ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ, ОБЛАДАЮЩАЯ ПРОТИВОГИПОКСИЧЕСКОЙ, НЕЙРОПРОТЕКТОРНОЙ И АНТИАМНЕСТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТЬЮ И ПОВЫШАЮЩАЯ ФИЗИЧЕСКУЮ РАБОТОСПОСОБНОСТЬ Российский патент 2011 года по МПК A61K38/08 A61K31/14 A61P25/28 A61P9/10 

Изобретение относится к созданию фармацевтической композиции с широким спектром фармакологической активности, а именно обладающей противогипоксической, нейропротекторной и антиамнестической активностью, а также способной повышать физическую работоспособность.

Одной из актуальных проблем современной медицины является разработка эффективных средств защиты центральной нервной системы за счет активизации различных метаболических процессов мозга. Актуальность разработки новых лекарственных средств, обладающих выраженной нейропротекторной активностью, определяется, в частности, высокой смертностью при инсульте.

Известен оригинальный отечественный лекарственный препарат семакс (гептапептид метионил-глутамил-гистидил-фенилаланил-пролил-глицил-пролин), обладающий высокой нейропротекторной активностью (И.П.Ашмарин и соавт., 2005; А.Г.Чучалин и соавт. /ред./, 2008).

Известно лекарственное средство холина альфосцерат (ноотроп с холиностимулирующими свойствами, в составе которого содержится 40,5% метаболически защищенного холина; обеспечивает синтез ацетилхолина и фосфатидилхолина в мембране нейронов, улучшает синаптическую передачу, пластичность, функционирование рецепторов, мозговой кровоток и усиливает метаболические процессы в мозге, активирует ретикулярную формацию ствола мозга), которое обладает аналогичной активностью (А.А.Скоромец, В.В.Ковальчук, 2007; А.Г.Чучалин и соавт. /ред./, 2008; Onishchenko et al., 2008).

В настоящее время семакс и холина альфосцерат широко применяют в неврологии при острой и хронической недостаточности мозгового кровообращения и связанных с ней заболеваниях, в том числе при мозговом инсульте и его последствиях (Е.И.Гусев, В.И.Скворцова, 2001; А.Г.Чучалин и соавт. /ред./, 2008; Di Perri et al., 1991; Pametti et al., 2001). Однако в клинике семакс и холина альфосцерат не всегда эффективны (Е.И.Гусев, В.И.Скворцова, 2001; Parnetti et al., 2001; Mandat et al., 2003).

В связи с изложенным задачей настоящего изобретения является расширение арсенала лекарственных средств, обладающих выраженной нейропротекторной активностью в сочетании с противогипоксической и антиамнестической активностью и способностью повышать физическую работоспособность.

Поставленная цель достигается созданием фармацевтической композиции, которая содержит в качестве активных компонентов семакс и холина альфосцерат при следующем содержании компонентов в мг/кг:

семакс 0,025-0,3 холина альфосцерат 800,0

Противогипоксическое действие композиции семакса и холина альфосцерата на модели острой нормобарической гипоксической гипоксии с гиперкапнией (в гермокамере) исследовали на белых нелинейных мышах-самцах массой 20-25 г по известной методике, описанной в «Руководстве по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ» (2000).

Острую нормобарическую гипоксическую гипоксию с гиперкапнией воспроизводили путем помещения мышей (поодиночке) в гермокамеру: животных сажали в стеклянные банки одинакового объема (250 см³), которые герметично закрывали. По мере потребления кислорода концентрация его в воздухе сосуда и в организме снижалась, а количество углекислого газа, наоборот, возрастало. В результате у животных развивалась острая гипоксическая гипоксия с гиперкапнией. Регистрировали с помощью секундомера продолжительность жизни мышей (до остановки дыхания) в гермокамере в минутах (с точностью до 0,1 минуты /мин/) и по ее увеличению судили об эффективности испытанных фармакологических веществ. Исследуемые вещества и изотонический раствор натрия хлорида (контроль) вводили внутрибрюшинно /в/б/ (композицию, содержащую семакс и холина альфосцерат, - за 3 часа (ч), один семакс - за 3 ч, один холина альфосцерат - за 3 ч) до помещения животных в гермокамеру.

Острую гемическую гипоксию воспроизводили путем подкожного (п/к) введения мышам метгемоглобинообразователя натрия нитрита (NaNO²) в дозе 300 мг/кг. Как известно, NaNO² переводит оксигемоглобин в метгемоглобин, вызывает метгемоглобинемию и 100% гибель животных в указанной дозе. Исследуемые вещества и изотонический раствор натрия хлорида (контроль) вводили в/б (композицию, содержащую семакс и холина альфосцерат, - за 3 ч, один семакс - за 3 ч, один холина альфосцерат - за 3 ч) до введения NaNO². Регистрировали с помощью секундомера продолжительность жизни мышей (до остановки дыхания) в минутах (с точностью до 0,1 мин) при острой гемической гипоксии.

