ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ, ОБЛАДАЮЩАЯ ПРОТИВОГИПОКСИЧЕСКОЙ, НЕЙРОПРОТЕКТОРНОЙ И АНТИАМНЕСТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТЬЮ Российский патент 2013 года по МПК A61K38/06 A61P25/00 

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности, а именно к созданию нейротропного средства для лечения острых и хронических нарушений мозгового кровообращения, в том числе ишемического и геморрагического инсульта и других состояний и заболеваний, сопровождающихся снижением когнитивных функций.

Известен пептидный лекарственный препарат семакс (гептапептид-метионил-глутамил-гистидил-фенилаланил-пролил-глицил-пролин), который широко применяют в различных областях медицины (патент РФ 2251429 от 2005 г.).

Семакс используют в неврологии при острой и хронической недостаточности мозгового кровообращения и связанных с ней заболеваниях, в том числе при мозговом инсульте и его последствиях (Гусев Е.И., Скворцова В.И. Нейропротективная терапия ишемического инсульта. II. Вторичная нейропротекция. // Журн. неврол. и психиатр. им. С.С.Корсакова. Инсульт (прилож. к журн.). - 2002. - №6. - С.3-18).

Семакс несмотря на его высокую эффективность является с точки зрения синтеза достаточно труднодоступным соединением, т.к. представляет собой гептапептид, т.е содержит в своем составе семь аминокислотных остатков.

Исходя из изложенного возникает необходимость изыскания новых нейротропных средств пептидной природы.

Задачей настоящего изобретения является получение новых нейротропных средств пептидной природы, обладающих противогипоксической, нейропротекторной и антиамнестической активностью в сочетании с доступностью с точки зрения химического синтеза.

Поставленная задача достигается созданием фармацевтической композиции, обладающей противогипоксической, нейропротекторной и антиамнестической активностью, которая представляет собой смесь трипептидов: , и , взятых в равных соотношениях.

Фармацевтическая композиция может быть выполнена в виде лиофилизата, таблеток.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами. Принятые условные сокращения:

Boc - трет-бутилоксикарбонил

Bzl - бензил

Z - бензилоксикарбонил

Bu^t - трет-бутил

DCHA - дициклогексил амин

TFA - трифтруксусная кислота

ONP - паранитрофенил

ONSu - N-оксисукценил

ДМФ - диметилформамид

NMM - N-метилморфолин

Tos - паратолуолсульфонат

Пример 1. H-Lys-Asp-Glu-OH (KDE)

К охлажденному до -20°C раствору 48.5 г (150 ммоль) Boc-Asp (Bzl)-OH в 300 мл ДМФ добавляли 16.5 мл (150 ммоль) NMM и 19.5 мл (150 ммоль) iBuOCOCl и перемешивали в течение 15 минут. Смесь перемешивали при той же температуре 20 мин. Далее прибавляли охлажденный до -20°С раствор 74.5 гр (155 ммоль) аминокомпонента Н-Glu(Bzl)-OBzl·Tos в 200 мл ДМФ, содержащий 17 мл NMM (155 ммоль). Реакционную смесь перемешивали в течение 1 часа при -10°C, в течение 2 часов при комнатной температуре. Упаривали, остаток растворяли в этилацетате (500 мл) и последовательно промывали 5% раствором NaHCO₃, H₂O, 2% раствором H₂SO₄, H₂O (дважды по 200 мл каждого), упаривали, вновь упаривали с изопропиловым спиртом. К образовавшемуся маслу приливали 500 мл гексана и 50 мл эфира и образовавшееся масло затирали до образования твердых частиц. Продукт кристаллизуется в холодильнике. Осадок отфильтровывали, промывали на фильтре гексаном, сушили. Получено 89 г (89%) хроматографически однородного продукта.

19 г (30 ммоль) Boc-Asp(OBzl)-Glu(OBzl)₂ растворяли в 200 мл TFA, через час упаривали, остаток растворяли в 500 мл сухого DMF и прибавляли порциями Na₂CO₃ до прекращения выделения CO₂. Осадок отфильтровывали, промывали 100 мл DMF, прибавляли 3.33 мл (30 ммоль) N-метилморфолина и 15.36 г (30 ммоль) Z-Lys(Z)-ONSu и оставляли при комнатной темпиратуре на 15 часов. Реакционную смесь упаривали, образовавшися сиропообразный остатк растворяли в 300 мл этилацетата и промывали последовательно: 2% серной кислотой, водой до нейтральной реакции, 5% раствором соды и снова водой. Этиацетат упаривали и к маслообразному остатку прибавляли 500 мл изопропилового спирта, выдерживали 2 часа при +4°C, осадок отфильтровывали, промывали изопропиловым спиртом, эфиром, сушили. Выход Iб 21.6 г (90%) продукта.

21.6 г (27 ммоль) соединения 111, полученного, как описано выше, растворяют при нагревании в 0.5 л ледяной уксусной кислоты, добавляют 50 мл воды и гидрируют в присутствии 5 г палладиевого катализатора. Катализатор отфильтровывают и растворители упаивают. Кристаллизуют из смеси уксусная кислота - этанол. При необходимости продукт очищают ионообменной хроматографией на колонке с SP-сефадексом, наносят в воде, смывают 0.04 М пиридин-ацетатным буфером (pH 5.4). Фракции, содержащие искомое соединение, упаривают. Сиропобразный остаток растворяют в 300 мл воды, упаривают до половины объема, обрабатывают активированным углем и лиофилизуют. Получают 8.95 г (85%) I. Чистота продукта по данным ВЭЖХ более 95%. [α]=-32 (С=1;5% уксусная кислота)

Спектре ПМР:

Lys - 3.76 (α-СН); 1.72 (β-СН2); 1.36, 1.52 (γ-СН2); 2.74 (δ-СН2); 8.11 (NH2)

Asp - 4.63 (α-СН); 2.71, 2.54 (β-СН2); 8.68 (NH)

Glu - 4.19 (α-СН); 1.98, 1.78 (β-СН2); 2.28 (γ-СН2); 8.31 (NH)

Пример 2. H-Asp-Glu-Pro-OH (DEP)

17.5 г (100 ммоль) H-Glu(OBu^t)-OH растворяли (суспендировали) в метаноле, добавляли 50 мл 40% Triton В в метаноле и после полного растворения упаривали в вакууме. Остаток растворяли в 300 мл диметилфорамида, упаривали на четверть и прибавляли 42.0 г (100 ммоль) Z-Asp(OBu^t)-ONSu. Через 12 часов реакционную смесь упаривали, остаток растворяли в этилацетате, промывали последовательно 2% серной кислотой, водой, сушили над Na₂SO₄ упаривали. Остаток растворяли в 150 мл эфира прибавляли 20 мл (100 ммоль) дициклогексиламина и оставляли при комнатной температуре до полного выпадения осадка. Осадок отфильтровывали, промывали эфиром, высушивали на воздухе. Выход II 60 г (87%) в виде хроматографически однородного вещества.

28 г (40 ммоль) Z-Asp(OBu^t)Glu(OBu^t)-OH·DCHA суспендировали в 500 мл этилацетата, промывали 2% серной кислотой, водой, сушили над Na₂SO₄, осушитель отфильтровывали, фильтрат упаривали, остаток растворяли в 150 мл диметилформамида, охлаждали до -25°C, к охлажденному раствору добавляли 4.4 мл (40 ммоль) N-метилморфолина и 5.2 мл (40 ммоль) изо-бутилхлорформиата, выдерживали при -20°С в течение 15 минут и добавляли охлажденный до -25°C раствор 5.6 г (44 ммоль) N-гидроксисукцинимида 25°C в 50 мл диметилформамида. Через 30 минут добавляли раствор 10.6 г (44 ммоль) H-Pro-OBzl·HCl и 5 мл N-метилморфолина в 50 мл диметилформамида, и оставляли при комнатной температуре на ночь. Далее реакционную смесь упаривали, остаток растворяли в этилацетате и промывали обычным способом. Этилацетат упаривали, остаток упаривали с толуолом. Образовавшееся масло растворяли в TFA, выдерживали в течение часа, упаривали, остаток обрабатывали смесью эфир - гексан 1:1, выпавший осадок отфильтровывали, промывали на фильтре смесью эфир - гексан 1:1, сушили в эксикаторе над щелочью.

Полученный продукт растворяли в смеси этанол - вода - уксусная кислота (600:100:100) и гидрировали. Катализатор отфильтровывали, фильтрат упаривали. Остаток переосаждали из уксусной кислоты изопропиловым спиртом, фильтровали, промывали на фильтре изопропиловым спиртом, эфиром, сушили. Выход 12.2 г (85%). Чистота по данным ВЭЖХ более 95%. [α]=-58.6 (С=1; 5% уксусная кислота)

В спектре ПМР:

Asp - 4.13 (α-СН); 2.79, 2.66 (β-CH2); 8.14 (NH2)

Glu - 4.59 (α-СН); 1.93, 1.72 (β-СН2); 2.36 (γ-CH2); 8.67 (NH)

Pro - 4.23 (α-СН); 2.14, 1.84 (β-СН2); 1.90 (γ-СН2); 3.63 (δ-СН2)

Пример 3 H-Asp-Glu-Arg-OH(DER)

К раствору 104,4 г (228 ммоль) ZGlu(OtBu)ONP в 0,5 л диметилформамида, прибавляли 38,3 г (228 ммоль) H-Arg-OH. Реационную смесь перемешивали при комнатной температуре 24 часа. Затем выдерживали при t - 4°С четыре часа, образовавшийся осадок отфильтровывали и промывали на фильтре 0,4 л смеси диметилформамид-эфир (1:2), 0,45 л эфира, 0,4 л гексана. Сушили. Выход: -91.7 г (82,3%) хроматографически однородного ZGlu(OtBu)ArgOH (Контроль в системе: хлороформ-метанол-уксусная кислота (5:3:1)).

Раствор 90.6 г (185 ммоль) ZGlu(OtBut)ArgOH в 1,2 л этилового спирта гидрировали над 10 г 5% Pd/C. После окончания гидрирования [Контроль с помощью ТСХ в системе: хлороформ-метанол-уксусная кислота (5:3:1)], катализатор отфильтровывали, растворитель упаривали. Полученный сиропообразный продукт растворяли в 500 мл диметилформамида и к полученному раствору прибавляли 75.9 г (185 ммоль) Boc-Asp(OtBu)-ONP реакционную смесь оставляли при комнатной температуре на 15 часов до завершения реакции (контроль в системе: хлороформ-метанол-уксусная кислота (5:3:1)). Растворитель упаривали, образовавшееся масло растворяли в 150 мл хлороформа и наносим на колонку с силикагелем (400 г), промывали хлороформом до схода нитрофенола, 10% этиловым спиртом в хлороформе, смывали 30% этиловым спиртом в хлороформе, упаривали. (Контроль в системе: хлороформ-метанол-уксусная кислота (5:3:1).) К остатку проливали 400 мл трифторуксусной кислоты и смесь выдерживали 2 часа при комнатной температуре. Кислоту упаривали, к остатку приливали 1000 мл диэтилового эфира, образовавшийся аморфный осадок отфильтровывали, промывали на фильтре эфиром два раза по 150 мл мл и сушили. Вещество растворяли в 1500 мл воды, упаривали до масла, повторно растворяли в 1000 мл води и наносили на колонку с SP-сефадексом. Колонку промывали двумя объемами 0.05 М пиридин-ацетатного буфера и смывали вещество тем же 0.2 М буфером. Фракции, содержащие продукт, объединяли, растворители упаривали, повторно упаривали с водой для удаления остатков пиридин-ацетата и лиофилизовали. Получили 65 г (75%) продукта с чистотой по данным ВЭЖХ более 95%. [α]=-10.3 (С=1; 5% уксусная кислота)

