КОМБИНИРОВАННАЯ ТЕРАПИЯ АНТИТЕЛАМИ АНТИ-CD20 ТИПА II В СОЧЕТАНИИ С ИНГИБИТОРОМ ПРОТЕАСОМ Российский патент 2014 года по МПК A61K31/00 A61K39/395 A61K39/00 

Настоящее изобретение относится к применению антител анти-CD20 типа II для получения лекарственного средства, предназначенного для лечения рака, прежде всего опухолей, экспрессирующих CD20, в комбинации с ингибитором протеасом.

Предпосылки создания изобретения

Белок CD20 (так называемый дифференцировочный антиген созревания В-лимфоцитов или Вр35) представляет собой гидрофобный трансмембранный белок с мол. массой приблизительно 35 кДа, локализованный в предшественниках В-клеток и в зрелых В лимфоцитах (Valentine M.A. и др., J. Biol. Chem., 264 (19), 11282-11287 (1989) и Einfield D.A. и др., ЕМВО J. 7(3), 711-717 (1988)). CD20 найден на поверхности более 90% В-клеток периферической крови или лимфоидных органов, экспрессируется на ранней стадии развития предшественников В-клеток и сохраняется до дифференцировки плазматических клеток. CD20 присутствует в нормальных В-клетках, а также в злокачественных В-клетках. CD20 прежде всего экспрессируется в более 90% В-клеток лимфомы не-Ходжкина (НХЛ) (Anderson K.C. и др., Blood, 63 (6), 1424-1433 (1984)), но не обнаружен на кроветворных стволовых клетках, про-В-клетках, нормальных плазматических клетках или на других нормальных тканях (Tedder T.F. и др., J, Immunol., 135 (2), 973- 979 (1985)).

С-концевой фрагмент (содержащий 85 аминокислотных остатков) белка CD20 локализован в цитоплазме. Длина такого участка существенно отличается от размеров цитоплазматического участка других поверхностных белков В-клеток, таких как тяжелые цепи IgM, IgD и IgG или α- или β-цепей антигенов гистосовместимости класса II, которые характеризуются относительно короткими цитоплазматическими фрагментами, содержащими 3, 3, 28, 15 и 16 аминокислотных остатков, соответственно (Komaromy M. и др., NAR, 11, 6775-6785 (1983)). В С-концевом фрагменте 21 из 61 аминокислотных остатков являются кислотными и только 2 основными, т.е. указанная область обладает суммарным высоким отрицательным зарядом (The GenBank рег. №NP-690605). Принято считать, что CD20 может принимать участие в регуляции ранней стадии (стадий) процесса активации и дифференцировки В-клеток (Tedder и др., Eur; J. Immunol., 25, 16, 881-887 (1986)) и может функционировать как кальциевый канал (Tedder T.F. и др., J. Cell. Biochem., 14D, 195 (1990)).

Существуют два различных типа антител анти-CD20, которые существенно отличаются по способу связывания с CD20 и по биологической активности (Cragg M.S. и др., Blood, 103, 2738-2743 (2004) и Cragg M.S. и др., Blood, 101, 1045-1052 (2003)). Антитела типа I, ритуксимаб, обладают цитотоксичностью, опосредованной комплементом, в то время как антитела типа II, тоситумомаб (B1), 11B8 и АТ80 или гуманизированные антитела В-Ly1, эффективно инициируют гибель клеток-мишеней за счет каспаза-независимого апоптоза с одновременным воздействием фосфатидилсерина.

Сводка общих свойств антител анти-CD20 типа I и типа II приводятся в Таблице 1.

Таблица 1 Свойства антител анти-CD20 типа I и типа II антитела анти-CD20 типа I антитела анти-CD20 типа II Эпитоп CD20 типа I Эпитоп CD20 типа II CD20 локализованы в липидном слое CD20 не локализованы в липидном слое Повышенная КЗЦ (если присутствует изотип IgG1) АЗКОЦ (если присутствует изотип IgG1) Повышенная КЗЦ (если присутствует изотип IgG1) АЗКОЦ (если присутствует изотип IgG1) Полная емкость связывания Пониженная емкость связывания Гомотипическая агрегация Повышенная гомотипическая агрегация Индукция апоптоза после связывания Индукция быстрой гибели клеток при отсутствии связывания

Протеасома 26S, которая также относится к мультикаталитическому комплексу протеиназ, является необычно высокомолекулярным комплексом (26S), который найден в цитоплазме и ядре многих типов эукариотических клеток. Протеасома включает центральное каталитическое ядро (20S) и два регуляторных кэпа (19S). Регуляторные кэпы (19S) присутствуют на каждом конце бочкообразного комплекса (20S) и регулируют поступление субстратов в центральное каталитическое ядро. Кэпы 19S выполняют функцию узнавания субстратов, меченных молекулами полипептида убиквитина (8,5 кДа) и предназначенных для деградации (см., например, обзор Coux О., Tanaka К, и Goldberg A., Ann. Rev. Biochem., 65, 801-847 (1996), Voges D., Annu. Rev. Biochem., 68, (1999) 1015-1068 (1999) и Киселев А.Л. и др., Chem. Biol., 8 (8), 739-758 (2001)). После отделения от субстрата молекул убиквитина кэп 19S стимулирует денатурацию белка-субстрата для его введения в центральное каталитическое ядро.

Протеасома 26S высококонсервативна эволюционно, присутствует во всех известных эукариотических клетках и может составлять до 1,0% общего белка гомогенатов ткани. Протасома присутствует в цитоплазме и ядре клетки, что свидетельствует о ее функциональной роли в указанных отделах клетки (Tanaka К. и др., J. Cell Physiol., 139, 34-41 (1989), Amsterdam А. и др., Proc. Nail. Acad. Sci. USA. 90, 99-103 (1993)).

В предшествующих исследованиях в протеасоме установлена локализация пяти различных протеолитически активных участков, каждый из которых ассоциируется с определенным компонентом комплекса (Wilk S. и Орловский М., J. Neurochem., 35 1172-1182 (1980), Wilk S. и Орловский М., J. Newochem., 40, 842-849 (1983), Орловский М. и Wilk S., Biochem. Biophys. Res. Comm., 101, 814-822 (1981)). Три основных протеазы по специфичности подобны химотрипсину, пепсину и пептидилглутамилпептидазе. Две другие пептидазы предпочтительно расщепляют пептидные связи, образованные карбоксильной группой аминокислот с разветвленной боковой цепью и аминогруппой нейтральных аминокислот с короткой боковой цепью (Орловский М., Biochemistry, 29, 10289-297 (1990)).

В настоящее время установлено, что протеасома является главной экстрализосомной протеолитической системой, принимающей участие в протеолитических путях, существенных для выполнения разнообразных функций клетки, таких как деление клеток, процессинг антигена и деградация коротко-живущих регуляторных белков, таких как онкобелки, факторы транскрипции и циклины (Ciechanover A., Cell, 79, 13-21 (1994), Palombell V.J., Rando O.J., Goldberg A.L. и Maniatis Т., Cell, 78, 773-785 (1994)). Поскольку протеасома играет ключевую роль в упорядоченной деградации циклинов в процессе клеточного цикла, она принимает участие в делении клеток. В дополнительных исследования было установлено, что нарушение любого из 12 из 13 генов, кодирующих субъединицы протеасомы дрожжей, приводит к остановке клеточной пролиферации или к неспособности осуществлять деградацию белков, что также свидетельствует о важной роли протеасомы в клеточном росте (Fujiwara Т. и др., J. Biol. Chem., 265, 16604-1613 (1990), Beynon, Int. Committee on Proteolysis News Letter (1994, 1-2, январь)). Следовательно, ингибирование протеасомы можно использовать для лечения заболеваний, вызванных аномальным делением клеток, таких как опухолевые заболевания.

Тот факт, что убиквитин-опосредованный протеасомный протеолиз играет решающую роль в активации NFkB, можно использовать в медицине благодаря применению ингибиторов протеасомы. Для образования активной формы NFkB необходим протеасома-опосредованный протеолиз р105, неактивных предшественников NFkB.

Кроме того, процессированная форма NFkB (р65/р50) сохраняется в цитозоле в качестве неактивного комплекса, связанного с ингибирующим белком IkB. NFkB активируется различными факторами благодаря стимулированию сигнального пути, который приводит к протеасома-опосредованной деградации IkB. Аномальная активация NFkB за счет стимуляции синтеза цитокинов наблюдалась во множестве воспалительных и инфекционных заболеваний. Активация NFkB также является существенным фактором в процессах ангиогенеза и экспрессии факторов адгезии, следовательно, ингибиторы протеасомы можно также использовать при лечении заболеваний, ассоциированных с сосудистой системой.

Известны различные ингибиторы протеасомы, описанные, например, в литературе, такой как Киселев А.Л. и др., Chem. Biol., 8 (8), 739-758 (2001), WO 2004/004749 и Joazeiro С. и др. Раk Res., 66 (16), 7840-7842 (2006), которые все обладают свойством ингибировать активность протеасомы 26S. Такими ингибиторами протеасомы являются, например, производные пептидов, такие как альдегиды пептидов (например, MG132, MG115, СЕР-1615 или PSI), боронаты пептидов (например, бортезомиб (PS-341) или DFLB), эпоксикетоны пептидов (например, эпоксомицин, дигидроэпонемицин или производное эпоксомицина PR-171), или пептидные винилсульфоны (например, NLVS) и непептидные соединения, такие как салиноспорамид A (NPI-0052), производные салиноспорамида А, лактацистин или производные лактацистина (например, кластолактацистин-L-лактон (омуралид) или PS-519) (см. Киселев А.Л. и др., Chem. Biol., 8 (8), 739-758 (2001), WO 2004/004749 и Joazeiro С. и др., Раr Res., 66 (16), 7840-7842 (2006)).

В статье Smolewski P. и др. (Leukemia Research, 30, 1521-1529 (2006)) описано дополнительное цитотоксичное действие in vitro бортезомиба и ритуксимаба, антител анти-CD20 типа I. В статье Wang M. и др. (Leukemia, 22, 179-185 (2008)) описано действие тройной комбинации бортезомиба, ритуксимаба и циклофосфамида in vitro на модели ксенотрансплантата одной клетки лимфомы коры головного мозга.

Краткое изложение сущности изобретения

Изобретение включает применение антител анти-CD20 типа II для получения лекарственного средства, предназначенного для лечения рака, экспрессирующего CD20, в комбинации с ингибитором протеасомы.

Изобретение также включает применение антител анти-CD20 типа II для получения лекарственного средства, предназначенного для лечения пациента, страдающего от рака, экспрессирующего CD20, в комбинации с ингибитором протеасомы.

Предпочтительно указанный ингибитор протеасомы характеризуется величиной IC₅₀ 5 мкМ или менее.

Предпочтительно указанные антитела анти-CD20 типа II характеризуются соотношением связывающих активностей с CD20 на клетках Raji (ATCC, №CCL-86) по сравнению с ритуксимабом от 0,3 до 0,6, более предпочтительно от 0,35 до 0,55 и наиболее предпочтительно от 0,4 до 0,5.

Предпочтительно указанные антитела анти-CD20 типа II являются гуманизированными антителами B-Ly1.