Острую гистотоксическую гипоксию моделировали путем п/к введения мышам натрия нитропруссида в дозе 20 мг/кг. Он способен полностью ингибировать (за счет группы CN^-) цитохромоксидазу и в указанной дозе вызвать 100% гибель мышей. Исследуемые вещества и изотонический раствор натрия хлорида (контроль) вводили в/б (композицию, содержащую семакс и холина альфосцерат, - за 3 ч, один семакс - за 3 ч, один холина альфосцерат - за 3 ч) до введения натрия нитропруссида. Регистрировали с помощью секундомера продолжительность жизни мышей (до остановки дыхания) в минутах (с точностью до 0,1 мин) в условиях гистотоксической гипоксии.

Острую гипобарическую гипоксию моделировали у мышей в проточно-вытяжной барокамере; животных поднимали со скоростью 50 м/с до «высоты» 11000 м (Методические рекомендации по экспериментальному изучению препаратов, предлагаемых для клинического изучения в качестве антигипоксических средств / Под редакцией Л.Д.Лукьяновой, 1990). Регистрировали выживаемость и продолжительность жизни животных. Исследуемые вещества и изотонический раствор натрия хлорида (контроль) вводили в/б (композицию, содержащую семакс и холина альфосцерат, за 3 ч, один семакс - за 3 ч, один холина альфосцерат - за 3 ч) до помещения животных в барокамеру.

Нейропротекторное действие композиции семакса и холина альфосцерата оценивали на животных с экспериментальной ишемией головного мозга - на модели ишемического инсульта. Исследования выполнены на белых нелинейных крысах-самцах массой 220-280 г, содержащихся в виварных условиях, у которых моделировали ишемический инсульт.

Ишемию головного мозга у крыс воспроизводили путем одномоментной перевязки (под эфирным наркозом) обеих общих сонных артерий. У ложнооперированных животных (контрольная группа №1) операция была ограничена этапом доступа к общим сонным артериям. В контрольной группе №2 крысы получали только изотонический раствор натрия хлорида. В подопытных группах животным вводили в/б различные вещества (семакс и холина альфосцерат по отдельности и композицию, их содержащую) 1 раз в сутки в течение 7 суток; в первые сутки - через 1 и 3 ч после операции. Животных после операции наблюдали в течение 2 недель с учетом выживаемости крыс. Неврологический дефицит у животных определяли (слепым методом) по шкале McGraw et al. (1976) (в баллах) каждый час в течение 24 ч, а затем 1 раз в сутки. Тяжесть состояния определяли по сумме соответствующих баллов. У ложнооперированных животных неврологический дефицит отсутствовал.

Влияние композиции семакса и холина альфосцерата на процессы обучения и памяти исследовали на белых нелинейных мышах-самцах (массой 20-24 г), используя условную реакцию пассивного избегания (УРПИ) электрокожного раздражения (Я.Буреш и соавт., 1991; К.М.Дюмаев и соавт., 1995). В настоящее время тест УРПИ является базисной моделью для оценки влияния веществ на формирование и воспроизведение памятного следа в норме и в условиях его нарушения (амнезия), а также наиболее информативным из применяемых сегодня методов оценки эффективности веществ с ноотропной активностью («Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ», 2000). Выработку УРПИ у мышей производили на основе электрокожного подкрепления по методу Cumin et al. (1982) с учетом рекомендаций Mondadori et al. (1990). Установка для мышей представляла собой экспериментальную камеру черного цвета размером 30×40×30 см с электродным полом и белой пластиковой платформой (7,5×7,5×0,5 см), которую располагали на полу в центре камеры. Мышей (поодиночке) помещали на пластиковую платформу. Обычно животные спускаются (или спрыгивают) с платформы на электродный пол, где они получают «наказание» - удар электрическим током (в это время на пол камеры подавали постоянный электрический ток силой 0,5 мА). Электрический ток включали только тогда, когда мышь касалась пола всеми четырьмя конечностями. Обычной реакцией животных было возвращение на безопасную платформу. После 5 мин обучения у мышей вырабатывалась УРПИ - они оставались на платформе. Тестирование на сохранность УРПИ проводили через 24 ч после амнезирующего воздействия. При этом если животное покидало платформу в течение 1 мин, у него отмечали ретроградную амнезию навыка пассивного избегания.

В качестве амнезирующего воздействия использовали электросудорожный шок (ЭСШ; параметры электрического тока: 50 Гц, 50 мА, 0,3 с), который наносили мышам с помощью электродов в виде клипс, фиксируемых на ушных раковинах (транспиннеально), сразу после обучения УРПИ («Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ», 2000). У животных контрольной группы вызывали псевдоэлектросудорожный шок: накладывали пиннеальные электроды для нанесения ЭСШ без подачи электрического тока. Семакс (один), холина альфосцерат (один), композицию, их содержащую, и изотонический раствор натрия хлорида (контроль) вводили в/б в период генерализованных судорог, вызванных ЭСШ, то есть непосредственно после ЭСШ. Тестирование мышей на сохранение УРПИ производили через 24 ч после ЭСШ.

Антиамнестическое действие семакса и холина альфосцерата на модели амнезии, вызванной скополамином, исследовали на белых нелинейных мышах-самцах массой 20-24 г с применением выработки у животных УРПИ (описанной выше). Для воспроизведения модели скополаминовой амнезии м-холиноблокатор вводили мышам в/б в дозе 1 мг/кг сразу после обучения УРПИ («Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ», 2000). Исследуемые вещества и изотонический раствор натрия хлорида (контроль) вводили в/б (композицию, содержащую семакс и холина альфосцерат, - за 3 ч, один семакс - за 3 ч, один холина альфосцерат - за 3 ч) вводили однократно в/б до обучения мышей. Тестирование мышей на сохранение УРПИ производили через 24 ч после введения скополамина.