В спектре ПМР:

Asp - 4.16 (α-СН); 2.82, 2.65 (β-СН2); 8.14 (NH2)

Glu - 4.35 (α-СН) 1.93, 1.87 (β-СН2); 2.30 (γ-СН2); 8.60 (NH)

Arg - 4.16 (α-СН); 1.75, 1.62 (β-СН2); 1.54, 1.50 (γ-СН2); 3.10 (δ-СН2); 7.58 (-NH); 8.28 (NH).

Пример 4. Получение фармацевтической композиции.

Трипептиды, полученные в соответствии с примерами 1-3, в количестве 2 г каждый растворяли в 100 мл стерильной апирогенной воды. Полученный раствор замораживают и подвергают лиофилизации. Полученный лиофилизат используют в дальнейшем при изучении фармакологической активности.

Фармакологические свойства полученной фармацевтической композиции были изучены экспериментально по известным методикам (Воронина Т.А., Неробкова Л.Н. Методические указания по изучению противосудорожной активности фармакологических веществ // Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ / Под редакцией Р.У.Хабриева - М., 2005. - С.277-294; Воронина Т.А., Островская Р.У. Методические указания по изучению ноотропной активности фармакологических веществ // Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ / Под редакцией Р.У.Хабриева - М., 2005. - С.308-320; Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ / Под редакцией Р.У.Хабриева - М., 2005. 832 с.)

В качестве препарата сравнения использовали семакс.

Пример 5. Противогипоксическое действие смеси пептидов на различных моделях острой гипоксии у мышей и крыс (табл.1-3)

Исследования выполнены на белых нелинейных мышах-самцах массой 24-28 г.

Острую нормобарическую гипоксическую гипоксию с гиперкапнией воспроизводили путем помещения мышей (поодиночке) в гермокамеру: животных сажали в стеклянные банки одинакового объема (250 см³), которые герметично закрывали. По мере потребления кислорода концентрация его в воздухе сосуда и в организме снижалась, а количество углекислого газа, наоборот, возрастало. В результате у животных развивалась острая гипоксическая гипоксия с гиперкапнией. Регистрировали с помощью секундомера продолжительность жизни мышей (до остановки дыхания) в гермокамере в минутах и по ее увеличению судили об эффективности испытанных веществ.

Острую гипобарическую гипоксию моделировали у мышей в проточно-вытяжной барокамере; животных поднимали со скоростью 50 м/с до "высоты" 11000 м. Регистрировали продолжительность жизни животных (с помощью секундомера до остановки дыхания) в барокамере.

Исследуемые вещества (новую смесь пептидов и препарат сравнения семакс) и изотонический раствор натрия хлорида (контроль) вводили внутрибрюшинно за 60 минут до опыта.

Также исследовали действие новой смеси пептидов на длительность жизни в условиях аноксии у белых нелинейных крыс-самцов массой 180-250 г (после отключения дыхательного аппарата у обездвиженных миорелаксантом животных). Для этого выключали дыхательный аппарат и регистрировали время исчезновения электрокардиограммы (ЭКГ).

Исследуемые вещества (новую смесь пептидов и препарат сравнения семакс) и изотонический раствор натрия хлорида (контроль) вводили внутрибрюшинно за 2 часа до отключения дыхательного аппарата.

На модели острой нормобарической гипоксической гипоксии с гиперкапнией (в гермокамере) было обнаружено, что новая смесь пептидов в дозах 10, 50 и 150 мкг/кг значимо (p<0,05) увеличивала продолжительность жизни мышей в гермокамере на 39%, 57% и 61% соответственно (табл.1).

Препарат сравнения семакс в дозах 10, 50 и 150 мкг/кг достоверно не изменял продолжительность жизни мышей в гермокамере.

По выраженности действия новая смесь пептидов в дозах 10 и 50 мкг/кг значимо (p<0,05) превосходила препарат сравнения семакс (10 и 50 мкг/кг) в 1,3 и 1,5 раза соответственно.

На модели острой гипобарической гипоксии было установлено, что новая смесь пептидов в дозе 10 мкг/кг достоверно не изменяла, а в дозах 50 и 150 мкг/кг значимо (p<0,01) увеличивала продолжительность жизни мышей при острой гипобарической гипоксии на 69% и 95% соответственно (табл.2).

Препарат сравнения семакс в дозах 10 и 150 мкг/кг значимо не изменял продолжительность жизни мышей, а в дозе 50 мкг/кг увеличивал ее на 74% (p<0,05).

По выраженности действия новая смесь пептидов в дозе и 150 мкг/кг значимо (p<0,01) превосходила препарат сравнения семакс (150 мкг/кг) в 1,9 раза.

Было установлено, что в условиях аноксии (после отключения дыхательного аппарата у обездвиженных миорелаксантом крыс) новая смесь пептидов в дозе 50 мкг/кг значимо (p<0,01) увеличивала продолжительность жизни животных (определяемую по сохранению ЭКГ) в 2,9 раза (табл.3). Препарат сравнения семакс (50 мкг/кг) также значимо (p<0,01) увеличивал этот показатель на 106%. При этом по выраженности действия новая смесь пептидов в дозе 50 мкг/кг значимо (p<0,01) превосходит семакс в 1,4 раза.