Предпочтительно указанные антитела анти-CD20 типа II обладают повышенной антитело-зависимой клеточно-опосредованной цитотоксичностью (АЗКОЦ).

Предпочтительно указанный ингибитор протеасомы выбирают из группы, включающей альдегиды пептидов, боронаты пептидов, эпоксикетоны пептидов или салиноспорамид А.

Подробное описание изобретения

Термин "антитела" обозначает различные формы антител, включающих, но не ограничиваясь только ими, полноразмерные антитела, антитела человека, гуманизированные антитела и генно-инженерные антитела, такие как моноклональные антитела, химерные антитела или рекомбинантные антитела, а также фрагменты таких антител при условии сохранения их характерных свойств по изобретению.

Термины "моноклональные антитела" или "композиция моноклональных антител", используемые в описании заявки, относятся к получению молекул антител одного аминокислотного состава. Соответственно, термин "моноклональные антитела человека" относится к моноспецифичным антителам, содержащим вариабельные и константные области иммуноглобулинов линии зародышевых клеток человека. В одном варианте моноклональные антитела человека получают с использованием гибридомы, которая включает В-клетки, полученные от трансгенного животного (исключая человека), например трансгенной мыши, в геноме которой содержится трансген тяжелой цепи иммуноглобулина человека и трансген легкой цепи иммуноглобулина человека, включенные в иммортализованные клетки.

Предпочтительно указанные антитела анти-CD20 типа II являются моноклональными антителами.

Термин "химерные антитела" обозначает моноклональные антитела, включающие вариабельную область, т.е. связывающий участок, от одного источника или вида и по меньшей мере часть константной области от другого источника или вида, обычно полученные методом рекомбинантных ДНК. Более предпочтительны химерные антитела, включающие вариабельную область мыши и константную область человека. Такие химерные антитела человека/мыши являются продуктом экспрессированных генов иммуноглобулинов, содержащих сегменты ДНК, кодирующие вариабельные области иммуноглобулина мыши и сегменты ДНК, кодирующие константные области иммуноглобулина человека. Другими формами "химерных антител" по настоящему изобретению являются такие антитела, класс или подкласс которых модифицирован или изменен по сравнению с исходными антителами. Такие "химерные" антитела обозначаются также как "переключенные по классу антитела". Способы получения химерных антител включают метод рекомбинантных ДНК и методы генной трансфекции, известные в данной области техники. См., например, Morrison S.L. и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 6851-6855 (1984), US 5202238 и US 5204244.

Термин "гуманизированные антитела" обозначает антитела, в которых каркасный участок или "участки комплементарности" (CDR) модифицированы для включения CDR иммуноглобулина другой специфичности по сравнению с исходным иммуноглобулином. В предпочтительном варианте CDR мыши прививают в каркасный участок антител человека для получения "гуманизированных антител". См., например, Riechmann L. и др., Nature, 332, 323-327 (1988) и Neuberger M.S. и др., Nature, 314, 268-270 (1985)). Более предпочтительные CDR представляют собой аминокислотные последовательности, узнающие антигены, указанные выше для химерных и бифункциональных антител.

Термин "антитела человека", используемый в описании заявки, включает антитела, содержащие вариабельную и константную области иммуноглобулина линии зародышевых клеток человека. Антитела человека известны в данной области техники (van Dijk M.A. и van de Winkel J.G., Curr. Opin. in Chemical Biology, 5, 368-374 (2001)). С использованием такой технологии получают антитела человека специфичные в отношении множества мишеней. Примеры антител человека, описаны, например, в статье Kellermann S.A., и др., Curr. Opin. Biotechnol., 13, 593-597 (2002).

Термин "рекомбинантные антитела человека", используемый в описании заявки, обозначает все антитела человека, которые получают, экспрессируют, конструируют или выделяют методами рекомбинантной ДНК, такие как антитела, выделенные из клеток хозяина, таких как клетки NSO или СНО, или из животного (например, мыши), которое является трансгенным для генов иммуноглобулина человека, или антитела, экспрессированные с использованием рекомбинантного вектора экспрессии, трансфектированного в клетку хозяина. Такие рекомбинантные антитела человека содержат константные области, полученные из иммуноглобулина линии зародышевых клеток человека в перегруппированной форме. Рекомбинантные антитела человека по изобретению подвергались in vivo соматической гипермутации. Таким образом, аминокислотные последовательности областей VH и VL рекомбинантных антител являются такими последовательностями, которые, хотя они получены из последовательностей VH и VL линии зародышевых клеток человека, не содержатся в нативном мотиве линии зародышевых клеток человека in vivo.

Термин "специфичное связывание" или "специфично связывается", используемый в описании заявки, обозначает специфичное связывание антител с антигеном CD20. Предпочтительно аффинность связывания характеризуется величиной K_D 10^-8 мол./л или менее, предпочтительно 10^-9 мол./л или менее (например, 10^-10 мол./л), более предпочтительно величиной K_D 10^-10 моль./л или менее (например, 10^-12 мол./л). Аффинность связывания определяют стандартным анализом связывания, таким как анализ графика Скатчарда (например, Biacore®) на клетках, экспрессирующих CD20.

Термин "молекула нуклеиновой кислоты", используемый в описании заявки, обозначает молекулы ДНК и молекулы РНК. Молекула нуклеиновой кислоты является одноцепочечной или двухцепочечной, предпочтительно двухцепочечной ДНК.

Термин "константные домены" не имеет прямого отношения к связыванию антител с антигеном, а относится к эффекторным функциям (АЗКОЦ, связывание комплемента и КЗЦ).

Термин "вариабельная область" (вариабельная область легкой цепи (VL), вариабельная область тяжелой цепи (VH)), используемый в описании заявки, обозначает каждую легкую и тяжелую цепь, которая принимает непосредственное участие в связывании антител с антигеном. Домены вариабельной легкой цепи и тяжелой цепи человека характеризуются одинаковой общей структурой, и каждый домен включает четыре каркасных участка (FR), последовательности которых являются строго консервативными, соединенные тремя "гипервариабельными областями" (или участками комплементарности, CDR). Каркасные участки образуют конформацию β-складчатого листа, а участки CDR образуют петли, связывающие β-складчатую структуру. В каждой цепи CDR сохраняют свою трехмерную структуру благодаря каркасным участкам и вместе с CDR другой цепи образуют антиген-связывающий участок. Участки CDR3 тяжелой и легкой цепи играют главную роль в специфичности связывания антитела по изобретению и, следовательно, представляют собой еще один объект изобретения.

Термины "гипервариабельная область" или "антиген-связывающий участок антител", используемый в описании заявки, обозначают аминокислотные остатки, которые отвечают за связывание с антигеном. Гипервариабельная область включает аминокислотные остатки из "участков комплементарности" (участков CDR). "Каркасные участки" или "FR" представляют собой такие области вариабельного домена, которые не относятся к указанным гипервариабельным участкам. Следовательно, легкая и тяжелая цепи антител включают (в направлении от N- до С-концевого фрагмента) домены FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 и FR4. Наиболее важным фрагментом тяжелой цепи является CDR3, который вносит основной вклад в связывание с антигеном. Области CDR и FR определяют, как описано в работе Kabat E.A. и др., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5 изд., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991), и/или по их остаткам, включенным в состав "гипервариабельной петли".

Термины "CD20" и "антиген CD20" используются взаимозаменяемым образом и обозначают любые варианты, изоформы и видовые гомологи CD20 человека, который обычно экспрессируется клетками или на клетках, трансфектированных геном CD20. Связывание антител по изобретению с антигеном CD20 опосредует гибель клеток, экспрессирующих CD20 (например, опухолевых клеток), за счет инактивациии CD20. Гибель клеток, экспрессирующих CD20, может происходить по одному или более следующих механизмов: индукции апоптоза, АЗКОЦ и/или КЗЦ.

Синонимами CD20, известными в данной области техники, являются антиген CD20 В-лимфоцитов, поверхностный антиген В1 В-лимфоцитов, Leu-16, Bp35, BM5 и LF5.

Термин "антитела анти-CD20" по изобретению обозначает антитела, которые специфично связываются с антигеном CD20. В зависимости от связывающих свойств и биологической активности антитела анти-CD20 подразделяются на два типа, тип I и тип II (см. Cragg M.S. и др., Blood, 103, 2738-2743 (2004) и Cragg M.S. и др.. Blood, 101, 1045-1052 (2003)), как указано в таблице 2.

Таблица 2 Свойства антител анти-CD20 типа I и типа II антитела анти-CD20 типа I антитела анти-CD20 типа II Эпитоп CD20 типа I Эпитоп CD20 типа II CD20 локализованы в липидном слое CD20 не локализованы в липидном слое Повышенная КЗЦ (если присутствует изотип IgG1) АЗКОЦ (если присутствует изотип IgG1) Повышенная КЗЦ (если присутствует изотип IgG1) АЗКОЦ (если присутствует изотип IgG1) Полная емкость связывания Пониженная емкость связывания Гомотипическая агрегация Повышенная гомотипическая агрегация Индукция апоптоза после связывания Индукция быстрой гибели клеток при отсутствии связывания

Одним из важнейших свойств антител анти-CD20 типа I и типа II является способ связывания. Таким образом, антитела анти-CD20 типа I и типа II классифицируются по соотношению связывающих активностей указанных антител и ритуксимаба в отношении CD20 на клетках Raji (АТСС, №CCL-86).

Соотношение связывающих активностей антител анти-CD20 типа II и ритуксимаба в отношении CD20 на клетках Raji (АТСС, №CCL-86) составляет от 0,3 до 0,6, предпочтительно от 0,35 до 0,55, более предпочтительно от 0,4 до 0,5. Примерами таких антител анти-CD20 типа II являются, например, тоситумомаб (B1 IgG2a), гуманизированные антитела B-Ly1 IgG1 (химерные гуманизированные антитела IgG1, описанные в WO 2005/044859), 11В8 IgG1 (описанные в WO 2004/035607) и АТ80 IgG1. Предпочтительно указанные антитела анти-CD20 типа II являются моноклональными антителами, которые связываются с тем же эпитопом, что и гуманизированные антитела B-Ly1 (описанные в WO 2005/044859).

В отличие от анти-CD20 типа II соотношение связывающих активностей антител анти-CD20 типа I и ритуксимаба в отношении CD20 на клетках Raji (АТСС, №CCL-86) составляет от 0,8 до 1,2, предпочтительно от 0,9 до 1,1. Примерами таких антител анти-CD20 типа I являются, например, ритуксимаб, 1F5 IgG2a (ЕСАСС, гибридома. Press O.W. и др., Blood, 69/2, 584-591 (1987)), HI47 IgG3 (ЕСАСС, гибридома), 2С6 IgG1 (описанные в WO 2005/103081), 2F2 IgG1 (описанные в WO 2004/035607 и WO 2005/103081) и 2Н7 IgG1 (описанные в WO 2004/056312).