Антиамнестическое действие семакса и холина альфосцерата на модели амнезии, вызванной плаванием мышей в холодной воде с одновременным вращением колеса до изнеможения, исследовали на белых нелинейных мышах-самцах массой 20-24 г с применением выработки у животных УРПИ (описанной выше). Животных (поодиночке) помещали в заполненный водой пластиковый ящик размером 17×9×19 см с вращающимся ребристым колесом. Плавание мышей в холодной воде с одновременным вращением колеса до изнеможения (ПМХВ) применяли сразу после обучения УРПИ. Сохранность УРПИ проверяли через 24 ч после окончания ПМХВ. В качестве ложного ПМХВ использовали помещение животных в мокрые холодные опилки. Исследуемые вещества и изотонический раствор натрия хлорида (контроль) вводили в/б (композицию, содержащую семакс и холина альфосцерат, - за 3 ч, один семакс - за 3 ч, один холина альфосцерат - за 3 ч) вводили однократно в/б до обучения мышей.

Антиамнестическое действие семакса и холина альфосцерата на модели амнезии, вызванной острой нормобарической гипоксической гипоксией с гиперкапнией (в гермокамере), исследовали на белых нелинейных мышах-самцах массой 20-24 г с применением выработки у животных УРПИ (описанной выше). Описанную выше модель острой нормобарической гипоксической гипоксии с гиперкапнией также использовали для вызывания у животных ретроградной амнезии навыка пассивного избегания. Для этого мышей сразу после обучения УРПИ помещали (поодиночке) в гермокамеру на 16-18 мин в зависимости от выраженности симптомов кислородной недостаточности и массы (чем больше масса, тем обычно меньше время их пребывания в гермокамере). В контрольной группе животных подвергали ложной гипоксии - сажали мышей в стеклянные банки одинакового объема, которые не закрывали. Проверку сохранения УРПИ проводили через 24 ч после окончания воздействия гипоксии с гиперкапнией. Исследуемые вещества и изотонический раствор натрия хлорида (контроль) вводили в/б (композицию, содержащую семакс и холина альфосцерат, - за 3 ч, один семакс - за 3 ч, один холина альфосцерат - за 3 ч) однократно до обучения мышей.

Исследование влияния композиции семакса и холина альфосцерата на физическую работоспособность мышей. Исследования выполнены на белых нелинейных мышах-самцах массой 20-22 г. Физическую работоспособность мышей оценивали по тесту бега в шестидорожечном третбане (Н.Н.Самойлов и соавт., 2002). На каждую беговую дорожку ленты транспортера помещали одно животное. Скорость движения ленты составляла 32 м/мин. Мыши бегали до полного утомления, критерием которого было отсутствие реакции на раздражение электрическим током при нахождении на «электрическом столе». Учитывали продолжительность бега животных в минутах, с точностью до 0,1 мин. Семакс (один), холина альфосцерат (один), композицию, их содержащую, и изотонический раствор натрия хлорида (контроль) вводили внутрибрюшинно (композицию - за 3 ч, семакс - за 3 ч, холина альфосцерат - за 3 ч) до бега в третбане.

Для расшифровки механизма действия композиции семакса и холина альфосцерата проводили электрофизиологические исследования на переживающих поперечных срезах гиппокампа крыс (В.Г.Мотин и соавт., 2000; N.V.Kalashnicova et al., 2005). Суммарную электрическую активность регистрировали в пирамидном слое поля СА1 с помощью одноканальных стеклянных микроэлектродов, заполненных 0,15 М раствором натрия хлорида. Орто- и антидромную электрическую стимуляцию осуществляли посредством платиновых биполярных электродов (прямоугольные импульсы длительностью 0,1 мс, амплитудой 3-8 В, одиночные или парные), которые помещали в области коллатералей Шаффера и альвеуса соответственно. Регистрировали одиночные или парные орто- и антидромные популяционные ответы. Исследовали влияние семакса и холина альфосцерата, а также их композиции в разных концентрациях на эти ответы. Это позволило, в частности, оценить их действие на синаптическую передачу в системе коллатерали Шаффера - пирамиды поля СА1.

Полярографическое исследование дыхания изолированных митохондрий клеток головного мозга крыс. Митохондрий выделяли из ткани головного мозга белых нелинейных крыс-самцов (массой 210-260 г) с помощью дифференциального центрифугирования по методике Brustovetsky, Dubinsky (2000). Определение содержания белка в изолированных митохондриях проводили по методу Брэдфорд (1976). Потребление кислорода изолированными митохондриями регистрировали полярографически с помощью стандартного электрода Кларка в 1 мл среды инкубации (маннит - 215 мМ, сахароза - 75 мМ, MgCl₂ - 2 мМ, KH₂PO₄ - 10 мМ, бычий сывороточный альбумин - 0,1%, ЭГТА - 1 мМ, HEPES - 20 мМ, pH 7,4) при постоянном перемешивании. Скорость потребления кислорода (О₂) выражали в наномолях (нМ) О₂ за 1 мин в расчете на 1 мг белка митохондрий. Исследовали влияние семакса и холина альфосцерата, а также их композиции в разных концентрациях на дыхание изолированных митохондрий клеток головного мозга крыс. Числовые данные обработаны методами вариационной статистики.