Пример 6. Нейропротекторное действие новой смеси пептидов на модели ишемического инсульта у крыс (табл.4)

Исследования выполнены на белых нелинейных крысах-самцах массой 220-280 г, содержащихся в виварных условиях, у которых моделировали ишемический инсульт.

Исследовали нейропротекторное действие новой смеси пептидов у крыс с экспериментальной ишемией головного мозга. Ишемию головного мозга у крыс воспроизводили путем одномоментной перевязки (под общей анестезией эфиром) обеих общих сонных артерий. У ложнооперированных животных (контрольная группа №1) операция была ограничена этапом доступа к общим сонным артериям. В контрольной группе №2 крысы получали только изотонический раствор натрия хлорида. В подопытных группах животным вводили внутрибрюшинно новую смесь пептидов и препарат сравнения семакс 1 раз в сутки в течение 7 суток; в первые сутки - через 1 и 3 часа после операции. Животных после операции наблюдали в течение 2 недель с учетом выживаемости крыс. Неврологический дефицит (НД) у животных определяли (слепым методом) по шкале McGraw et al. (McGraw C.P., Pashayan A.G., Wendel O.T. Cerebral infarction in the Mongolian gerbil exacerbated by phenoxybenzamine treatment // Stroke. - 1976 - Vol.7, No 5. - P.485-488) в баллах, каждый час в течение 24 часов, а затем 1 раз в сутки. Тяжесть состояния определяли по сумме соответствующих баллов. У ложнооперированных животных неврологический дефицит отсутствовал.

Результаты исследования нейропротекторного действия новой смеси пептидов и препарата сравнения семакса представлены в табл.4. Из нее видно, что у крыс контрольной группы №2 НД был наиболее выражен (8,9±0,1 балла) через 2 и 3 суток после двусторонней перевязки общих сонных артерий; при этом в контроле погибло 24% (22 крысы из 90) животных.

Было обнаружено, что новая смесь пептидов в дозах 150 и 300 мкг/кг/сут значимо (p<0,05) уменьшала летальность крыс с 24% (контроль) до 10% и 4% соответственно. Кроме того, в обоих случаях достоверно уменьшался и НД (табл.4).

Семакс в дозах 150 и 300 мкг/кг/сут уменьшал летальность крыс с 24% (контроль) до 13% (p>0,05) и 7% (p<0,05) соответственно, а также НД (табл.4).

При этом в отношении летальности новая смесь пептидов достоверно не превосходила семакс. Однако по выраженности действия на НД новая смесь пептидов (в дозе 150 мкг/кг/сут в большинстве случаев наблюдения, а в дозе 300 мкг/кг/сут - на 2- и 3-и сутки) значимо (р<0,05) превосходила семакс в 1,1 раза (табл.4).

Пример 7. Антиамнестическое действие новой смеси пептидов на разных моделях амнезии у крыс и мышей (табл.5-6)

Влияние композиции новой смеси пептидов на процессы обучения и памяти исследовали на белых нелинейных мышах-самцах (массой 20-24 г), используя условную реакцию (рефлекс) пассивного избегания (УРПИ) электрокожного раздражения В настоящее время тест УРПИ является базисной моделью для оценки влияния веществ на формирование и воспроизведение памятного следа в норме и в условиях его нарушения (амнезия), а также наиболее информативным из применяемых сегодня методов оценки эффективности веществ с ноотропной активностью (Воронина Т.А., Островская Р.У. Методические указания по изучению ноотропной активности фармакологических веществ // Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ / Под редакцией Р.У.Хабриева - М., 2005. - С.308-320).

Выработку УРПИ у мышей производили на основе электрокожного подкрепления по методу Cumin et al. (Cumin R., Bandle E.F., Gamzu E., Haefely W.E. Effect of the novel compound antiracetam (Ro 13-5057) upon impared learning and memory in rodents // Psychopharmacol. - 1982. - Vol.78. - P.104-111) с учетом рекомендаций Mondadori et al. (Mondadori C., Bhatnagar A., Borkovski J., Häusler A. Involvement of a steroidal component in the mechanism of action of piracetam-like nootropics // Brain Res. - 1990. - Vol.506 - P.101-108).

Установка для мышей представляет собой экспериментальную камеру черного цвета размером 30×40×30 см с электродным полом и белой пластиковой платформой (7,5×7,5×0,5 см), которую располагали на полу в центре камеры. Мышей (поодиночке) помещали на пластиковую платформу.

Обычно животные спускаются (или спрыгивают) с платформы на электродный пол, где они получают «наказание» - удар электрическим током (в это время на пол камеры подавали постоянный электрический ток силой 0,5 мА). Электрический ток включали только тогда, когда мышь касалась пола всеми четырьмя конечностями. Обычной реакцией животных бывает возвращение на безопасную платформу. После 5 минут обучения у мышей вырабатывается УРПИ - они остаются на платформе. Тестирование на сохранность УРПИ проводили через 24 часа после амнезирующего воздействия. При этом, если животное покидало платформу в течение 1 минуты, у него отмечали ретроградную амнезию УРПИ.