«Соотношение связывающих активностей антител анти-CD20 и ритуксимаба в отношении CD20 на клетках Raji (АТСС, №CCL-86)" определяют прямым измерением иммунофлуоресценции (измеряется средняя интенсивность флуоресценции (СИФ)) с использованием указанных антител анти-CD20, конъюгированных с Cy5, и ритуксимаба, конъюгированного с Cy5, на клеточном сортере FACS (фирма Becton Dickinson) с использованием клеток Raji (АТСС, №CCL-86), как описано в Примере 2, и рассчитывают по следующей формуле:

Соотношение связывающих активностей в отношении CD20 на клетках Raji (АТСС. №CCL-86) =

$$\frac{СИФ(Cy5/антителаанти-CD20)}{СИФ(Cy5/ритуксимаб)}\times \frac{доляCy5(Cy5/ритуксимаб)}{доляCy5(Cy5/антителаанти-CD20)}$$

СИФ обозначает среднюю интенсивность флуоресценции. Термин "доля Cy5 в конъюгате" обозначает число молекул метки Cy5-в расчете на молекулу антитела.

Обычно соотношение связывающих емкостей антител анти-CD20 типа II и ритуксимаба в отношении CD20 на клетках Raji (ATCC, №CCL-86) составляет от 0,3 до 0,6, предпочтительно от 0,35 до 0,55, более предпочтительно от 0,4 до 0,5.

В предпочтительном варианте указанные антитела анти-CD20 типа II, предпочтительно гуманизированные антитела В-Ly1, обладают повышенной антитело-зависимой клеточно-опосредованной цитотоксичностью (АЗКОЦ).

Термин "антитела, обладающие повышенной антитело-зависимой клеточно-опосредованной цитотоксичностью (АЗКОЦ)" обозначает антитела, описанные выше, обладающие повышенной АЗКОЦ, которую определяют способом, известным специалисту в данной области. Например, известным способом анализа АЗКОЦ является следующий:

1) анализ проводят с использованием клеток-мишеней, которые, как известно, экспрессируют антиген, узнаваемый антиген-связывающей областью антител,

2) анализ проводят с использованием в качестве эффекторных клеток одноядерных клеток периферической крови человека (ОКПК), выделенных из крови произвольно выбранного здорового донора,

3) анализ проводят в соответствии со следующим протоколом:

3.1) ОКПК выделяют с использованием обычного центрифугирования в градиенте плотности и осадок суспендируют в культуральной среде RPMI с плотностью 5×10⁶ клеток/мл,

3.2) клетки-мишени выращивают стандартными методами культуры тканей, собирают на экспоненциальной фазе роста с выживаемостью более 90%, промывают культуральной средой RPMI, вводят метку в виде 100 мкКи ^5lCr^-, дважды промывают культуральной средой и ресуспендируют в культуральной среде с плотностью 10⁵ клеток/мл,

3.3) 100 мкл конечной суспензии клеток-мишеней переносят в лунки 96-луночного планшета для микротитрования,

3.4) раствор антител серийно разбавляют культуральной средой (от 4000 нг/мл до 0,04 нг/мл) и полученные растворы добавляют (по 50 мкл) в лунки 96-луночного планшета, содержащие клетки-мишени, анализ проводят при различных концентрациях антител в указанном выше интервале при тройном повторе,

3.5) для контролей с максимальным высвобождением (МР) в 3 дополнительные лунки в планшете, содержащем меченые клетки-мишени, вместо раствора антител (как указано в п.3.4) добавляют по 50 мкл 2% водного раствора неионного детергента (VN, Nonidet, фирма Sigma, St. Louis),

3.6) для контролей с произвольным высвобождением (ПР) в 3 дополнительные лунки в планшете, содержащем меченые клетки-мишени, вместо раствора антител (как указано в п.3.4) добавляют по 50 мкл культуральной среды RPMI,

3.7) затем 96-луночный планшет центрифугируют при 50 g в течение 1 мин и инкубируют в течение 1 ч при 4°С,

3.8) в каждую лунку добавляют по 50 мкл суспензии ОКПК (см. п.3.1, выше) до соотношения клетки- эффекторы/клетки-мишени 25:1 и планшеты инкубируют в инкубаторе в атмосфере 5% СО₂ при 37°С в течение 4 ч,

3.9) из каждой лунки отбирают супернатант и измеряют экспериментальную радиоактивность (ЭР) с использованием γ-счетчика,

3.10) для каждой концентрации антител рассчитывают процент специфичного лизиса по формуле (ЭР-МР)/(МР-ПР)×100, где ЭР обозначает среднее значение измеренной радиоактивности (см. п.3.9) для данной концентрации антител, МР обозначает среднюю радиоактивность (см. п.3.9) в МР контроле (см. п.3.5), а ПР обозначает среднюю радиоактивность (см. п.3.9) в ПР контроле (см. п.3.6),

4) "повышенный уровень АЗКОЦ" определяют по повышению максимума (%) специфичного лизиса, наблюдаемого в интервале указанных концентраций антител и/или по понижению концентрации антител, необходимой для снижения вдвое максимума (%) специфичного лизиса, наблюдаемого в интервале указанных концентраций антител. Превышение АЗКОЦ по сравнению с цитотоксичностью, измеренной в указанном выше анализе, опосредуется указанными антителами, которые продуцируются теми же клетками хозяина (при использовании стандартных методов очистки, получения и хранения антител, известных специалисту в данной области), но которые не продуцируются клетками хозяина, сконструированными для гиперэкспрессии GnTIII.

Указанную "повышенную АЗКОЦ" получают гликоинженерией указанных антител, которая обозначает усиление указанных природных опосредованных клетками эффекторных функций моноклональных антител за счет инженерии их олигосахаридного компонента, описанной в статье Umana P. и др., Nature Biotechnol., 17, 176-180 (1999) и US 6602684.

Термин "комплемент-зависимая цитотоксичность (КЗЦ)" обозначает лизис клеток-мишеней опухоли человека антителами по изобретению в присутствии комплемента. Предпочтительно КЗЦ измеряют при обработке клеток, экспрессирующих CD20, антителами анти-CD20 по изобретению в присутствии комплемента. КЗЦ наблюдается в том случае, если при концентрации 100 нМ антитела индуцируют лизис 20% или более опухолевых клеток через 4 ч. Предпочтительно анализ проводят с использованием опухолевых клеток, меченных ⁵¹Cr или Eu, и измеряют высвобождаемый ⁵¹Cr или Eu. Контроль включает инкубацию опухолевых клеток-мишеней в присутствии комплемента, но в отсутствие антител.

Обычно антитела анти-CD20 типа II изотипа IgG1 обладают характерной КЗЦ. Антитела анти-CD20 типа II (изотипа IgG1) обладают пониженной КЗЦ по сравнению с антителами типа I. Предпочтительно антитела анти-CD20 типа II являются изотипами IgG1.

Антитела "ритуксимаб" (контрольные антитела, например анти-CD20 типа I) представляют собой генетически модифицированные химерные моноклональные антитела γ1 человека, содержащие константный домен антител мыши, специфичные в отношении антигена CD20 человека. Указанные химерные антитела содержат константные домены γ1 человека и обозначаются "С2 В8" (US 5736137, Andersen, и др., зарегистрированном 17 апреля 1998 г. Фармацевтическая корпорация IDEC). Ритуксимаб предназначен для лечения пациентов с рецидивирующей или повторной вялотекущей или фолликулярной, CD20-позитивной В-клеточной лимфомы не-Ходжкина. При исследовании механизма действия in vitro установлено, что ритуксимаб проявляет комплемент-зависимую цитоксичность (КЗЦ) (Reiff M.E. и др., Blood, 83 (2), 435-445 (1994)). Кроме того, препарат проявляет высокую активность при измерении антитело-зависимой клеточно-опосредованной цитотоксичности (АЗКОЦ).

Термин "гуманизированные антитела В-Ly1" обозначает гуманизированные антитела В-Ly1, описанные в WO 2005/044859 и WO 2007/031875, которые получают из мышиных моноклональных антител анти-CD20 В-Ly1 (вариабельная область тяжелой цепи (VH): SEQ ID NO:1, вариабельная область легкой цепи (VL): SEQ ID NO:2, см. Poppema S. и Visser L., Biotest. Bulletin, 3, 131-139 (1987)) за счет химеризации с константным доменом IgG1 человека и последующей гуманизации (см. WO 2005/044859 и WO 2007/031875). Указанные "гуманизированные антитела В-Ly1" подробно описаны в WO 2005/044859 и WO 2007/031875.

Предпочтительно "гуманизированные антитела В-Ly1" содержат вариабельную область тяжелой цепи (VH), выбранную из группы, включающей SEQ ID No.3-SEQ ID No.20 (от В-НН2 до В-НН9 и от B-HL8 до B-HL17, см. WO 2005/044859 и WO 2007/031875). Более предпочтительны Seq. ID No.3, 4, 7, 9, 11, 13 и 15 (В-НН2, ВНН-3, В-НН6, В-НН8, B-HL8, B-HL11 и В-HL13, описанные в WO 2005/044859 и WO 2007/031875). Предпочтительно "гуманизированные антитела В-Ly1" содержат вариабельную область легкой цепи (VL) SEQ ID No. 20 (B-KV1, см. WO 2005/044859 и WO 2007/031875). Кроме того, гуманизированные антитела В-Ly1 предпочтительно являются антителами IgG1. Предпочтительно такие гуманизированные антитела В-Ly1 гликозилируют в Fc области по методикам, описанным в WO 2005/044859, WO 2004/065540, WO 2007/031875. Umana P. и др., Nature Biotechnol., 17, 176-180 (1999) и WO 99/154342. Такие гликозилированные гуманизированные антитела В-Ly1 обладают измененным характером гликозилирования в Fc области, предпочтительно они характеризуются пониженным содержанием остатков фукозы. Предпочтительно в этих антителах не фукозилированы по меньшей мере 40% или более (в одном варианте от 40% до 60%, в другом варианте по меньшей мере 50%, и в еще одном варианте по меньшей мере 70% или более) олигосахаридов Fc области. Кроме того, олигосахариды Fc области предпочтительно являются бисекционными.

Олигосахаридный компонент может оказывать существенное влияние на свойства, обеспечивающие эффективность действия терапевтического гликопротеина, такие как стабильность, устойчивость к действию протеазы, взаимодействие с иммунной системой, фармакокинетика и специфичная биологическая активность. Такие свойства могут зависеть не только от присутствия или отсутствия, но также от конкретных структур олигосахаридов. Можно указать на некоторое соответствие между структурой олигосахарида и функцией гликопротеина. Например, некоторые структуры олигосахарида опосредуют быстрый клиренс гликопротеина из кровотока за счет взаимодействия с некоторыми белками, связывающимися с конкретными углеводами, тогда как другие углеводы могут связываться с антителами и запускать нежелательные иммунные реакции (Jenkins N. и др., Nature BiotechnoL, 14, 975-981 (1996)).