Противогипоксическое действие композиции семакса и холина альфосцерата на 4 моделях острой гипоксии. На модели острой нормобарической гипоксической гипоксии с гиперкапнией (в гермокамере) было обнаружено, что семакс в дозах 0,025 и 0,2 мг/кг существенно не изменял продолжительность жизни мышей в гермокамере, а в дозе 0,05 и 0,3 мг/кг значимо (p<0,01) увеличивал этот показатель на 23% и 24% соответственно (табл.1). Холина альфосцерат в дозах 100, 200, 400 и 800 мг/кг существенно не изменял продолжительность жизни животных.

Однако композиции, содержащие семакс и холина альфосцерат, значимо увеличивали продолжительность жизни животных в гермокамере: композиция семакса 0,025 мг/кг и холина альфосцерата 200 мг/кг, а также композиция семакса 0,05 мг/кг и холина альфосцерата 100 мг/кг - на 29% (р<0,01), композиция семакса 0,2 мг/кг и холина альфосцерата 200 мг/кг - на 27% (р<0,01), композиция семакса 0,3 мг/кг и холина альфосцерата 200 мг/кг - на 31% (р<0,01), композиция семакса 0,3 мг/кг и холина альфосцерата 100 мг/кг - на 30% (р<0,01), композиция семакса 0,05 мг/кг и холина альфосцерата 400 мг/кг - на 20% (р<0,05), композиция семакса 0,3 мг/кг и холина альфосцерата 400 мг/кг - на 21% (р<0,05), композиция семакса 0,05 мг/кг и холина альфосцерата 800 мг/кг - на 68% (р<0,01), композиция семакса 0,3 мг/кг и холина альфосцерата 800 мг/кг - на 73% (р<0,001).

При этом, по выраженности действия композиции семакса 0,025 мг/кг и холина альфосцерата 200 мг/кг, семакса 0,2 мг/кг и холина альфосцерата 200 мг/кг, семакса 0,05 мг/кг и холина альфосцерата 800 мг/кг, а также семакса 0,3 мг/кг и холина альфосцерата 800 мг/кг значимо (р<0,05) превосходила семакс (в 1,2-3,0 раза) и холина альфосцерат (в 1,2-1,5 раза) по отдельности. Композиции семакса 0,05 мг/кг и холина альфосцерата 100 мг/кг, а также семакса 0,3 мг/кг и холина альфосцерата 100 мг/кг значимо (р<0,05) превосходили только холина альфосцерат (в 1,2 раза). Композиции семакса 0,05 мг/кг и холина альфосцерата 400 мг/кг, а также семакса 0,3 мг/кг и холина альфосцерата 400 мг/кг по выраженности действия достоверно не превосходили семакс и холина альфосцерат по отдельности.

На модели острой гемической гипоксии было обнаружено, что семакс в дозах 0,025, 0,05 и 0,3 мг/кг, холина альфосцерат в дозе 800 мг/кг, а также композиция семакса 0,025 мг/кг и холина альфосцерата 800 мг/кг существенно не изменяли продолжительность жизни мышей (табл.2).

Однако композиции, содержащие семакс и холина альфосцерат, значимо (р<0,05) увеличивали продолжительность жизни животных: композиция семакса 0,05 мг/кг и холина альфосцерата 800 мг/кг - на 25% и композиция семакса 0,3 мг/кг и холина альфосцерата 800 мг/кг - на 27%.

На модели острой гистотоксической гипоксии было выявлено, что семакс в дозах 0,025, 0,05 и 0,3 мг/кг, холина альфосцерат в дозе 800 мг/кг, а также композиция семакса 0,025 мг/кг и холина альфосцерата 800 мг/кг существенно не изменяли продолжительность жизни мышей (табл.3). Однако композиции, содержащие семакс и холина альфосцерат, значимо (р<0,05) увеличивали продолжительность жизни животных: композиция семакса 0,05 мг/кг и холина альфосцерата 800 мг/кг - на 23% и композиция семакса 0,3 мг/кг и холина альфосцерата 800 мг/кг - на 25%. При этом только композиция семакса 0,3 мг/кг и холина альфосцерата 800 мг/кг по выраженности действия значимо (р<0,05) превосходила семакс в 1,2 раза.

На модели острой гипобарической гипоксии было установлено, что семакс в дозе 0,025 существенно не изменял продолжительность жизни мышей в гермокамере, а в дозе 0,05 и 0,3 мг/кг значимо (р<0,01) увеличивал этот показатель на 55% и 58% соответственно (табл.4). Холина альфосцерат в дозе 800 мг/кг значимо (р<0,05) увеличивал этот показатель на 35%. Однако композиции, содержащие семакс и холина альфосцерат, значимо увеличивали продолжительность жизни животных: композиция семакса 0,025 мг/кг и холина альфосцерата 800 мг/кг - на 87% (р<0,01), композиция семакса 0,05 мг/кг и холина альфосцерата 800 мг/кг - на 103% (р<0,001) и композиция семакса 0,3 мг/кг и холина альфосцерата 800 мг/кг - на 113% (р<0,001).