Также проводили тест УРПИ у крыс. Выработку УРПИ у нелинейных белых крыс-самцов (возраст 2-3 месяца, масса 180-220 г) производили в установке, представляющей собой темную камеру размером 40×40×40 см с электродным полом. Темная камера была соединена через квадратную гильотинную дверцу размером 6×6 см с навесной платформой размером 25×7 см. Навесная платформа освещалась лампой (мощность 60 Вт), расположенной на высоте 40 см. Темная камера располагалась на лабораторном столе, а платформа висела над полом на высоте 1 м. Крысу сажали на ярко освещенную платформу хвостом к открытой гильотинной двери, ведущей в темную камеру. Вследствие норкового рефлекса после нахождения входа в темный отсек камеры крыса переходила в темный отсек. Регистрировали латентный период (ЛП) выполнения этого навыка. Затем крысу оставляли на 180 секунд (с) в темной камере с целью ее освоения, и животное почти все время проводило в темной камере. По истечении 180 с осуществляли обучение. С этой целью в момент, когда крыса находилась в темном отделении, отверстие закрывали и наносили животному однократное неизбегаемое электроболевое раздражение через пол (сила обучающего тока 0,6 мА). После получения болевого раздражения (обучение) крыса выскакивала из темного отсека на освещенную платформу. Следовательно, животное было обучено тому, что в темной камере оно получает болевое раздражение и помнит об этом. Крысу снимали с платформы и помещали в обычную клетку. Тест на воспроизведение обученного проводили через 24 часа после обучения, для чего крысу опять сажали на платформу хвостом к отверстию и регистрировали ЛП захода животного в темное отделение, а также число животных (в течение 180 с), совсем не зашедших в опасный темный отсек и остававшихся на освещенной висячей платформе (крысы, хорошо помнящие ситуацию). В качестве амнезирующего воздействия использовали м-холиноблокатор скополамин (2,0 мг/кг внутрибрюшинно за 15 минут до обучения УРПИ). Исследуемые вещества (новую смесь пептидов и препарат сравнения семакс) и изотонический раствор натрия хлорида (контроль) вводили внутрибрюшинно за 1 час до обучения крыс.

У мышей в качестве амнезирующего воздействия использовали электросудорожный шок (ЭСШ; параметры электрического тока: 50 Гц, 50 мА, 0,3 с), который наносили мышам с помощью электродов в виде клипс, фиксируемых на ушных раковинах (транспиннеально), сразу после обучения УРПИ (Воронина Т.А., Неробкова Л.Н. Методические указания по изучению противосудорожной активности фармакологических веществ // Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ / Под редакцией Р.У.Хабриева - М., 2005. - С.277-294; Воронина Т.А., Островская Р.У. Методические указания по изучению ноотропной активности фармакологических веществ // Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ / Под редакцией Р.У.Хабриева - М., 2005. -С.308-320). У животных контрольной группы вызывали псевдоЭСШ.

Исследуемые вещества (новую смесь пептидов и препарат сравнения семакс) и изотонический раствор натрия хлорида (контроль) вводили внутрибрюшинно в период генерализованных судорог, вызванных ЭСШ, т.е. непосредственно после ЭСШ. Тестирование мышей на сохранение УРПИ производили через 24 часа после ЭСШ.

Антиамнестическое действие новой смеси пептидов на модели амнезии, вызванной плаванием мышей в холодной воде с одновременным вращением колеса до изнеможения, исследовали на белых нелинейных мышах-самцах массой 20-24 г с применением выработки у животных УРПИ (описанной выше). Животных (поодиночке) помещали в заполненный водой пластиковый ящик размером 17×9×19 см с вращающимся ребристым колесом. Плавание мышей в холодной воде с одновременным вращением колеса до изнеможения (ПМХВ) применяли сразу после обучения УРПИ. Сохранение УРПИ проверяли через 24 часа после окончания ПМХВ. Исследуемые вещества (новую смесь пептидов и препарат сравнения семакс) и изотонический раствор натрия хлорида (контроль) вводили внутрибрюшинно за 30 минут до обучения мышей. В качестве ложного ПМХВ использовали помещение животных в мокрые холодные опилки.

На модели скополаминовой амнезии у крыс установлено, что при помещении на освещенную платформу крысы с коротким ЛП заходили в темную камеру. При воспроизведении рефлекса через 24 часа после обучения крысы без амнезии помнят обученное и при помещении их на освещенную платформу остаются там основное время эксперимента (167±11 с) и не заходят в темную опасную камеру, где они накануне получили болевое раздражение (обучение) (табл.5).

Скополамин достоверно укорачивал ЛП захода в темную камеру при воспроизведении (в 2,4 раза, p<0,001) и значимо (p<0,001) уменьшал число животных (с 85% до 20%), совсем не зашедших в темный отсек камеры, т.е. помнящих о нанесенном там накануне аверсивном стимуле (табл.5). Эти показатели характеризуют выраженную амнезию.

Новая смесь пептидов в дозе 50 мкг/кг значимо увеличивала ЛП (в 2 раза, p<0,01) захода в темный отсек при воспроизведении и число животных (в 4 раза, p<0,001), не зашедших в темный отсек камеры, т.е. помнящих о нанесенном аверсивном стимуле (табл.5). В дозе 150 мкг/кг новая смесь пептидов также оказывала выраженное антиамнестическое действие: наблюдалось значимое (p<0,001) увеличение ЛП (в 2,1 раза) захода в темную камеру при воспроизведении и процента животных (в 3,8 раза), не зашедших в темную камеру (табл.5). Эти данные свидетельствуют о выраженном достоверном антиамнестическом эффекте новой смеси пептидов в дозах 50 и 150 мкг/кг.

Препарат сравнения семакс в дозах 10 и 50 мкг/кг достоверно не влиял на ЛП захода в темный отсек, но в дозе 150 мкг/кг значимо (p<0,05) увеличивал ЛП в 1,5 раза. Препарат во всех дозах значимо (p<0,05) увеличивал число животных (в 3,2, 3,4 и 3,8 раза соответственно), туда не зашедших. Это свидетельствует о наличии у семакса антиамнестической активности.

