5°С/мин. На первом этапе сушки может происходить увеличение температуры от -40°С до -30°С со скоростью от 0,3 до 0,5°С/мин, а затем проводится сушка при температуре -30°С в течение по меньшей мере 50 часов при давлении в камере от примерно 75 до 80 мТорр. На втором этапе сушки может происходить увеличение температуры от -30°С до 25°С со скоростью от 0,1 до 0,3°С/мин, а затем проводится сушка при температуре 25°С в течение по меньшей мере 50 часов при давлении в камере примерно от 50 до 80 мТорр (применяемый график сушки приведен в таблице 1). Признано, что составы HuMab <CD20>, которые были высушены с использованием описанных процессов лиофилизации, удобны для быстрого восстановления в течение примерно 2-3 минут. Все лиофилизированные массы в данном исследовании имели остаточное содержание воды примерно от 0,1 до 1,0% по данным исследования способом Карла Фишера. Флаконы с лиофилизатом хранили при различных температурах в течение разных интервалов времени. Лиофилизированные составы восстанавливали соответствующим объемом воды для инъекций (WFI, water for injection), а затем 1) анализировали с помощью УФ-спектрофотометрии, 2) определяли время восстановления, 3) анализировали с помощью эксклюзионной хроматографии (size exclusion chromatography, SEC), 4) с помощью ионообменной хроматографии (ion exchange chromatography, IEC), 5) определяли наличие видимых и невидимых частиц, 6) определяли мутность раствора.
Эксклюзионную хроматографию (SEC) проводили для выявления растворимых высокомолекулярных групп (агрегатов) и низкомолекулярных продуктов гидролиза в составах. Этот способ применяли с подходящим инструментом для ВЭЖХ, оснащенным УФ-детектором (длина волны обнаружения 280 нм) и колонкой Zorbax GF-250 (9,4×250 мм, Agilent); в качестве подвижной фазы использовали 200 мМ раствор фосфата натрия с рН 7,0.
Ионообменную хроматографию (IEC) проводили для выявления продуктов химической деградации, изменяющих суммарный заряд HuMab <CD20> в составах. Этот способ применяли с подходящим инструментом для ВЭЖХ, оснащенным УФ-детектором (длина волны обнаружения 220 и 280 нм) и колонкой Dionex Propac WCX-10 (4 мм × 250 мм); в качестве подвижной фазы А и В использовали соответственно 10 мМ натрий-фосфатный буфер в воде с рН 6,0 и 10 мМ натрий-фосфатный буфер с рН 6,0+0,75 NaCl, со скоростью потока 1,0 мл/мин.
Для определения концентрации белка проводили УФ-спектроскопию на спектрофотометре Varian Cary Bio при длине волны 280 нм.
Для определения мутности измеряли опалесценцию в FTU (единицы мутности) с помощью турбидиметра HACH 2100AN при комнатной температуре.
Образцы анализировали на наличие невидимых частиц с помощью HIAC Royco PharmaSpec (HRLD-150), а также видимых частиц с помощью инструмента для визуального контроля Seidenader V90-T.
Пример 2
Были изготовлены следующие составы либо в жидкой, либо в лиофилизированной форме, либо в жидкой форме, восстановленной из лиофилизированной:
25 мг/мл HuMab <CD20>,
0,02% (масса/объем) полоксамера 188™,
20 мМ L-гистидина, а также
240 мМ трегалозы
при рН 6,0;
или
25 мг/мл HuMab <CD20>,
0,01% (масса/объем) полоксамера 188™,
20 мМ L-гистидина, а также
240 мМ трегалозы
при рН 6,0;
или
25 мг/мл HuMab <CD20>,
0,1% (масса/объем) полоксамера 188™,
20 мМ L-гистидина, а также
240 мМ трегалозы
при рН 6,0;
или
25 мг/мл HuMab <CD20>,
0,02% (масса/объем) полисорбата 80,
20 мМ L-гистидина, а также
240 мМ трегалозы
при рН 6,0;
или
25 мг/мл HuMab <CD20>,
0,1% (масса/объем) полисорбата 80,
20 мМ ацетата, а также
240 мМ трегалозы
при рН 5,5;
или
25 мг/мл HuMab <CD20>,
0,1% (масса/объем) полисорбата 80,
20 мМ ацетата, а также
140 мМ хлорида натрия
при рН 5,5;
или
30 мг/мл HuMab <CD20>,
0,01% (масса/объем) полоксамера 188™,
20 мМ L-гистидина, а также
200 мМ трегалозы
при рН 6,5.