Предпочтительными клетками для продуцирования терапевтических гликопротеинов являются клетки млекопитающих благодаря их способности гликозилировать белки в форме, наиболее совместимой с организмом человека (Cumming D.A. и др., Glycobiology, 1, 115-130 (1991), Jenkins N. и др., Nature BiotechnoL, 14, 975-981 (1996)). Бактерии очень редко гликозилируют белки, а другие подобные типы продуцентов, такие как дрожжи, нитевидные грибы, клетки насекомых и растений, обеспечивают такой профиль гликозилирования, который ассоциируется с быстрым клиренсом из кровотока, нежелательными иммунными взаимодействиями и некоторыми процессами, снижающими биологическую активность. Последние двадцать лет в качестве клеток млекопитающих наиболее часто используются клетки яичника китайского хомячка (СНО). Наряду с приданием пригодного профиля гликозилирования указанные клетки позволяют провести последовательное размножение генетически стабильных, высокопродуктивных линий клональных клеток. Такие клетки можно культивировать до высокой плотности в простых биореакторах с использованием бессывороточной среды, что позволяет разрабатывать безопасные и воспроизводимые биотехнологии. Другие часто используемые клетки животных включают клетки почек детеныша хомячка (ВНК), клетки NSO- и SP2/0-мышиной миеломы. Кроме того, в последнее время исследуется возможность продуцирования антител с использованием трансгенных животных (Jenkins N. и др., Nature Biotechnol,, 14, 975-981 (1996)).

Все антитела содержат углеводные структуры в консервативных положениях константных областей тяжелой цепи, причем каждый изотип обладает собственным профилем N-углеводных структур, которые по разному воздействует на сборку, секрецию или функциональную активность белка (Wright А. и Morrison S.L, Trends Biotech., 15, 26-32 (1997)). Структуры N-углеводных цепей существенно варьируют в зависимости от степени процессинга и могут включать олигосахариды с высоким содержанием маннозы, полиразветвленные, а также двухантенные комплексные олигосахариды (Wright А. и Morrison S.L., Trends Biotech. 15, 26-32 (1997)). Обычно имеет место гетерогенный процессинг каркасных олигосахаридных структур, присоединенных к конкретному сайту гликозилирования, и даже моноклональные антитела присутствуют в полигликозилированных формах. Установлено также, что главные различия в гликозилировании антител наблюдаются между клеточными линиями и при выращивании данной клеточной линии в различных условиях культивирования проявляются даже самые незначительные различия (Lifely M.R. и др., Glycobiology, 5 (8), 813-822 (1995)).

Одним из способов существенного повышения активности и, возможно, исключения значительного нежелательного побочного действия антител при сохранении простого способа получения является усиление природных, клеточно-опосредованных эффекторных функций моноклональных антител за счет формирования их олигосахаридного компонента, как описано в статье Umana P. и др., Nature Biotechnol., 17, 176-180 (1999) и US 6602684. Антитела типа IgG1, наиболее часто используемые в иммунотерапии рака, являются гликопротеинами, которые содержат консервативный сайт N-гликозилирования по Asn297 в каждом домене СН2. Два сложных двухантенных олигосахарида, присоединенные к Asn297, располагаются между СН2 доменами, формируя плотные контакты с полипептидной цепью, и их присутствие является существенным для антител при осуществлении эффекторных функций, таких как антитело-зависимая клеточно-опосредованная цитотоксичность (АЗКОЦ) (Lifely M.R. и др., Glycobiology, 5, 813-822 (1995), Jefferis R. и др., Immunol. Rev., 163, 59-76 (1998), Wright А. и Morrison S.L., Trends Biotechnol., 15, 26-32 (1997)).

Ранее установлено, что гиперэкспрессия в клетках яичника китайского хомячка (СНО) β(1,4)-Н-ацетилглюкозаминилтрансферазы 111 (GnTII17y), гликозилтрансферазы, катализирующей образование бисекционных олигосахаридов, существенно повышает АЗКОЦ in vitro анти-необластомных химерных моноклональных антител (chCE7), продуцируемых модифицированными клетками СНО (см. публикации Umana P. и др., Nature Biotechnol., 17, 176-180 (1999) и WO 99/154342, включенные в описание заявки в полном объеме в качестве ссылок). Антитела chCE7 принадлежат к большому классу неконъюгированных моноклональных антител, которые обладают высокой аффинностью и специфичностью в отношении опухоли, но являются практически непригодными для клинического применения при продуцировании в стандартных производственных клеточных линиях, не содержащих фермента GnTIII (Umana P. и др., Nature Biotechnol., 17, 176-180 (1999)). В указанной работе впервые установлено, что АЗКОЦ можно существенно повысить благодаря конструированию клеток, продуцирующих антитела и экспрессирующих GnTIII, что приводит к повышению доли (Fc)-ассоциированных, бисекционных олигосахаридов, включая бисекционные, нефукозилированные олигосахариды, на уровне, превышающем уровень, наблюдаемый в природных антителах.

Термин "протеасома" обозначает протеасому 26S, описанную, например, в статьях Соих О., Tanaka К. и Goldberg A., Ann. Rev. Biochem., 65, 801-847 (1996), Voges D., Annu. Rev. Biochem., 68, 1015-1068 (1999) или Киселев А.Л. и др., Chem. Biol., 8 (8), 739-758 (2001).

Термин "ингибитор протеасомы", используемый в описании заявки, обозначает агенты, которые ингибируют активность 26S протеасомы. Такие ингибиторы протеасомы включают, например, производные пептидов, такие как альдегиды пептидов (например, MG132, MG115, СЕР-1615, PSI или иммунопротеасома-специфичный ингибитор IPSI-001 (Cbz-LnL-CHO=N-карбобензилоксилейцилнорлейциналь, см. US 2006/0241056), боронаты пептидов (например, бортезомиб (PS-341) или DFLB), эпоксикетоны пептидов (например, эпоксомицин, дигидроэпонемицин или производное эпоксомицина карфилзомиб (PR-171), или пептидные винилсульфоны (например, NLVS) и непептидные соединения, такие как салиноспорамид A (NPI-0052), производные салиноспорамида А, лактацистин или производные лактацистина (например, кластолактацистин-L-лактон (омуралид) или PS-519). Различные типы и структуры указанных ингибиторов протеасомы описаны, например, в публикациях Киселев А.Л. и др., Chem. Biol., 8 (8), 739-758 (2001), WO 2004/004749 и Joazeiro С.и др., Cancer Res., 66 (16), 7840-7842 (2006), Kanagasabaphy Р. и др., Cwr. Opin. Investig. Drugs, 8, 447-451 (2007), Adams J., Nat. Rev. Cancer, 4, 349-360 (2004) и US 2006/0241056.

Предпочтительно такой ингибитор протеасомы выбирают из группы, включающей N-карбобензилоксилейцилнорлейциналь (IPSI-001), боронаты пептидов (предпочтительно бортезомиб (PS-341), или эпоксикетоны пептидов (предпочтительно производное эпоксомицина карфилзомиб (PR-171), или пептидные винилсульфоны (например, NLVS) или салиноспорамид А (NPI-0052). Более предпочтительно такой ингибитор протеасомы выбирают из группы, включающей бортезомиб (PS-341), карфилзомиб (PR-171), салиноспорамид А (NPI-0052) или N-карбобензилоксилейцилнорлейциналь (IPSI-001).

В предпочтительном варианте ингибитор протеасомы представляет собой производное пептида, которое выбирают из пептидных альдегидов (предпочтительно N-карбобензилоксилейцилнорлейциналь (IPSI-001), пептидных боронатов (предпочтительно бортезомиб (PS-341) или пептидных эпоксикетонов. В другом предпочтительном варианте ингибитор протеасомы представляет собой производное пептида, которое выбирают или пептидных боронатов (предпочтительно бортезомиб (PS-341), см., например, Adams J., Cur. Opin. Chem. Biol,, 6, 493-500 (2002) и US 5,780,454).

Предпочтительно ингибитор протеасомы характеризуется ингибирующей активностью в отношении протеасомы с величиной IC₅₀ 5 мкМ или менее, более предпочтительно 1 мкМ или менее. Анализ на культуре клеток для идентификации таких ингибиторов протеасомы и для определения величины IC₅₀ (методом серийных разведений и расчета с использованием нелинейного графика (программа XLfit, фирма ID Business Solution Ltd., Guilford, Surrey, UK)) описан в статье Moravec R. и др.. Cell Notes, 15, 4-7 (2006) и включает применение реагента Proteasome-Glo™ (фирма Promega) и клеток U266 (множественной миеломы человека). В указанном анализе типа "добавить-смешать-измерить" на культуре клеток измеряют активность химотрипсин-подобной протеазы, ассоциированной с протеасомой.

Наряду с IPSI-001 (Cbz-LnL-CHO-N-карбобензилоксилейцилнорлейциналь) предпочтительными ингибиторами протеасомы являются следующие пептиды, описанные в US 2006/0241056: N-карбобензилоксигомофенилаланилфенилаланилаль,

N-карбобензилоксилейцилфенилаланилаль, N-карбобензилоксиаланилфенилаланилаль, N-карбобензилоксиглицилпролилаланилфенилаланилаль, N-карбобензилоксиглицилпролилфенилаланилфенилаланилаль, N-карбобензилоксиглицилфенилаланилфенилаланилаль, N-карбобензилоксилейцилнорлейцинбороновая кислота,

N-карбобензилоксифенилаланилфенилаланинбороновая кислота, N-карбобензилоксигомофенилаланилфенилаланинбороновая кислота, N-карбобензилоксилейцилфенилаланинбороновая кислота, N-карбобензилоксиглицилпролилаланилфенилаланинбороновая кислота, N-карбобензилоксиглицилпролилфенилаланилфенилаланинбороновая кислота, N-карбобензилоксилейциллейцилфенилаланинбороновая кислота,

N-карбобензилоксиглицилфенилаланилфенилаланинбороновая кислота,

N-карбобензилоксилейцилнорлейцинметилвинилсульфон, N-карбобензилоксифенилаланилфенилаланинметидвинилсульфон, N-карбобензилоксигомофенилаланилфенилаланинметилвинилсульфон, N-карбобензилоксилейцилфенилаланинметилвинилсульфон, N-карбобензилоксиаланилфенилаланинметилвинилсульфон, N-карбобензилоксиглицилпролилаланилфенилаланинметилвинилсульфон, N-карбобензилоксиглицилпролилфенилаланилфенилаланинметилвинилсульфон, N-карбобензилоксилейциллейцилфенилаланинметилвинилсульфон, N-карбобензилоксиглицилфенилаланилфенилаланинметилвинилсульфон,

N-карбобензилоксилейцилнорлейцинэпоксикетон, N-карбобензилоксифенилаланилфенилаланинэпоксикетон, N-карбобензилоксигомофенилаланилфенилаланинэпоксикетон, N-карбобензилоксилейцилфенилаланинэпоксикетон, N-карбобензилоксиаланилфенилаланинэпоксикетон, N-карбобензилоксиглицилпролилаланилфенилаланинэпоксикетон, N-карбобензилоксиглицилпролилфенилаланилфенилаланинэпоксикетон, N-карбобензилоксилейциллейцилфенилаланинэпоксикетон и N-карбобензилоксиглицилфенилаланилфенилаланинэпоксикетон.

Термин "экспрессия антигена CD20" обозначает высокий уровень экспрессии в клетке антигена CD20, предпочтительно на поверхности Т- или В-клеток, более предпочтительно В-клеток, полученных от опухоли или рака, соответственно, предпочтительно несолидной опухоли. Пациентов, страдающих от "рака, экспрессирующего CD20", определяют стандартными методами, известными в данной области. Например, экспрессию антигена CD20 измеряют иммуногистохимическим детектированием (ИГХ), СКАФ или детектированием соответствующей мРНК методом ПЦР.