Таким образом, заявленная смесь пептидов в дозах 50 и 150 мкг/кг дает выраженный антиамнестический эффект на данной модели амнезии. Препарат сравнения семакс также обладает антиамнестической активностью. При этом следует подчеркнуть, что новая смесь пептидов (50 и 150 мкг/кг) по влиянию на ЛП захода в темную камеру значимо (p<0,05) превосходит семакс (50 и 150 мкг/кг) в 1,5 и 1,4 раза соответственно.

На модели амнезии у мышей, вызванной ЭСШ, было обнаружено, что через 24 часа после воздействия ЭСШ у большинства (83%, p<0,001) мышей наблюдалась ретроградная амнезия УРПИ (табл.6). Новая смесь пептидов в дозах 50 и 150 мкг/кг почти полностью предупреждала развитие амнезии УРПИ.

Семакс (50 и 150 мкг/кг) существенно не влиял на амнезию УРПИ и по выраженности действия значимо (p<0,05) уступал новой смеси пептидов по этому тесту в 4 раза.

На модели амнезии у мышей, вызванной ПМХВ, было обнаружено, что через 24 часа после ПМХВ у большей части (62%, p<0,001) мышей наблюдалась ретроградная амнезия УРПИ. Новая смесь пептидов в дозах 50 и 150 мкг/кг полностью или почти полностью предупреждала развитие амнезии УРПИ (табл.6).

Препарат сравнения семакс в дозе 50 мкг/кг полностью предупреждал развитие амнезии УРПИ, а в дозе 150 мкг/кг существенно не влиял на амнезию.

Следует подчеркнуть, что новая смесь пептидов (150 мкг/кг) по выраженности действия значимо (p<0,05) превосходит семакс (150 мкг/кг) в 2,9 раза.

Таким образом, новая смесь пептидов способна полностью или почти полностью предупреждать развитие амнезии УРПИ, вызванной у мышей как ЭСШ, так и ПМХВ, значимо превосходя семакс. При этом семакс эффективен только на последней модели амнезии.

Пример 8. Влияние смеси пептидов на обучение у крыс по тесту условной реакции (рефлекса) активного избегания (табл.7)

Выработку условной реакции /рефлекса/ активного избегания (УРАИ) производили у нелинейных белых крыс-самцов массой 200-250 г в челночной камере, представляющей собой ящик с электродным полом, разделенный перегородкой на 2 равных отсека с абсолютно одинаковыми условиями для крысы. В перегородке имеется отверстие, через которое крыса может перейти из одного отсека в другой. Животное помещают в один из отсеков прибора и подают условный сигнал - звук. Затем обычно через 5 с подают безусловный раздражитель - электрический ток силой 0,45 мА на пол камеры. Крыса может избежать удара током, перебежав в другой отсек прибора. Если этого не происходит, оба сигнала выключают. Затем процедуру повторяют 25 раз для каждой крысы в течение 5 суток. Для оценки процесса выработки рефлекса регистрировали число реакций на безусловный раздражитель (безусловный рефлекс), число реакций на условный раздражитель (условный рефлекс) и число межсигнальных реакций-переходов в другой отсек без подачи раздражителей.

Исследуемые вещества (новую смесь пептидов и препарат сравнения семакс) и изотонический раствор натрия хлорида (контроль) вводили внутрибрюшинно за 30 минут до выработки УРАИ каждый день в течение 5 суток.

Было установлено, что у животных контрольной группы к 2-3 суткам эксперимента на фоне большого числа межсигнальных реакций надежно вырабатывается натуральный условный рефлекс (реакция на раздражение электрическим током), а к 5 суткам у 54% крыс образуется истинный рефлекс на условный раздражитель при снижении числа межсигнальных реакций (табл.7).

Препарат сравнения семакс (50 мкг/кг) вызывал улучшение выработки УРАИ по всем показателям (выработку рефлекса на условный раздражитель, уменьшение числа межсигнальных реакций).

Новая смесь пептидов в дозе 15 мкг/кг (т.е. 3,3 раза меньшей, чем у семакса) улучшала выработку УРАИ по сравнению с семаксом, действуя более выражено и быстрее. При этом по числу межсигнальных и условных реакций в последние сутки опыта новая смесь пептидов в дозе 15 мкг/кг значимо (p<0,01) превосходила семакс (50 мкг/кг) в 19 и 1,4 раза соответственно.

Таким образом, можно заключить, что новая смесь пептидов улучшает обучение УРАИ, проявляя свойства ноотропов, превосходя в этом отношении семакс.

Пример 9. Электрофизиологическое исследование влияния смеси пептидов на транскаллозальные вызванные потенциалы сенсомоторной коры крысы (табл.8)

Как известно, электрофизиологическим коррелятом межполушарной передачи информации через мозолистое тело является транскаллозальный вызванный потенциал (ТКВП), причем по его изменению (увеличению) можно судить о способности ноотропных веществ облегчать передачу информации между полушариями мозга (Воронина Т.А., Неробкова Л.Н. Методические указания по изучению противосудорожной активности фармакологических веществ // Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ / Под редакцией Р.У.Хабриева - М., 2005. - С.277-294).

Исследования были выполнены на обездвиженных миорелаксантами (дитилин в дозе 3-5 мг/кг/час внутривенно небольшими порциями каждые 15-20 минут) нелинейных белых крысах-самцах массой 180-250 г, находящихся на искусственной вентиляции легких. Все хирургические манипуляции осуществляли под общей анестезией эфиром. ТКВП регистрировали через 2 ч после операции по известной методике (Воронина Т.А., Неробкова Л.Н. Методические указания по изучению противосудорожной активности фармакологических веществ // Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ / Под редакцией Р.У.Хабриева - М., 2005. - С.277-294).