Жидкие и лиофилизированные составы лекарственного препарата для парентерального введения готовили следующим образом.
Изготовление жидких составов.
Составы HuMab <CD20> изготавливали путем гомогенизации растворов HuMab <CD20> в буфере для продукции (например, 20 мМ гистидиновом буфере при рН примерно 6,0, содержащем 240 мМ трегалозы и 0,02% ((масса/объем)) полоксамера 188™). Составы HuMab <CD20> также можно получить путем диафильтрации 10-40 мг/мл растворов HuMab <CD20> в буфере для продукции (например, 20 мМ гистидиновом буфере при рН примерно 6,0) путем тангенциально-поточной фильтрации (TFF, tangential flow filtration) для повышения концентрации белка выше целевой концентрации белка и для замены буфера. Составы HuMab <CD20> также можно получить путем подгонки концентрации белка до нужной концентрации с помощью разбавления буфером. Для стабилизации белка и для подгонки тоничности добавляли эксципиенты в растворенной форме или альтернативно в твердом виде. При необходимости в составы добавляли поверхностно-активное вещество в виде стокового раствора. Все составы стерилизовали путем фильтрации с помощью фильтров с размером пор 0,22 мкм, асептически аликвотировали в стерильные стеклянные флаконы и закрывали резиновыми пробками и крышками Alucrimp. Эти составы хранили при разных температурах в течение различных интервалов времени и использовали для анализа во время, указанное в отдельных пунктах. Составы анализировали 1) с помощью УФ-спектрофотометрии, 2) с помощью эксклюзионной хроматографии (size exclusion chromatography, SEC), 3) на наличие видимых и невидимых частиц,
4) с помощью ионообменной хроматографии (ion exchange chromatography, IEC) и
5) на мутность раствора.
Изготовление лиофилизированных составов.
Растворы HuMab <CD20> готовили в соответствии с описанием выше для жидких составов. Все составы стерилизовали путем фильтрации с помощью фильтров с размером пор 0,22 мкм и асептически аликвотировали в стерильные стеклянные флаконы. Флаконы частично закрывали резиновыми пробками, подходящими для использования в процессах лиофилизации, и переносили в сушильную камеру лиофилизатора. В рамках данного изобретения используется любой способ лиофилизации, известный в данной области. Например, процесс лиофилизации, используемый для данного исследования, включает охлаждение состава с комнатной температуры до приблизительно 5°С (предварительное охлаждение), а затем замораживание при -40°С (заморозка I) с изменением температуры от примерно 1°С/мин до 5°С/мин. На первом этапе сушки может происходить увеличение температуры от -40°С до -30°С со скоростью от 0,3 до 0,5°С/мин, а затем проводится сушка при температуре -30°С в течение по меньшей мере 50 часов при давлении в камере примерно от 75 до 80 мТорр. На втором этапе сушки может происходить увеличение температуры от -30°С до 25°С со скоростью от 0,1 до 0,3°С/мин, а затем проводится сушка при температуре 25°С в течение по меньшей мере 50 часов при давлении в камере примерно от 50 до 80 мТорр (применяемый график сушки приведен в таблице 1). В составах HuMab <CD20>, которые были высушены с использованием описанных процессов лиофилизации, было выявлено остаточное содержание воды примерно от 0,1 до 1,0% по данным исследования способом Карла Фишера. Флаконы с лиофилизатом хранили при различных температурах в течение разных интервалов времени. Лиофилизированные составы восстанавливали соответствующим объемом воды для инъекций (WFI, water for injection), а затем 1) анализировали с помощью УФ-спектрофотометрии, 2) анализировали с помощью эксклюзионной хроматографии (size exclusion chromatography, SEC), 3) с помощью ионообменной хроматографии (ion exchange chromatography, IEC), 4) определяли наличие видимых и невидимых частиц, 5) определяли мутность раствора.
Эксклюзионную хроматографию (SEC) проводили для выявления растворимых высокомолекулярных групп (агрегатов) и низкомолекулярных продуктов гидролиза в составах. Этот способ применяли с подходящим инструментом для ВЭЖХ, оснащенным УФ-детектором (длина волны обнаружения 280 нм) и колонкой Zorbax GF-250 (9,4×250 мм, Agilent) или TSKgel G3000 SWXL (7,8×300 мм); в качестве подвижной фазы использовали 200 мМ раствор фосфата натрия с рН 7,0 или 250 мМ раствор хлорида калия в 200 мМ растворе фосфата калия с рН 7,0.