Термин "рак, экспрессирующий CD20", используемый в описании заявки, обозначает все виды рака, при которых опухолевые клетки экспрессируют антиген CD20. Такими видами рака, экспрессирующего CD20, являются, например, лимфома, лимфолейкоз, рак легких, немелкоклеточный рак легких, рак бронхоальвеолярных клеток легкого, рак костной ткани, рак поджелудочной железы, рак кожи, рак головы и шеи, кожная или внутриглазная меланома, рак матки, рак яичника, ректальный (прямокишечный) рак, рак анальной области, рак желудка, желудочный рак, рак ободочной кишки, рак молочной железы, рак матки, рак фаллопиевых труб, карцинома эндометрия, карцинома шейки матки, рак влагалища, рак наружных женских половых органов, болезнь Ходжкина, рак пищевода, рак тонкого кишечника, рак эндокринной системы, рак щитовидной железы, рак паращитовидной железы, рак надпочечников, саркома мягких тканей, рак уретры, рак полового члена, рак предстательной железы, рак мочевого пузыря, рак почки или мочеточника, рак почечных клеток, карцинома почечной лоханки, мезотелиома, печеночно-клеточный рак, билиарный рак, опухоли центральной нервной системы (ЦНС), опухоли ствола спинного мозга, глиома ствола головного мозга, полиморфная глиобластома, астроцитома, невринома (шваннома), эпендимома (эпендиальная глиома), медуллобластома, менингиома, плоскоклеточная карцинома, гипофизарная аденома, включая резистентные формы любого из указанных видов рака или комбинацию одного или более вышеуказанных видов рака.

Предпочтительно термин "рак, экспрессирующий CD20", используемый в описании заявки, обозначает лимфомы (предпочтительно В-клеточную лимфому не-Ходжкина (ЛНХ)) и лимфолейкозы. Такие лимфомы и лимфолейкозы включают, например, а) фолликулярные лимфомы, б) мелкоклеточную лимфому с нерасщепленным ядром/лимфому Беркитта (включая эндемическую лимфому Беркитта, спорадическую лимфому Беркитта и лимфому не-Беркитта), в) лимфомы маргинальной зоны (включая В-клеточную лимфому экстранодальной маргинальной зоны (ассоциированная со слизистой и лимфоидной тканью лимфома, MALT), В-клеточную лимфому модальной маргинальной зоны и лимфому селезеночной маргинальной зоны), г) лимфому клеток коры головного мозга (ЛККГМ), д) крупноклеточную лимфому (включая В-клеточную диффузную крупноклеточную лимфому (ДККЛ), диффузную клеточную лимфому смешанного типа, иммунобластическую лимфому, первичную медиастинальную В-клеточную лимфому, В-клеточную лимфангиому легких), е) лейкоз ворсистых клеток, ж) лимфолейкоз, макроглобулинемию Вальденстрема, з) острый лимфолейкоз (ОЛЛ), хронический лимфолейкоз (ХЛЛ)/легкий лимфолейкоз (ЛЛЛ), В-клеточный пролимфолейкоз, и) плазмоцитому, миеломную болезнь, множественную миелому, плазмацитому, к) болезнь Ходжкина.

Более предпочтительно рак, экспрессирующий CD20, представляет собой В-клеточные лимфомы не-Ходжкина (НХЛ). Рак, экспрессирующий CD20, прежде всего представляет собой лимфому клеток коры головного мозга (ЛККГМ), острый лимфолейкоз (ОЛЛ), хронический лимфолейкоз (ХЛЛ), В-клеточную диффузную крупноклеточную лимфому (ДККЛ), лимфому Беркитта, лейкоз ворсистых клеток, фолликулярную лимфому, множественную миелому, лимфому маргинальной зоны, посттрансплантационное лимфопролиферативное заболевание (ПТЛЗ), лимфому, ассоциированная с ВИЧ, макроглобулинемию Вальденстрема или первичную лимфому ЦНС.

Термин "способ лечения" или его эквивалент, например, в отношении рака, обозначает способ или курс лечения, который предназначен для снижения числа или ликвидации раковых клеток в организме пациента или уменьшения интенсивности симптомов рака. "Способ лечения" рака или другого пролиферативного нарушения необязательно обозначает, что раковые клетки или другое нарушение будут ликвидированы фактически или что симптомы рака или другого нарушения будут уменьшены фактически. Часто способ лечения рака проводят даже при слабой надежде на успех, но такой способ при данной истории болезни и предполагаемой продолжительности жизни пациента тем не менее обеспечивает общий благоприятный ход лечения.

Термин "совместное введение" обозначает введение указанных антител анти-CD20 типа II и указанного ингибитора протеасомы в составе одной композиции или в составе двух отдельных композиций. Совместное введение можно проводить одновременно или последовательно в любом порядке, причем предпочтительно существует период времени, когда оба (или все) активные агенты одновременно проявляют биологическую активность. Указанные антитела анти-CD20 типа II и указанный ингибитор протеасомы вводят одновременно или последовательно (например, в виде внутривенного непрерывного вливания (одного вливания антител, а затем одного вливания ингибитора протеасом, или ингибитор протеасом можно вводить перорально). Если оба терапевтических агента вводятся последовательно, дозу вводят в один и тот же день двумя отдельными частями, или один из агентов вводят в день 1, а другой агент вводят в день 2-7, предпочтительно в день 2-4. Таким образом, термин "последовательно" обозначает в течение 7 дней после введения дозы антител, предпочтительно в течение 4 дней после введения дозы антител, а термин "одновременно" обозначает в одно время. Термин "совместное введение" в связи с поддержанием уровня антител анти-CD20 типа II и ингибитора протеасомы обозначает, что поддерживающие дозы можно вводить одновременно, если курс лечения является пригодным для обоих лекарственных средств, например, каждую неделю, или ингибитор протеасомы вводят, например, каждые 1-3 дня, а антител анти-CD20 типа II вводят каждую неделю, или поддерживающие дозы вводят последовательно в течение одного или нескольких дней.

Подразумевается, что антитела вводят пациенту в «терапевтически эффективном количестве» (или просто в «эффективном количестве»), которое обозначает такое количество соответствующего соединения или комбинации, которое вызывает биологическую или лечебную ответную реакцию ткани, системы, животного или человека, на которую рассчитывали исследователь, ветеринар, лечащий врач или другой медицинский персонал.

Количество совместно введенных антител анти-CD20 типа II и указанного ингибитора протеасом и время совместного введения зависят от типа субъекта (вида, пола, возраста, массы тела и т.п.), состояния пациента, подлежащего лечению, и тяжести заболевании или состояния, подлежащего лечению. Указанные антитела анти-CD20 типа II и указанный ингибитор протеасом являются пригодными для совместного введения пациенту одновременно или для многократного введения. В зависимости от типа и тяжести заболевания первоначальные варианты доз указанных антител анти-CD20 типа II, предназначенные для совместного введения лекарственных средств пациенту, составляют приблизительно от 1 мкг/кг до 50 мг/кг (например, 0,1-20 мг/кг), а варианты доз указанного ингибитора протеасом составляют от 1 мкг/кг до 50 мг/кг (например, 0,1-20 мг/кг). Если указанные агенты вводят внутривенно, первоначальное время вливания указанных антител анти-CD20 типа II или указанного ингибитора протеасом является более продолжительным, чем последующие циклы введения, например первоначальное вливание можно проводить в течение приблизительно 90 мин, а последующее вливание можно проводить в течение приблизительно 30 мин (при условии хорошо переносимого первоначального вливания).

Предпочтительная доза указанных антител анти-CD20 типа II составляет от приблизительно от 0,05 мг/кг до приблизительно 30 мг/кг. Таким образом, пациенту можно совместно вводить одну или более доз, составляющих приблизительно 0,5 мг/кг, 2,0 мг/кг, 4,0 мг/кг, 10 мг/кг или 30 мг/кг (или их любую комбинацию). Предпочтительная доза указанного ингибитора протеасом составляет от 0,01 мг/кг до приблизительно 30 мг/кг, например от 0,1 мг/кг до 10 мг/кг бортезомиба. В зависимости от типа субъекта (вида, пола, возраста, массы тела и т.п.), состояния пациента и от типа антитела анти-CD20 и ингибитора протеасом доза и схема введения указанных антител анти-CD20 отличаются от доз ингибитора протеасом. Например, указанные антитела анти-CD20 можно вводить каждые 1-3 недели, а указанный ингибитор протеасом можно вводить ежедневно или каждые 2-10 дней. Первоначально можно также ввести более высокую дозу, а затем одну или более низких доз.

В предпочтительном варианте лекарственное средство можно использовать для профилактики или снижения метастозирования или дальнейшего распространения патологического состояния в организме пациента, страдающего от рака, экспрессирующего CD20. Лекарственное средство можно использовать для увеличения продолжительности жизни такого пациента, увеличения выживаемости такого пациента без развития заболевания, увеличения продолжительности ответной реакции, приводящей к статистически достоверному и клинически подтвержденному улучшению состояния пациента по данным продолжительности жизни, выживаемости без развития заболевания, скорости или продолжительности ответной реакции. В предпочтительном варианте лекарственное средство можно использовать для увеличения ответной реакции в группе пациентов.

В контексте настоящего изобретения в составе комбинации антител анти-CD20 типа II и ингибитора протеасом, предназначенной для лечения рака, экспрессирующего анти-CD20, можно использовать другие цитотоксичные, химиотерапевтические или противоопухолевые агенты или соединения, которые усиливают действие таких агентов (цитокины). Такие агенты должны присутствовать в комбинации в количествах, которые являются эффективными для оказания терапевтического действия. Предпочтительно комбинация антител анти-CD20 типа II и ингибитора протеасом используется для лечения в отсутствие таких дополнительных цитотоксичных, химиотерапевтических или противоопухолевых агентов или соединений, усиливающих действие таких агентов.

Такими агентами являются, например, алкилирующие агенты или агенты с алкилирующим действием, такие как циклофосфамид (СТХ, например cytoxan®), хлорамбуцил (CHL, например leukeran®), цисплатин (CisP, например platinol®), бусулфан (например, myleran®), мелфалан, кармустин (BCNU), стрептозотоцин, триэтиленметамин (ТЭМ), митомицин С и т.п., антиметаболиты, такие как метотрексат (МТХ), этопозид (VP16, например vepesid®), 6-меркаптопурин (6МП), 6-тиогуанин (6ТГ), цитарабин (Ara-С), 5-фторурацил (5-ФУ), капецитабин (например, Xeloda®), декарбазин (DTIC) и т.п., антибиотики, такие как актиномицин D, доксорубицин (DXR, например adriamycin®), даунорубицин (дауномицин), блеомицин, митрамицин и т.п., алкалоиды, такие как алкалоиды барвинка розового, такие как винкристин (VCR), винбластин и т.п., и другие противоопухолевые агенты, такие как паклитаксел (например, taxol®) и производные паклитакселя, цитостатические агенты, глюкортикоиды, такие как дексаметазон (DEX, например decadron®) и кортикостероиды, такие как преднизон, ингибиторы нуклеаз, такие как гидроксимочевина, специфичные протеазы, такие как аспарагиназа, лейковорин и другие производные фолиевой кислоты, и подобные противоопухолевые агенты. Кроме того, можно использовать другие дополнительные агенты, такие как арнифостин (например, ethyol®), дактиномицин, меклоретамин (азотисный иприт), стрептозоцин, циклофосфамид, ломустин (CCNU), доксорубицин липо (например, doxil®), гемцитабин (например, gemzar®), даунорубицин липо (например, daunoxome®), прокарбазин, митомицин, доцетаксел (например, taxotere®), алдеслейкин, карбоплатин, оксалиплатин, кладрибин, камптоцетин, СРТ 11 (иринотекан), 10-гидрокси-7-этилкамфотецин (SN38), флоксуридин, флударабин, ифосфамид, идарубицин, месна, β-интерферон, α-интерферон, митоксантрон, топотекан, лейпролид, мегестрол, мелфалан, меркаптопурин, пликамицин, митотан, пегаспаргаза, пентостатин, пипоброман, пликамицин, тамоксифен, тенипозид, тестолактон, тиогуанин, тиотепа, урацилиприт, винорелбин, хлорамбуцил. Предпочтительно комбинация антител анти-CD20 типа II и ингибитора протеасомы используется для лечения в отсутствие таких дополнительных агентов.