При этом, по выраженности действия указанные композиции значимо (р<0,05) превосходили семакс (в 1,3-1,8 раза) и холина альфосцерат (в 1,4-2,1 раза) по отдельности.

Следует отметить, что композиция семакса 0,3 мг/кг и холина альфосцерата 800 мг/кг значимо (р<0,05) увеличивала выживаемость мышей с 0% (контроль) до 33%.

Итак, на разных моделях острой гипоксии композиция семакса и холина альфосцерата способна оказывать противогипоксическое действие, превосходя каждый из ингредиентов, особенно в гермо- и барокамере.

Нейропротекторное действие композиции семакса и холина альфосцерата на модели ишемического инсульта.

Результаты исследования нейропротекторного действия композиции семакса и холина альфосцерата и других веществ представлены в табл.5. Из нее видно, что у крыс контрольной группы №2 неврологический дефицит был наиболее выражен (8,9±0,1 балла) через 2 и 3 суток после двусторонней перевязки общих сонных артерий; при этом в контроле погибло 24% (18 крыс из 75) животных.

Было обнаружено, что семакс (один) в дозе 0,5 мг/кг/сут и холина альфосцерат (один) в дозе 100 мг/кг/сут одинаково уменьшали летальность крыс с 24% (контроль) до 14% (р>0,05). Холина альфосцерат (один) в дозе 50 мг/кг/сут уменьшал летальность крыс до 18% (р>0,05), а в дозах 200 и 400 мг/кг/сут - до 6% и 3% соответственно (р<0,05). Следовательно, для холина альфосцерата характерна близкая к линейной зависимость эффекта от дозы. Композиция, содержащая семакс 0,5 мг/кг/сут и холина альфосцерат 50 мг/кг/сут, уменьшала летальность крыс до 8% (р<0,05). Композиции, содержащие семакс 0,5 мг/кг/сут и холина альфосцерат в дозах 100, 200 и 400 мг/кг/сут, значимо (р<0,05) увеличивали количество выживших крыс до 100% (то есть крысы не погибали). При этом в отношении летальности композиция, содержащая семакс 0,5 мг/кг/сут и холина альфосцерат 100 мг/кг/сут, значимо (р<0,05) превосходила и семакс (на 14%) и холина альфосцерат (на 14%). Композиции, содержащие семакс 0,5 мг/кг/сут и холина альфосцерат в дозах 200 и 400 мг/кг/сут, в отношении летальности значимо (р<0,05) превосходили только семакс (на 14%). Кроме того, достоверно уменьшался неврологический дефицит, причем по выраженности действия на неврологический дефицит композиции, содержащие семакс 0,5 мг/кг/сут и холина альфосцерат в дозах 100, 200 и 400 мг/кг/сут, значимо (р<0,05) превосходили как семакс (в 1,1-1,2 раза), так и холина альфосцерат (в 1,1-1,2 раза) (табл.5). Композиция, содержащая семакс 0,5 мг/кг/сут и холина альфосцерат 50 мг/кг/сут, по данному показателю значимо (р<0,05) превосходила только холина альфосцерат (в 1,1-1,2 раза).

Итак, на модели ишемического инсульта композиция, содержащая семакс и холина альфосцерат, оказывает выраженное нейропротекторное действие, как правило, превосходя по выраженности действия каждый из ингредиентов.

Антиамнестическое действие композиции семакса и холина альфосцерата на разных моделях амнезии.

Установлено, что ЭСШ вызывал у большинства мышей ретроградную амнезию навыка пассивного избегания: у 82% животных (р<0,001) через 24 ч наблюдалась амнезия УРПИ. Семакс в дозе 0,2 мг/кг и холина альфосцерат в дозе 200 мг/кг существенно не изменяли амнестическое действие, а холина альфосцерат в дозе 400 мг/кг значимо (р<0,05) ослаблял амнестический эффект в 1,6 раза (табл.6).

Композиция, содержащая семакс 0,2 мг/кг и холина альфосцерат 200 мг/кг, значимо (р<0,05) ослабляла амнестический эффект в 2,3 раза, а композиция, содержащая семакс 0,2 мг/кг и холина альфосцерат 400 мг/кг, - в 3,3 раза (р<0,001). При этом по выраженности действия композиции значимо (р<0,05) превосходили и семакс (в 2,1-3,0 раза), и холина альфосцерат (в 1,8-2,1 раза) по отдельности.

Установлено, что скополамин вызывал у большей части мышей ретроградную амнезию навыка пассивного избегания: у 72% животных (р<0,001) через 24 ч наблюдалась амнезия УРПИ. Семакс в дозе 0,025 мг/кг и холина альфосцерат в дозах 100 и 200 мг/кг существенно не влияли на амнезию УРПИ, а холина альфосцерат в дозе 400 мг/кг значимо (р<0,01) ослаблял амнестический эффект в 2,1 раза (табл.7).