Анализ ТКВП (усредняя 20 реализаций) проводили с помощью аналитико-регистрирующего комплекса на базе ПЭВМ Pentium IV (снабженного пакетом оригинальных специализированных программ). Исследуемые вещества (новую смесь пептидов и препарат сравнения семакс) и изотонический раствор натрия хлорида (контроль) вводили внутрибрюшинно через катетер.

Было установлено, что новая смесь пептидов и препарат сравнения семакс в дозе 50 мкг/кг достоверно увеличивают амплитуду ТКВП на 28% и 69% соответственно. По выраженности действия новая смесь пептидов значимо (p<0,01) превосходит семакс в 1,3 раза.

Необходимо подчеркнуть, что новая смесь пептидов оказывает более длительное действие - 44±3 минуты, чем семакс (32±3 минуты). По этому показателю новая смесь пептидов значимо (p<0,02) превосходит семакс в 1,4 раза.

Можно сделать вывод о том, что новая смесь пептидов и семакс достоверно увеличивают амплитуду ТКВП сенсомоторной коры крысы. Это свидетельствует об их способности облегчать межполушарную передачу информации через мозолистое тело. При этом по выраженности и длительности действия новая смесь пептидов значимо превосходит семакс.

Таким образом, проведенный анализ полученных данных показал, что на разных моделях по эффективности новая смесь пептидов или превосходит, или не уступает препарату сравнения семаксу. Следовательно, новая смесь пептидов расширяет арсенал нейротропных средств для лечения острых и хронических нарушений мозгового кровообращения, в том числе ишемического и геморрагического инсульта и других состояний и заболеваний, сопровождающихся снижением когнитивных функций.

Таблица 1 Влияние новой смеси пептидов и препарата сравнения семакса на продолжительность жизни мышей при острой нормобарической гипоксической гипоксии с гиперкапнией (в гермокамере) (М±m) Вещество (доза, мкг/кг) Число мышей Продолжительность жизни, минуты Изотонический раствор натрия хлорида (контроль) 14 28±2 Новая смесь пептидов (10) 10 39±4*^# Новая смесь пептидов (50) 10 44±5*^# Новая смесь пептидов (150) 10 45±4* Семакс (10) 9 29±2 Семакс (50) 10 30±4 Семакс (150) 10 37±4 Примечание. Различия статистически значимы по сравнению с контролем и семаксом соответственно (критерий Стьюдента): * или # - р<0,05.

Таблица 2 Влияние новой смеси пептидов и препарата сравнения семакса на продолжительность жизни мышей при острой гипобарической гипоксии (М±m) Вещество (доза, мкг/кг) Число мышей Продолжительность жизни, минуты Изотонический раствор натрия хлорида (контроль) 12 4,2±0,5 Новая смесь пептидов (10) 8 5,5±1,1 Новая смесь пептидов (50) 8 7,1±0,6*** Новая смесь пептидов (150) 10 8,2±0,7***^### Семакс (10) 8 5,0±0,9 Семакс (50) 8 7,3±1,1* Семакс (150) 10 4,3±0,5 Примечание. Различия статистически значимы по сравнению с контролем и семаксом соответственно (критерий Стьюдента): * или # - р<0,05, *** или ### - р<0,01.

Таблица 3 Влияние новой смеси пептидов и препарата сравнения семакса на продолжительность жизни крыс (по сохранению ЭКГ) после отключения дыхательного аппарата (М±m) Вещество (доза, мкг/кг) Число крыс Продолжительность жизни, минуты Изотонический раствор натрия хлорида (контроль) 8 8,7±1,1 Новая смесь пептидов (50) 10 25,3±1,5***^### Семакс (50) 10 17,9±1,3*** Примечание. Различия статистически значимы по сравнению с контролем и семаксом соответственно (критерий Стьюдента): *** или ### - р<0,01.

Таблица 4 Изменение неврологического дефицита (в баллах, М±m) у крыс после двусторонней перевязки общих сонных артерий под влиянием новой смеси пептидов №2 («ЦНС - ноотропы») и препарата сравнения семакса Вещество (доза, мкг/кг/сут) Срок после операции (часы /ч/, сутки /сут/) 12 ч 24 ч 2 сут 3 сут 5 сут 7 сут 10 сут 14 сут Изотонический раствор натрия хлорида (контроль) /n=68, погибло 22 из 90/ 8,6±0,1 8,8±0, 1 8,9±0,1 8,9±0, 1 8,8±0,1 8,7±0, 1 8,6±0,1 8,6±0,1 Новая смесь пептидов (150) /n=18, погибло 2 из 20/ 4,9±0,1^*# 5,0±0,1^*# 5,5±0,1^*# 5,5±0,1^*# 5,3±0,1^*# 5,1±0,1^*# 5,0±0,1^* 4,9±0,1^* Новая смесь пептидов (300) /n=22, погибла 1 из 23/ 4,7±0,1^* 4,8±0,1^* 5,2±0,1^*# 5,2±0,1^*# 5,1±0,1^* 4,9±0,1^* 4,8±0,1^* 4,7±0,1^* Семакс (150) /n=20, погибло 3 из 23/ 5,2±0,1^* 5,6±0,1^* 5,8±0,1^* 5,8±0,1^* 5,6±0,1^* 5,4±0,1^* 5,2±0,1^* 5,1±0,1^* Семакс (300) /n=26, погибло 2 из 28/ 4,8±0,1^* 4,9±0,1^* 5,5±0,1^* 5,5±0,1^* 5,2±0,1^* 5,1±0,1^* 5,0±0,1^* 4,9±0,1^* Примечание. * - p<0,05 - значимость различий по сравнению с контролем; # - p<0,05 - значимость различий по сравнению с семаксом (критерий Стьюдента).