Применение цитотоксических и противоопухолевых агентов, описанных выше, а также антипролиферативных специфичных противоопухолевых лекарственных средств, такого как ингибиторы протеинкиназы, в курсе химиотерапии обычно известно в терапии рака, и их применение должно соответствовать тем же требованиям переносимости, эффективности и контроля способов введения и дозирования, с некоторыми поправками. Например, фактические дозы цитотоксических агентов могут изменяться в зависимости от ответной реакции культивированных клеток пациента, которую определяют гистохимическими методами на культуре ткани. В общем случае, доза снижается по сравнению с количеством, которое используется в отсутствие других дополнительных агентов.

Типичные дозы эффективного цитотоксического агента могут находиться в интервалах, рекомендованных производителем, а по результатам испытаний на ответные реакции in vitro и на модели животных концентрация или количество агента может снижаться приблизительно на порядок. Таким образом, фактическая доза зависит от мнения врача, состояния пациента и эффективности способа лечения, основанного на чувствительности первичных культивированных злокачественных клеток или культуры ткани, или ответной реакции, наблюдаемой на соответствующей модели животных.

В контексте настоящего изобретения при лечении рака, экспрессирующего CD20, в дополнение к комбинации антител анти-CD20 типа II и ингибитора протеасом можно использовать эффективное количество ионизирующего излучения и/или радиотерапевтические методы. Источником излучения являются внешний и внутренний относительно пациента источники. Лечение с использованием внешнего источника называется лучевая терапия (ЛТ), лечение с использованием внутреннего источника носит название брахитерапия (БТ). Радиоактивные элементы для применения по изобретению выбирают из группы, включающей, но не ограничиваясь только ими, радий, цезий-137, иридий-192, америций-241, золото-198, кобальт-57, медь-67, технеций-99, иод-123, иод-131 и индий-111. Кроме того, такие радиоактивные изотопы можно вводить в антитела. Предпочтительно комбинация антител анти-CD20 типа II и ингибитора протеасом используется без применения лучевой терапии.

Лучевая терапия является стандартным способом лечения неоперабельных опухолей и/или опухолевых метастазов. Положительные результаты наблюдаются в том случае, когда лучевую терапию используют в комбинации с химиотерапией. Лучевая терапия основана на том принципе, что интенсивное облучение очага поражения должно привести к гибели репродуктивных клеток в опухолевых и нормальных тканях. Курс лучевой терапии обычно приводится в виде поглощенной дозы (ПД), времени и фракционирования дозы и должен тщательно контролироваться онкологом. Количество излучения, полученное пациентом, зависит от ряда факторов, наиболее важными из которых являются локализация опухоли относительно других важных структур или органов и степени распространения опухоли. Типичный курс лечения пациента с использованием лучевой терапии представляет собой график, рассчитанный на 1-6 недель, с общей дозой от 10 до 80 ПД, введенной пациенту в виде суточной фракции приблизительно от 1,8 до 2,0 ПД в течение 5 дней в неделю. В предпочтительном варианте настоящего изобретения, если опухоли в организме пациентов подвергаются воздействию комбинации по изобретению и облучению, наблюдается синергетическое действие. Иными словами, подавление роста опухоли с использованием агентов, включающих комбинацию по изобретению, усиливается при одновременном облучении, необязательно с использованием дополнительных химиотерапевтических или противоопухолевых агентов. Параметры адъювантной лучевой терапии приводятся, например, в WO 99/60023.

Антитела анти-CD20 типа II вводят пациенту известными способами, например внутривенно в виде однократного вливания или непрерывным вливанием в течение определенного времени, внутримышечным, внутрибрюшинным, интрацереброспинальным, подкожным, интраартикулярным, внутрисуставным или интратекальным способами. Предпочтительны внутривенный или подкожный способ введения антител.

Ингибиторы протеасомы вводят пациенту известными способами, например внутривенно в виде однократного вливания или непрерывным вливанием в течение определенного времени, внутримышечным, внутрибрюшинным, интрацереброспинальным, подкожным, интраартикулярным, внутрисуставным или интратекальным или пероральным способами. Предпочтительны внутривенный, подкожный или пероральный способ введения ингибиторов протеасомы.

Изобретение также включает набор, содержащий антитела анти-CD20 типа II и ингибитор протеасомы для комбинированного лечения пациента, страдающего от рака, экспрессирующего CD20. В предпочтительном варианте контейнеры набора могут также включать фармацевтически приемлемый носитель. Набор может также включать стерильный разбавитель, который предпочтительно хранится в отдельном дополнительном контейнере. Набор может также включать листовку-вкладыш с инструкциями по применению для комбинированного лечения рака, экспрессирующего CD20. предпочтительно В-клеточной лимфомы не-Ходжкина (ЛНХ).

Термин "листовка-вкладыш" обозначает инструкции, обычно включенные в коммерческие упаковки лекарственных средств, которые содержат информацию относительно показаний, применения, доз, способа введения, противопоказаний и/или предупреждения относительно применения таких лекарственных средств.

В предпочтительном варианте содержание контейнеров включает также фармацевтически приемлемый носитель, а также стерильный разбавитель, который предпочтительно хранится в отдельном дополнительном контейнере.

Термин "фармацевтически приемлемый носитель", используемый в описании заявки, включает любые материалы, пригодные для введения в составе фармацевтического препарата, включая растворители, диспергирующие среды, материалы покрытия, антибактериальные и противогрибковые агенты, изотонические агенты и агенты, замедляющие абсорбцию, и другие материалы и соединения, пригодные для введения в составе фармацевтического препарата. Изобретение включает применение таких носителей в составе композиций по изобретению, за исключением любых обычных сред или агентов, несовместимых с активным соединением. Композиции могут также включать дополнительные активные соединения.

Фармацевтические композиции

Фармацевтические композиции антител получают переработкой анти-CD20 типа II и/или ингибитора протеасомы по настоящему изобретению в смеси с фармацевтически приемлемыми неорганическими или органическими носителями. Например, в качестве таких носителей при получении таблеток, таблеток с покрытием, драже и твердых желатиновых капсул используют лактозу, кукурузный крахмал или его производные, тальк, стеариновую кислоту или ее соли и т.п. Пригодными носителями для мягких желатиновых капсул являются, например, растительные масла, воски, жиры, полутвердые и жидкие полиолы и т.п. Однако в зависимости от природы активного вещества в случае мягких желатиновых капсул обычно не требуется никаких носителей. Пригодными носителями для получения растворов и сиропов являются, например, вода, полиолы, глицерин, растительные масла и др. Пригодными носителями для суппозиториев являются, например, природные или отвержденные масла, воски, жиры, полужидкие или жидкие полиолы и т.п.

Кроме того, фармацевтические препараты могут содержать консерванты, солюбилизирующие агенты, стабилизирующие агенты, смачивающие агенты, эмульгаторы, подсластители, красители, ароматизаторы, соли для регуляции осмотического давления, буферные вещества, маскирующие агенты или антиоксиданты. Кроме того, они могут содержать другие терапевтически ценные вещества.

Одним вариантом изобретения является фармацевтическая композиция, включающая антитела анти-CD20 типа II и указанный ингибитор протеасомы, прежде всего для применении при лечения рака, экспрессирующего CD20.

Указанная фармацевтическая композиция может также включать один или более фармацевтически приемлемых носителей.

Кроме того, в настоящем изобретении предлагается фармацевтическая композиция, предназначенная прежде всего для применения при лечении рака, включающая (1) эффективное количество антитела анти-CD20 типа II и (2) эффективное количество ингибитора протеасомы. Такая композиция необязательно включает фармацевтически приемлемые носители и/или эксципиенты.

Фармацевтические композиции антител анти-CD20 типа II, используемые отдельно по настоящему изобретению, получают для хранения смешиванием антител (требуемой степени чистоты) с необязательными фармацевтически приемлемыми носителями, эксципиентами или стабилизирующими агентами (Remington's Pharmaceutical Sciences, 16 изд., Osol А., ред. (1980)) в форме лиофилизированных препаратов или водных растворов. Приемлемые носители, эксципиенты или стабилизирующие агенты являются нетоксичными для реципиентов в используемых дозах или концентрациях и включают буферные вещества, такие как фосфат, цитрат и другие органические кислоты, антиоксиданты, включающие аскорбиновую кислоту и метионин, консерванты (такие как хлорид октадецилдиметилбензиламмония, хлорид гексаметония, хлорид бензалкония, хлорид бензетония, фенол, бутиловый или бензиловый спирт, алкилпарабены, такие как метил- или пропилпарабен, катехин, резорцин, циклогексанол, 3-пентанол и мета-крезол), низкомолекулярные полипептиды (содержащие менее приблизительно 10 аминокислот), белки, такие как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины, гидрофильные полимеры, такие как поливинилпирролидон, аминокислоты, такие как глицин, глутамин, аспарагин, гистидин, аргинин или лизин, моносахариды. дисахариды и другие углеводы, включающие глюкозу, маннозу, или декстрины, комплексоны, такие как ЭДТА, сахара, такие как сахароза, маннит, трегалоза или сорбит, солеобразующие противоионы, такие как натрий, комплексы металлов (например, Zn-содержащие белки), и/или неионные ПАВ, такие как TWEEN™, PLURONICS™ или полиэтиленгликоль (ПЭГ).

Фармацевтические композиции ингибитора протеасомы зависят от фармацевтических свойств активного агента, например композиция, содержащая низкомолекулярные соединения, такие, например, как бортезомиб, имеет следующий состав:

а) Состав таблетки (влажное гранулирование)

№ Ингредиенты мг/таблетка 1 Соединение формулы (I) 5 25 100 500 2 Лактоза безводная DTG 125 105 30 150 3 Sta-Rx 1500 6 6 6 30 4 Микрокристаллическая целлюлоза 30 30 30 150 5 Стеарат магния 1 1 1 1   Всего 167 167 167 831

Методика получения:

1. Смешивают ингредиенты 1, 2, 3 и 4 и гранулируют в присутствии очищенной воды.

2. Гранулы высушивают при 50°С.

3. Гранулы размалывают на соответствующей мельнице.

4. Добавляют ингредиент 5, перемешивают в течение 3 мин и прессуют на соответствующем прессе.