Композиция, содержащая семакс 0,025 мг/кг и холина альфосцерат 100 мг/кг, значимо ослабляла амнестический эффект в 2 раза (р<0,05), а композиция, содержащая семакс 0,025 мг/кг и холина альфосцерат 200 мг/кг - в 2,9 раза (р<0,001). Композиция, содержащая семакс 0,025 мг/кг и холина альфосцерат 400 мг/кг, полностью предотвращала развитие амнезии УРПИ. При этом, по выраженности действия композиция, содержащая семакс 0,025 мг/кг и холина альфосцерат 100 мг/кг, а также композиция, содержащая семакс 0,025 мг/кг и холина альфосцерат 200 мг/кг, значимо (р<0,05) превосходили и семакс (в 1,9-2,7 раза), и холина альфосцерат (в 1,8-2,0 раза). Композиция, содержащая семакс 0,025 мг/кг и холина альфосцерат 400 мг/кг, значимо (р<0,05) превосходила только семакс (в 4 раза).

Было обнаружено, что через 24 ч после 16-18 минутного пребывания мышей в гермокамере у большей части из них наблюдалась ретроградная амнезия: у 64% животных (р<0,001). Семакс в дозе 0,025 мг/кг и холина альфосцерат в дозе 200 мг/кг существенно не влияли на амнезию УРПИ, а холина альфосцерат в дозе 400 мг/кг значимо (р<0,05) ослаблял амнестический эффект в 1,8 раза (табл.8).

Композиция, содержащая семакс 0,025 мг/кг и холина альфосцерат 200 мг/кг, значимо (р<0,05) оказывала отчетливое антиамнестическое действие, уменьшая выраженность амнезии в 2 раза. Композиция, содержащая семакс 0,025 мг/кг и холина альфосцерат 400 мг/кг, полностью предотвращала развитие амнезии УРПИ. При этом, по выраженности действия композиция, содержащая семакс 0,025 мг/кг и холина альфосцерат 200 мг/кг, значимо (р<0,05) превосходила и семакс, и холина альфосцерат (в 1,8 раза). Композиция, содержащая семакс 0,025 мг/кг и холина альфосцерат 400 мг/кг, значимо (р<0,05) превосходила только семакс (в 3,5 раза).

Установлено, что ПМХВ вызывало у большей части мышей ретроградную амнезию навыка пассивного избегания: у 62% животных (р<0,001) через 24 ч наблюдалась амнезия УРПИ. Семакс в дозе 0,025 мг/кг и холина альфосцерат в дозе 200 мг/кг существенно не влияли на амнезию УРПИ, а холина альфосцерат в дозе 400 мг/кг значимо (р<0,05) ослаблял амнестический эффект в 1,9 раза (табл.9).

Композиция, содержащая семакс 0,025 мг/кг и холина альфосцерат 200 мг/кг, значимо (р<0,05) ослабляла амнестический эффект в 2,7 раза. Композиция, содержащая семакс 0,025 мг/кг и холина альфосцерат 400 мг/кг полностью предотвращала развитие амнезии УРПИ. При этом, по выраженности действия композиция, содержащая семакс 0,025 мг/кг и холина альфосцерат 200 мг/кг, значимо (р<0,05) превосходила и семакс, и холина альфосцерат (в 2,2 раза). Композиция, содержащая семакс 0,025 мг/кг и холина альфосцерат 400 мг/кг значимо (р<0,05) превосходила только семакс (в 2,9 раза).

Итак, на разных моделях амнезии композиция семакса и холина альфосцерата оказывает выраженное антиамнестического действие, превосходя каждый из ингредиентов.

Влияние композиции семакса и холина альфосцерата на физическую работоспособность мышей.

Было обнаружено, что семакс в дозе 0,01 мг/кг и холина альфосцерат в дозе 0,5 мг/кг существенно не изменяли физическую работоспособность мышей по тесту бега в третбане. Однако композиция, содержащая семакс и холина альфосцерат, значимо (р<0,05) повышала физическую работоспособность мышей на 26% (табл.10а). При этом по выраженности действия композиция значимо (р<0,05) превосходила и семакс (на 29%), и холина альфосцерат (на 23%).

Также было обнаружено, что семакс в дозе 0,3 мг/кг и холина альфосцерат в дозах 1, 10, 200 и 800 мг/кг, а также их композиции, существенно не изменяли физическую работоспособность мышей (табл.10б).

Было выявлено, что семакс в дозе 0,05 мг/кг значимо (р<0,001) снижал физическую работоспособность мышей на 29%. Холина альфосцерат в дозе 100 мг/кг также значимо (р<0,01) снижал этот показатель на 30%. Хотя их композиция и недостоверно повышала физическую работоспособность по сравнению с контролем (на 9%), однако она значимо стимулировала физическую работоспособность по сравнению с каждым из ингредиентов: с семаксом - на 38% (р<0,001) и с холина альфосцератом - на 39% (р<0,01), то есть негативное влияние каждого из препаратов нивелировалось.

Итак, композиция семакса в дозе 0,01 мг/кг и холина альфосцерата в дозе 0,5 мг/кг в отличие от своих ингредиентов способна повышать физическую работоспособность мышей по тесту бега в третбане.

Полярографическое исследование влияния композиции семакса и холина альфосцерата на дыхание изолированных митохондрий клеток головного мозга крыс.

Полярографическое исследование дыхания в препаратах изолированных митохондрий клеток головного мозга крыс показало, что исходная скорость потребления кислорода митохондриями составляет в среднем 5,3±0,1 нМ O₂/мин·мг белка митохондрий (n=110).