Таблица 5 Влияние новой смеси пептидов и препарата сравнения семакса на амнезию у крыс, вызванную скополамином Условия опытов и вещество (доза, мкг/кг) Общее число крыс Латентный период воспроизведения УРПИ после обучения, секунды (М±m) Число крыс, не зашедших в темную камеру (%) Изотонический раствор натрия хлорида + изотонический раствор натрия хлорида (контроль 1) 20 167±11 17 (85) Изотонический раствор натрия хлорида + скополамин (контроль 2) 20 68±9^$$$ 4 (20)°°° Новая смесь пептидов (50) + скополамин 20 139±16^##□ 16 (80)*** Новая смесь пептидов (150) + скополамин 20 142±13^###□ 15 (75)*** Семакс (10) + скополамин 8 84±21^$ 5 (63)* Семакс (50) + скополамин 12 91±9^$$ 8 (67)* Семакс (150) + скополамин 17 101±11^$$# 13 (76)*** Примечание. Различия статистически значимы по сравнению с контролем 1, контролем 2 и семаксом соответственно (критерий Стьюдента): $, # или ^□ - p<0,05, $$ или ## - p<0,01, $$$ или ### - p<0,001; значимость различий по сравнению с контролем 1 и контролем 2 соответственно (точный метод Фишера): ° или * - p<0,05, °°° или *** - p<0,001.

Таблица 6 Влияние новой смеси пептидов и препарата сравнения семакса на амнезию у мышей, вызванную электросудорожным шоком (ЭСШ) и плаванием мышей в холодной воде с одновременным вращением колеса до изнеможения (ПМХВ) Условия опытов и вещество (доза, мкг/кг) Общее число мышей Число мышей, обучившихся УРПИ (%) Число мышей с амнезией УРПИ через 24 часа после амнезирующего воздействия (%) Электросудорожный шок (ЭСШ) Изотонический раствор натрия хлорида + псевдоЭСШ (контроль 1) 36 33 (92) 6 (18) Изотонический раствор натрия хлорида + ЭСШ (контроль 2) 33 30 (91) 25 (83)°°° Новая смесь пептидов (50) + ЭСШ 11 10 (91) 2 (20)***^□ Новая смесь пептидов (150) + ЭСШ 11 10 (91) 2 (20)***^□ Семакс (50) + ЭСШ 11 10 (91) 8 (80)°°° Семакс (150) + ЭСШ 11 10 (91) 8 (80)°°° Плавание мышей в холодной воде с одновременным вращением колеса до изнеможения (ПМХВ) Изотонический раствор натрия хлорида + ложное ПМХВ (контроль 1) 58 53 (91) 9 (17) Изотонический раствор натрия хлорида + ПМХВ (контроль 2) 60 55 (92) 34 (62)°°° Новая смесь пептидов (50) + ПМХВ 11 10 (91) 2 (20)** Новая смесь пептидов (150) + ПМХВ 21 20 (95) 3(15)***^□ Семакс (50) + ПМХВ 13 12 (92) 2 (17)*** Семакс (150) + ПМХВ 20 18 (90) 8 (44) Примечание. Различия статистически значимы по сравнению с контролем 1, контролем 2 и семаксом соответственно (точный метод Фишера): °, * или ^□ - p<0,05, °° или ** - p<0,01, °°° или *** - p<0,001.

Таблица 7 Влияние новой смеси пептидов и препарата сравнения семакса на выработку условной реакции (рефлекса) активного избегания (УРАИ) в челночной камере в последние сутки опыта Вещество (доза, мкг/кг) Число крыс Число межсигнальных реакций Число безусловных реакций Число условных реакций Изотонический раствор натрия хлорида (контроль) 8 65±5 47±4 53±4 Новая смесь пептидов (15) 10 1,0±0,2***^### 99±8*** 95±5***^### Семакс (50) 10 19±2*** 91±9*** 67±5* Примечание. Различия статистически значимы по сравнению с контролем и семаксом (критерий Стьюдента) соответственно: * или # - p<0,05, *** или ### - p<0,01.

Таблица 8 Влияние новой смеси пептидов и препарата сравнения семакса на амплитуду транскаллозальных вызванных потенциалов сенсомоторной коры крысы (М±m) Вещество (доза, мкг/кг) Число крыс Изменение амплитуды (в % к исходной) Изотонический раствор натрия хлорида (контроль) 8 100±1 Новая смесь пептидов (50) 10 169±8***^### Семакс (50) 10 128±3*** Примечание. Различия статистически значимы по сравнению с контролем и семаксом (критерий Стьюдента) соответственно: *** или #### - p<0,01.

Изобретение относится к медицине и касается фармацевтической композиции, обладающей противогипоксической, нейропротекторной и антиамнестической активностью, представляющей собой смесь трипептидов: , и , взятых в равных соотношениях. Фармацевтическая композиция может быть выполнена в виде лиофилизата, таблеток. Изобретение обеспечивает эффективность, которая или превосходит, или не уступает препарату сравнения семаксу на разных моделях заболеваний. 1 з.п. ф-лы, 8 табл., 9 пр.

1. Фармацевтическая композиция, обладающая противогипоксической, нейропротекторной и антиамнестической активностью, характеризующаяся тем, что она представляет собой смесь трипептидов: , и , взятых в равных соотношениях.

2. Фармацевтическая композиция по п.1 может быть выполнена в виде лиофилизата таблеток.