б) Состав капсул:

№ Ингредиенты мг/таблетка 1 Соединение формулы (I) 5 25 100 500 2 Безводная лактоза 159 123 148 - 1113 Кукурузный крахмал 25 35 40 70 4 Тальк 10 15 10 25 5 Стеарат магния 1 2 2 5   Всего 200 200 300 600

1. Смешивают ингредиенты 1, 2 и 3 в соответствующем смесителе в течение 30 мин.

2. Добавляют ингредиенты 4 и 5 и перемешивают в течение 3 мин.

3. Смесью заполняют соответствующую капсулу.

В еще одном варианте изобретения фармацевтические композиции по изобретению предпочтительно представляют собой два отдельных препарата, содержащих указанные антитела анти-CD20 типа II и указанный ингибитор протеасомы.

Активные ингредиенты можно также включать в микрокапсулы, полученные, например, методами коацервации или полимеризации на границе раздела фаз, например гидроксиметилцеллюлозы или желатиновых капсул и микрокапсул поли(метилметакрилата), соответственно, в коллоидные системы доставки лекарственных средств (например, в липосомы, альбуминовые микросферы, микроэмульсии, наночастицы и нанокапсулы) или в микроэмульсии. Такие методы описаны в Remington's Pharmaceutical Sciences, 16 изд., Osol А., ред. (1980).

Кроме того, можно получать препараты с замедленным высвобождением. Пригодными примерами таких препаратов являются полупроницаемые матрицы из твердых гидрофобных полимеров, содержащие антитела, причем матрицы могут иметь различные формы, такие как пленки или микрокапсулы. Примерами матриц с замедленным высвобождением являются полиэфиры, гидрогели (например, поли(2-гидроксиэтилметакрилат) или поли(виниловый спирт)), полилактиды (см. US 3773919), сополимеры L-глутаминовой кислоты и γ-этил-L-глутамата, недеградируемый этиленвинилацетат, деградируемые сополимеры молочная кислота/гликолевая кислота, такие как LUPRON DEPOT™ (инъецируемых микросферы сополимера молочная кислота/гликолевая кислота и лейпролидацетата) и поли-D-(-)-3-гидроксимасляная кислота.

Препараты, предназначенные для введения in vivo, должны быть стерильными. Стерилизацию проводят фильтрованием через стерильные мембраны.

В настоящем изобретении также предлагается способ лечения рака, заключающийся в том, что пациенту, который нуждается в таком лечении, вводят (1) эффективное количество антител анти-CD20 типа II и (2) эффективное количество ингибитора протеасомы.

В настоящем изобретении также предлагается способ лечения рака, заключающийся в том, что пациенту, который нуждается в таком лечении, вводят (1) эффективное количество антител анти-CD20 типа II и (2) эффективное количество ингибитора протеасомы.

Термин "пациент", используемый в описании заявки, предпочтительно обозначает человека, который нуждается в лечении антителами анти-CD20 типа II (например, пациента, страдающего от рака, экспрессирующего CD20) любым способом, и более предпочтительно человека, который нуждается в таком лечении рака, или предракового состояния или патологического изменения. Однако термин "пациент" может также обозначать животных, предпочтительно млекопитающих, таких как собаки, кошки, лошади, рогатый скот, свиньи, овцы, нечеловекообразные приматы и др.

Изобретение также включает антитела анти-CD20 типа II, предназначенные для лечения пациента, страдающего от рака, экспрессирующего CD20, в комбинации с ингибитором протеасомы.

Изобретение также включает антитела анти-CD20 типа II и ингибитор протеасомы, предназначенные для лечения рака, экспрессирующего CD20.

Изобретение также включает антитела анти-CD20 типа II и ингибитор протеасомы, предназначенные для лечения пациента, страдающего от рака, экспрессирующего CD20.

Предпочтительно ингибитор протеасомы характеризуется величиной IC₅₀ 5 мкМ или менее. Предпочтительно такой ингибитор протеасомы выбирают из группы, включающей альдегиды пептидов (предпочтительно N-карбобензилоксилейцилнорлейциналь, IPSI-001), боронаты пептидов (предпочтительно бортезомиб, PS-341), эпоксикетоны пептидов (предпочтительно производное эпоксомицина карфилзомиб, PR-171) или салиноспорамид A (NPI-0052). Более предпочтительно такой ингибитор протеасомы выбирают из бортезомиба (PS-341), карфилзолиба (PR-171), салиноспорамида А (NPI-0052) или N-карбобензилоксилейцилнорлейциналя (IPSI-001).

Предпочтительно соотношением связывающих активностей указанных антител анти-CD20 типа II и ритуксимаба с CD20 на клетках Raji (ATCC, №CCL-86) составляет от 0,3 до 0,6, более предпочтительно от 0,35 до 0,55 и наиболее предпочтительно от 0,4 до 0,5.

Предпочтительно указанные антитела анти-CD20 типа II являются гуманизированными антителами B-Ly1.

Предпочтительно указанные антитела анти-CD20 типа II характеризуются повышенной антитело-зависимой клеточно-опосредованной цитотоксичностью (АЗКОЦ).

Предпочтительно рак, экспрессирующий CD20, является В-клеточной лимфомой не-Ходжкина (ЛНХ).

Предпочтительно указанные антитела анти-CD20 типа I являются моноклональными антителами.

Настоящее изобретение, объем которого указан в прилагаемых пунктах формулы изобретения, иллюстрируется следующими примерами, перечнем последовательностей и фигурами. Подразумевается, что в пределах сущности изобретения возможны различные модификации указанных методик.

Перечень аминокислотных последовательностей

SEQ ID NO:1: аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи (VH) мышиных моноклональных антител анти-CD20 B-Ly1 мыши.

SEQ ID NO:2: аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи (VL) мышиных моноклональных антител анти-CD20 B-Ly1.

SEQ ID NO:3-19: аминокислотные последовательности вариабельной области тяжелой цепи (VH) гуманизированных антител B-Ly1 (B-HH2-В-НН9, B-HL8HB-HL10-B-HL17).

SEQ ID NO:20: аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи (LH) гуманизированных антител B-Ly1 B-KV1.

Описание фигур

Фиг.1. Противоопухолевая активность при комбинированном воздействии на клетки В-клеточной лимфомы не-Ходжкина (ЛНХ) SU-DHL-4 DLBCL антител анти-CD20 типа II (B-HH6-B-KV1 GE), у которых соотношение связывающих активностей в отношении CD20 на клетках (АТСС №CCL-86) по сравнению с ритуксимабом составляет 0,44, и ингибитора протеасом (бортезумаба). На оси у указан средний объем опухоли (мм³)+/- IQR, на оси х указаны дни после инъекции опухолевых клеток. Надписи: А) носитель (кружочки). Б) гуманизированные антитела В-ly1 (B-HH6-B-KV1 GE), 10 мг/кг один раз в неделю (квадратики). В) ингибитор протеасомы бортезомиб, 1 мг/кг один раз в неделю (треугольники) и Г) гуманизированные антитела В-ly1 (B-HH6-B-KV1 GE), 10 мг/кг один раз в неделю, в комбинации с ингибитором протеасомы бортезомибом, 1 мг/кг один раз в неделю (крестики).

Фиг.2. Среднее значение интенсивности флуоресценции (СИФ, левая ось у) антител анти-CD20 типа I (Cy5/ритуксимаб = белый столбик) и антител анти-CD20 типа II (Cy5/гуманизированные B-Ly1 B-HH6-B-KV1 GE = черный столбик) на клетках Raji (АТСС №CCL-86), соотношение связывающих активностей антител анти-CD20 типа I (ритуксимаб) и антител анти-CD20 типа II (B-HH6-B-KV1 GE) по сравнению с ритуксимабом в отношении CD20 указаны на правой оси y.

Фиг.3. Противоопухолевая активность при комбинированном воздействии на клетки человека Z138 лимфомы не-Ходжкина (ЛНХ) двух антител анти-CD20 типа II. Оба антитела являются гуманизированными антителами анти-CD20 В-Ly1, 1) B-HH6-B-KV1 гликомодифицированные (GE) и 2) B-HH6-B-KV1 дикого типа (негликомодифицированные). На оси у указан средний объем опухоли (мм³), на оси х указаны дни после инъекции опухолевых клеток. Надписи: А) носитель (кружочки), Б) гуманизированные антитела В-ly1 GE (B-HH6-B-KV1 GE), 30 мг/кг один раз в неделю (треугольнички) и В) гуманизированные В-ly1 дикого типа (B-HH6-B-KV1 wt), 30 мг/кг один раз в неделю (крестики).

Примеры

Пример 1

Противоопухолевое действие при комбинированном лечении антителами анти-CD20 типа II (B-HH6-B-KV1 GE) и ингибитором протеасомы (бортезомибом)

Анализируемые агенты

Антитела анти-CD20 типа II B-HH6-B-KV1 GE (гуманизированные В-Ly1, гликомодифицированные B-HH6-B-KV1, см. WO 2005/044859 и WO 2007/031875) получали в виде концентрированного раствора (с 9,4 мг/мл (фирма GlycArt, Шлирен, Швейцария). Буферный раствор включал гистидин, трегалозу и полисорбат 80. Перед инъекцией концентрированный раствор антител разбавляли в ФСБ.

Ингибитор протеасомы бортезомиб получали в форме препарата для клинического применения от фирмы Janssen-Cilag GmbH (Neuss, Германия). Разведения получали из приготовленного концентрированного раствора.

Клеточные линии и условия культивирования

В эксперименте использовали клетки человека SU-DHL-4 лимфомы не-Ходжкина (Chang H. и др., Leuk. Lymphoma, 8, 129-136 (1992)), предоставленные фирмой DSMZ (Брауншвейг). Линию опухолевых клеток культивировали в стандартных условиях в среде RPMI (фирма РАА Laboratories, Австрия), содержащей 10% ЭТС (фирма РАА Laboratories, Австрия) и 2 мМ L-глутамин, при 37°С в насыщенной влажной атмосфере, содержащей 5% СО₂. Для трансплантации использовали клетки после пятикратного пересева.

Животные

Самок мышей SCID с врожденным отсутствием клеток-киллеров возрастом 4-5 недель (полученных от фирмы Bomholtgard, Ry, Дания) после доставки выдерживали в специальных стерильных условиях в режиме 12 ч свет/12 ч темнота в соответствии с методическими рекомендациями (фирма GV-Solas, Felasa, TierschG). Протокол испытаний рассмотрен и утвержден местными административными органами. После доставки животных выдерживали в карантинном блоке вивария в течение одной недели для привыкания к новым условиям и для обследования. При этом проводили непрерывный контроль состояния здоровья при свободном доступе к корму (Provimi Kliba 3337) и воде (подкисленная до рН 2,5-3).

Обследование

Животных обследовали ежедневно на наличие клинических симптомов и проявление побочного действия. В течение эксперимента у животных дважды в неделю регистрировали массу тела и измеряли размер опухоли штангенциркулем после определения стадии заболевания.

Лечение животных

Лечение начинали в день рандомизации через 22 дня после трансплантации клеток. Исследуемым группам животных вводили гуманизированные антитела анти-CD20 типа II (B-HH6-B-KV1 GE) отдельно или в комбинации, а контрольной группе вводили соответствующий носитель, внутривенно, один раз в неделю в день 22, 29, 36 и 43, в дозе 10 мг/кг. Ингибитор протеасомы бортезомиб вводили внутрибрюшинно один раз в неделю в день 23, 29 и 37, в дозе 1 мг/кг.