На срезах гиппокампа крыс было показано, что семакс (в концентрациях 10, 100 и 500 мкМ) угнетает ортодромные популяционные ответы в поле СА1 (фиг.1), что свидетельствует об его способности угнетать синаптическую передачу в системе коллатерали Шаффера - пирамидные нейроны поля СА1 гиппокампа.

Популяционные ответы после аппликаций холина альфосцерата в различных концентрациях достоверно не изменяли свою величину от пика до пика, но изменяли свою форму, то есть появлялся дополнительный эпилептиформный компонент, который увеличивался в зависимости от концентрации (500 мкМ - 5 мМ) (фиг.2).

Холина альфосцерат значимо не усиливал действие семакса (в концентрациях 100 и 500 мкМ). Семакс также не влиял на эпилептиформный компонент, появляющийся после аппликаций холина альфосцерата (фиг.3).

Результаты экспериментов доказывают, что предлагаемая фармацевтическая композиция, содержащая семакс и холина альфосцерат, взаимно усиливает эффект действия каждого из них.

Заявленная композиция может найти применение при создании новых лекарственных средств, обладающих нейропротекторной активностью в сочетании с противогипоксической и антиамнестической активностью и способностью повышать физическую работоспособность и используемых для лечения различной патологии центральной нервной системы.

Фармацевтическая композиция, обладающая противогипоксической, нейропротекторной и антиамнестической активностью и повышающая физическую работоспособность

Таблица 1 Влияние композиции семакса и холина альфосцерата на продолжительность жизни мышей в гермокамере (М±m) Вещество (доза, мг/кг) Число мышей Продолжительность жизни, минуты Изотонический раствор натрия хлорида (контроль) 16 26,8±0,7 Семакс (0,025) 14 28,1±0,8 Семакс (0,2) 14 28,7±0,8 Семакс (0,3) 14 33,2±1,9** Холина альфосцерат (200) 14 27,3±0,9 Композиция семакса (0,025) и холина альфосцерата (200) 16 34,7±2,4**^☐# Композиция семакса (0,2) и холина альфосцерата (200) 16 34,1±2,0**^☐# Композиция семакса (0,3) и холина альфосцерата (200) 14 35,1±2,7**^# Изотонический раствор натрия хлорида (контроль) 12 25,6±1,0 Семакс (0,05) 14 31,5±1,4** Холина альфосцерат (100) 12 28,3±1,1 Композиция семакса (0,05) и холина альфосцерата (100) 12 33,1±1,9**^# Композиция семакса (0,3) и холина альфосцерата (100) 12 33,4±2,0**^# Изотонический раствор натрия хлорида (контроль) 10 27,9±1,2 Холина альфосцерат (400) 10 30,1±1,6 Композиция семакса (0,05) и холина альфосцерата (400) 10 33,6±2,1* Композиция семакса (0,3) и холина альфосцерата (400) 10 33,8±2,2* Изотонический раствор натрия хлорида(контроль) 10 26,6±1,1 Холина альфосцерат (800) 10 30,6±1,8 Композиция семакса (0,05) и холина альфосцерата (800) 10 44,8±4,6**^☐# Композиция семакса (0,3) и холина альфосцерата (800) 10 46,0±4,8***^☐# Примечание. * - р<0,05, ** р<0,01, *** - р<0,001 - значимость различий по сравнению с контролем; ^☐ - p<0,05 - значимость различий по сравнению с семаксом; ^# - р<0,05, ^## - p<0,01 - значимость различий по сравнению с холина альфосцератом (критерий Стьюдента).

Фармацевтическая композиция, обладающая противогипоксической, нейропротекторной и антиамнестической активностью и повышающая физическую работоспособность

Таблица 2 Влияние композиции семакса и холина альфосцерата на продолжительность жизни мышей при острой гемической гипоксии (М+m) Вещество (доза, мг/кг) Число мышей Продолжительность жизни, минуты 0,9% раствор NaCl (контроль) 16 2L2±1,1 Семакс (0,025) 10 19,6±2,7 Семакс (0,05) 12 22,3±1,8 Семакс (0,3) 12 22,6+1,8 Холина альфосцерат (800) 12 22,1±1,7 Композиция семакса (0,025) и холина альфосцерата (800) 12 23,8±1,8 Композиция семакса (0,05) и холина альфосцерата (800) 14 26,6±1,9* Композиция семакса (0,3) и холина альфосцерата (800) 14 26,9±2,0* Примечание. Различия статистически значимы по сравнению с контролем (критерий Стьюдента): * - р<0,05.

Фармацевтическая композиция, обладающая противогипоксической, нейропротекторной и антиамнестической активностью и повышающая физическую работоспособность

Таблица 3 Влияние композиции семакса и холина альфосцерата на продолжительность жизни мышей при острой гистотоксической гипоксии (М±m) Вещество (доза, мг/кг) Число мышей Продолжительность жизни, минуты 0,9% раствор NaCl (контроль) 16 15,9±0,4 Семакс (0,025) 10 15,6+0,5 Семакс (0,05) 12 16,7±0,6 Семакс (0,3) 12 16,9±0,7 Холина альфосцерат (800) 12 17,8±0,8 Композиция семакса (0,025) и холина альфосцерата (800) 12 17,9±0,9 Композиция семакса (0,05) и холина альфосцерата (800) 14 19,5±1,0* Композиция семакса (0,3) и холина альфосцерата (800) 14 19,8+1,0*^☐ Примечание. Различия статистически значимы по сравнению с контролем (критерий Стьюдента): * - р<0,05; ^☐ - р<0,05 - значимость различий по сравнению с семаксом.