Ионообменную хроматографию (IEC) проводили для выявления продуктов химических деградаций, изменяющих суммарный заряд HuMab <CD20> в составах. Этот способ применяли с подходящим инструментом для ВЭЖХ, оснащенным УФ-детектором (длина волны обнаружения 220 и 280 нм) и колонкой Dionex Propac WCX-10 (4×250 мм). В качестве подвижной фазы А и В использовали соответственно 10 мМ натрий-фосфатный буфер в воде с рН 6,0 и 10 мМ натрий-фосфатный буфер с рН 6,0+0,75 NaCl, со скоростью потока 1,0 мл/мин.
Для определения концентрации белка проводили УФ-спектроскопию на спектрофотометре Varian Cary Bio или Perkin Elmer при длине волны 280 нм.
Для определения мутности измеряли опалесценцию в FTU (единицы мутности) с помощью турбидиметра HACH 2100AN при комнатной температуре.
Образцы анализировали на наличие невидимых частиц с помощью HIAC Royco PharmaSpec (HRLD-150), а также видимых частиц с помощью инструмента для визуального контроля Seidenader V90-T.
Группа изобретений относится к медицине, в частности к составам, содержащим человеческое анти-СD20 моноклональное антитело, поверхностно-активное вещество: полисорбат или полоксамер, трегалозу, гистидиновый буфер, к способам его изготовления и применения. Группа изобретний обеспечивает составы для парэнтерального введения с хорошей стабильностью при хранении при температуре 2-8° и 25°С с достаточной устойчивостью в отношении физических факторов, таких как агрегация, и химических, таких как фрагментация. 3 н. и 2 з.п. ф-лы, 2 табл., 2 пр.
1. Состав в лиофилизированной форме, содержащий:
10 мг/мл HuMab<CD20>,
0,02% (мас./об.) полисорбата 20,
20 мМ L-гистидина, а также
240 мМ трегалозы
при рН 6,0.
2. Состав, содержащий:
25 мг/мл HuMab<CD20>,
0,02% (мас./об.) полоксамера 188™,
20 мМ L-гистидина, а также
240 мМ трегалозы
при рН 6,0;
или
25 мг/мл HuMab<CD20>,
0,01% (мас./об.) полоксамера 188™,
20 мМ L-гистидина, а также
240 мМ трегалозы
при рН 6,0;
или
25 мг/мл HuMab<CD20>,
0,1% (мас./об.) полоксамера 188™,
20 мМ L-гистидина, а также
240 мМ трегалозы
при рН 6,0;
или
25 мг/мл HuMab<CD20>,
0,02% (мас./об.) полисорбата 80,
20 мМ L-гистидина, а также
240 мМ трегалозы при рН 6,0;
или
30 мг/мл HuMab<CD20>,
0,01% (мас./об.) полоксамера 188™,
20 мМ L-гистидина, а также
200 мМ трегалозы при рН 6,5.
3. Состав по п.2, где он находится в жидкой форме и содержит:
25 мг/мл HuMab<CD20>,
0,02% (мас./об.) полоксамера 188™,
20 мМ L-гистидина, а также
240 мМ трегалозы
при рН 6,0.
4. Применение состава по любому из пп.1-3 для изготовления медикамента, используемого для лечения СD20-ассоциированных заболеваний.
5. Применение по п.4, где болезнь выбрана из группы, состоящей из В-клеточной неходжкинской лимфомы (NHL), лимфомы клеток мантии (MCL), острого лимфолейкоза (ALL), хронического лимфолейкоза (CLL), В-клеточной диффузной крупноклеточной лимфомы (DLCL), лимфомы Беркитта, волосатоклеточной лейкемии, фолликулярной лимфомы, множественной миеломы, лимфомы маргинальной зоны, посттрансплантационного лимфопролиферативного расстройства (PTLD), ВИЧ-ассоциированной лимфомы, макроглобулинемии Вальденстрема или первичной лимфомы ЦНС.
| WO 2005044859 А2, 19.05.2005 | |||
| Турбодетандер | 1981 |
|
SU985641A1 |
| СТАБИЛЬНАЯ ИЗОТОНИЧЕСКАЯ ЛИОФИЛИЗИРОВАННАЯ ПРОТЕИНОВАЯ КОМПОЗИЦИЯ | 1996 |
|
RU2229288C2 |
| US 6991790 В1, 31.01.2006 | |||
| ЕР 999853 В1, 02.01.2003. | |||