Исследование подавления роста опухоли in vivo

Контрольную группу животных, которым вводили носитель, исключали из эксперимента через 15 дней после начала лечения из-за большой опухолевой массы. Лечение животных, которым один раз в неделю вводили антитела B-HH6-B-KV1 GE (10 мг/кг) в виде единственного агента, приводило к существенному подавлению роста ксенотрансплантата через 14 дней (ПРО 68%) по сравнению с контролем. Однако, несмотря на еженедельные инъекции антител, позднее наблюдался непрерывный рост ксенотрансплантатов SU-DHL-4. Напротив, монотерапия ингибитором протеасомы (1 мг/кг, один раз в неделю) приводила к прогрессирующему росту опухоли, сравнимому с контролем. Несмотря на низкую активность обоих агентов при использовании отдельно, комбинированная терапия приводила к ремиссии ксенотрансплантатов лимфомы SU-DHL-4. Еженедельное введение антител B-HH6-B-KV1 GE (10 мг/кг) и инъекция ингибитора протеасом бортезомиба (один раз в неделю) приводили к регрессии лимфомы в течение первой недели, а при последующей комбинированной терапии наблюдалась полная ремиссия 4 из 9 опухолей SU-DHL-4 при отсутствии рецидива.

Пример 2

Определение соотношения связывающих активностей антител анти-CD20 типа II и ритуксимаба в отношении CD20 на клетках Raji (АТСС №ССL-86)

Клетки Raji (АТСС №ССL-86) культивировали в среде RPMI-1640 (фирма PanBiotech GmbH, Cat. №Р04-18500), содержащей 10% ЭТС (фирма Gibco, Cat. №10500-064). В антитела анти-CD20 типа II (B-HH6-B-KV1, гуманизированные антитела В-Ly1) и в ритуксимаб вводили метку с использованием моно-NHS-эфира Cy5 (фирма Amersham GE Healthcare, Cat. №РА 15101) по методике фирмы-производителя. Конъюгат ритуксимаб/Cy5 содержал 2,0 молекулы Cy5 в одной молекуле антитела. Конъюгат B-HH6-B-KV1/Cy5 содержал 2,2 молекулы Cy5 в одной молекуле антитела. Для определения и сравнения связывающих активностей и способа связывания обоих конъюгатов строили кривые связывания (титрованием Cy5-конъюгированного ритуксимаба и Cy5-конъюгированных антител B-HH6-B-KV1) методом прямой иммунофлуоресценции с использованием линии клеток Raji лимфомы Беркитта (АТСС №CCL-86). По величине средней интенсивности флуоресценции (СИФ) рассчитывали величину ЕС₅₀ (50% от максимальной интенсивности флуоресценции) Cy5/ритуксимаба и Cy5/антител B-HH6-B-KV1 соответственно. 5×10⁵ клеток в образце окрашивали в течение 30 мин при 4°С. Затем клетки промывали культуральной средой, для исключения погибших клеток использовали окрашивание пропидий иодидом. Измерения проводили на приборе FACSArray (фирма Becton Dickinson), Пропидий иодид регистрировали в дальней красной области А, а Cy5 в красной области А. Средние интенсивности флуоресценции (СИФ) для связывания при ЕС₅₀ (50% от максимума) приводятся на фиг.2 (Cy5/антитела B-HH6-B-KV1 - черный столбик, а Cy5/ритуксимаб - белый столбик).

Затем рассчитывали соотношение связывающих активностей в отношении CD20 на клетках Raji (АТСС №ССL-86) по следующей формуле:

соотношение связывающих активностей в отношении CD20 на клетках Raji (ATC №CCL-86) =

$$=\frac{207}{433}\times \frac{\mathrm{2,2}}{\mathrm{2,0}}=\mathrm{0,44}$$

Таким образом антитела B-HH6-B-KV1, т.е. типичные антитела анти-CD20 типа II, обладают пониженной связывающей активностью по сравнению с ритуксимабом.

Пример 3

Одинаковая противоопухолевая активность гликомодифицированных (GE) и немодифицированных (дикого типа) антител анти-CD20 (B-HH6-B-KV1 GE и дикого типа) в отношении ксенотрансплантатов Z138 MCL у мышей SCID с врожденным отсутствием клеток-киллеров

Анализируемые агенты

Антитела анти-CD20 типа II, B-HH6-B-KV1, (гликомодифицированные и дикого типа) получали в виде конц. раствора (с 9,4 мг/мл и 12,5 мг/мл) в буферном растворе, содержащем гистидин, трегалозу и полисорбат 20 (фирма GlycArt, Шлирен, Швейцария),

Перед инъекцией оба концентрированных раствора разбавляли в ФСБ.

Клеточные линии и условия культивирования

Клетки человека Z138 В-клеточной лимфомы не-Ходжкина (лимфома клеток мантийной зоны) получали от фирмы Glycart. Линию опухолевых клеток культивировали в стандартных условиях в среде DMEM (фирма РАА Laboratories, Австрия), содержащей 10% ЭТС (фирма РАА Laboratories, Австрия) и 2 мМ L-глутамин, при 37°С в насыщенной влажной атмосфере, содержащей 5% СО₂. Для трансплантации использовали клетки после двукратного пересева.

Животные

Самок мышей SCID с врожденным отсутствием клеток-киллеров возрастом 4-5 недель (полученных от фирмы Bomholtgard, Ry, Дания) после доставки выдерживали в специальных стерильных условиях в режиме 12 ч свет/12 ч темнота в соответствии с методическими рекомендациями (фирма GV-Solas, Felasa, TierschG). Протокол испытаний рассмотрен и утвержден местными административными органами. После доставки животных выдерживали в карантинном блоке вивария в течение одной недели для привыкания к новым условиям и для обследования. При этом проводили непрерывный контроль состояния здоровья при свободном доступе к корму (Provimi Kliba 3337) и воде (подкисленная до рН 2,5-3).

Обследование

Животных обследовали ежедневно на наличие клинических симптомов и проявление побочного действия. В течение эксперимента у животных дважды в неделю регистрировали массу тела и измеряли размер опухоли штангенциркулем после определения стадии заболевания.

Лечение животных

Лечение начинали в день рандомизации через 14 дней после трансплантации клеток. Исследуемым группам животных вводили гуманизированные антитела анти-CD20 (B-HH6-B-KV1 GE и дикого типа), а контрольной группе животных вводили соответствующий носитель, внутривенно, один раз в неделю, в день 14, 20, 27 и 34, в дозе 10 мг/кг.

Подавление роста опухоли in vivo

Контрольную группу животных, которым вводили носитель, исключали из эксперимента в день 19 после начала лечения из-за большой опухолевой массы. Лечение животных, которым еженедельно вводили B-HH6-B-KV1 (гликомодифицированные и дикого типа) в дозе 10 мг/кг, приводило к подавлению роста ксенотрансплантата сразу после начала лечения. После завершения контроля наблюдалась регрессия всех опухолей, обработанных антителами, а через некоторое время наблюдалась полная ремиссия ксенотрансплантатов опухоли Z138. При этом на указанной модели ксенотрансплантата не наблюдалось существенной разницы между действием антител дикого типа и гликомодифицированными анти-СD20 B-HH6-B-KV1. Такое явление вполне возможно, поскольку у таких мышей клетки NK не экспрессируют нативную форму рецептора Fc, и, кроме того, известно, что мыши SCID некомпетентны для NK-опосредованной АЗКОЦ из-за тяжелой формы тройного иммунодефицита. Следовательно, модели подкожного ксенотрансплантата у мышей SCID являются непригодными для имитации

АЗКОЦ, опосредованной гликомодифицированными антителами, в организме человека.

Группа изобретений раскрывает фармацевтическую композицию и набор, включающие антитела анти-CD20 типа II и ингибитор протеасомы, предназначенные для применения в лечении рака, экспрессирующего CD20. Также группа изобретений относится к применению антител анти-CD20 типа II для получения лекарственного средства, предназначенного для лечения рака, экспрессирующего CD20, в комбинации с ингибитором протеасомы. Группа изобретений характеризуется использованием антител, обладающих повышенной антитело-зависимой клеточно-опосредованной цитотоксичностью и эффективностью в терапии раковых заболеваний. 4 н. и 9 з.п. ф-лы, 3 ил., 4 табл., 3 пр.

1. Применение антител анти-СD20 типа II для получения лекарственного средства, предназначенного для лечения рака, экспрессирующего CD20, в комбинации с ингибитором протеасомы.

2. Применение антител анти-СD20 типа II для получения лекарственного средства, предназначенного для лечения пациента, страдающего от рака, экспрессирующего CD20, в комбинации с ингибитором протеасомы.

3. Применение по п.1, отличающееся тем, что ингибитор протеасомы характеризуется анти-протеасомной ингибирующей активностью с величиной IС₅₀ 5 мкМ или менее.

4. Применение по п.1, отличающееся тем, что соотношение связывающих активностей указанных антител анти-СD20 типа II и ритуксимаба в отношении CD20 на клетках Raji (ATCC №ССL-86) составляет от 0,3 до 0,6.

5. Применение по п.1, отличающееся тем, что указанные антитела анти-CD20 типа II являются гуманизированными антителами B-Lyl.

6. Применение по п.5, отличающееся тем, что указанные антитела анти-CD20 типа II обладают повышенной антитело-зависимой клеточно-опосредованной цитотоксичностью (АЗКОЦ).

7. Применение по п.5, отличающееся тем, что по меньшей мере 40% или более олигосахаридов в области Fc указанных антител анти-СD20 типа II являются нефукозилированными.

8. Применение по п.7, отличающееся тем, что указанный ингибитор протеасомы выбирают из группы, состоящей из альдегидов пептидов, выбранных из группы, включающей MG132, MG115, СЕР-1615, PSI, или иммунопротеасомоспецифичный ингибитор IPSI-001 (Cbz-LnL-CHO=N-карбобензилоксилейцилнорлейциналь), боронатов пептидов бортезомиба (PS-341) или DFLB, эпоксикетонов пептидов, выбранных из группы, включающей эпоксомицин, дигидроэпонемицин, производное эпоксомицина карфилзомиб (PR-171), пептидные винилсульфоны или салиноспорамида А.

9. Применение по п.7, отличающееся тем, что указанным ингибитором протеасомы является бортезомиб.

10. Применение по п.9, отличающееся тем, что пациенту вводят один или более других дополнительных цитотоксичных, химиотерапевтических или противоопухолевых агентов, или соединений, которые усиливают действие таких агентов.

11. Применение по п.9, отличающееся тем, что рак, экспрессирующий CD20, является В-клеточной лимфомой не-Ходжкина (ЛНХ).

12. Набор, включающий антитела анти-СD20 типа II и ингибитор протеасомы, предназначенный для комбинированного лечения пациента, страдающего от рака, экспрессирующего CD20.

13. Фармацевтическая композиция, включающая антитела анти-СD20 типа II и ингибитор протеасомы, предназначенная для применения при лечении рака, экспрессирующего CD20, причем указанная фармацевтическая композиция может также включать один или более фармацевтически приемлемых носителей.