Фармацевтическая композиция, обладающая противогипоксической, нейропротекторной и антиамнестической активностью и повышающая физическую работоспособность

Таблица 4 Влияние композиции семакса и холина альфосцерата на продолжительность жизни и выживаемость мышей при острой гипобарической гипоксии (М±m) Вещество (доза, мг/кг) Число мышей Продолжительность жизни, минуты Количество выживших мышей (%) 0,9% раствор NaCl (контроль) 14 3,1+0,3 0 (0) Холина альфосцерат (800) 12 4,2±0,4* 0 (0) Семакс (0,025) 12 3,3+0,3 0 (0) Семакс (0.05) 14 4,8±0,4** 0 (0) Семакс (0,3) 14 4,9+0,4** 0 (0) Композиция семакса (0,025) ихолина альфосцерата (800) 12 5,8±0,5**^☐# 1 (8) Композиция семакса (0,05) ихолина альфосцерата (800) 12 6,3+0,6***^☐# 2 (17) Композиция семакса (0,3) и холинаальфосцерата (800) 15 6,6+0,7***^☐# 5 (33)* Примечание. Различия статистически значимы по сравнению с контролем: * - р<0,05, ** - р<0,01, *** - р<0,001; ^☐ - р<0,05 - значимость различий по сравнению с семаксом; ^# - р<0,05 - значимость различий по сравнению с холина альфосцератом (критерий Стьюдента, точный метод Фишера).

Фармацевтическая композиция, обладающая противогипоксической, нейропротекторной и антиамнестической активностью и повышающая физическую работоспособность

Фармацевтическая композиция, обладающая противогипоксической, нейропротекторной и антиамнестической активностью и повышающая физическую работоспособность

Таблица 6 Влияние композиции семакса и холииа альфосцерата на амнезию у мышей, вызванную электросудорожным шоком (ЭСШ) Условия опытов и вещество (доза, мг/кг) Общее число мышей Число мышей, обучившихся УРПИ (%) Число мышей с амнезией УРПИ через 24 часа после амнезирующего воздействия (%) Изотонический раствор натрия хлорида + псевдоЭСШ (контроль 1) 30 27 (90) 5 (19) Изотонический раствор натрия хлорида + ЭСШ (контроль 2) 30 28 (93) 23 (82)°°° Семакс (0,2) + ЭСШ 22 20(91) 15 (75)° Холина альфосцерат (200) + ЭСШ 30 28 (93) 18 (64)° Холина альфосцерат (400) + ЭСШ 30 27 (90) 14 (52)* Композиция семакса (0,2) и холина альфосцерата (200) + ЭСШ 30 28 (93) 10 (36)*^☐# Композиция семакса (0,2) и холина альфосцерата (400) + ЭСШ 30 28 (93) 7 (25)***^☐# Примечание. Различия статистически значимы по сравнению с контролем 1 и контролем 2 соответственно: ° или * - р<0,05, °°° - р<0,001; ^☐ - р<0,05 - значимость различий по сравнению с семаксом; ^# - р<0,05 - значимость различий по сравнению с холина альфосцератом (точный метод Фишера).

Фармацевтическая композиция, обладающая противогипоксической, нейропротекторной и антиамнестической активностью и повышающая физическую работоспособность

Таблица 7 Влияние композиции семакса и холина альфосцерата на амнезию у мышей, вызванную скополамином Условия опытов и вещество (доза, мг/кг) Общее число мышей Число мышей, обучившихся УРПИ (%) Число мышей с амнезией УРПИ через 24 часа после амнезирующего воздействия (%) Изотонический раствор натрия хлорида + изотонический раствор натрия хлорида (контроль 1) 31 29 (94) 5 (17) Изотонический раствор натрия хлорида + скополамин (контроль 2) 32 29 (91) 21 (72)°°° Семакс (0,025) + скополамин 31 28 (90) 19 (68)° Холина альфосцерат (100) + скополамин 30 28 (93) 18 (64)° Холина альфосцерат (200) + скополамин 29 28 (96) 14 (50) Холина альфосцерат (400) + скополамин 30 29 (97) 10 (34)** Композиция семакса (0,025) и холина альфосцерата (100) + скополамин 30 28 (93) 10 (36)*^☐# Композиция семакса (0,025) и холина альфосцерата (200) + скополамин 29 28 (96) 7 (25)***^☐# Композиция семакса (0,025) и холина альфосцерата (400) + скополамин 30 29 (97) 5 (17)***^☐ Примечание. Различия статистически значимы по сравнению с контролем 1 и контролем 2 соответственно: ° или * - р<0,05, °°° - р<0,001; ^☐ - р<0,05 - значимость различий по сравнению с семаксом; ^# - р<0,05 - значимость различий по сравнению с холина альфосцератом (точный метод Фишера).

Фармацевтическая композиция, обладающая противогипоксической, нейропротекторной и антиамнестической активностью и повышающая физическую работоспособность

Таблица 8 Влияние композиции семакса и холина альфосцерата на амнезию у мышей, вызванную острой нормобарической гипоксической гипоксией с гиперкапнией Условия опытов и вещество (доза, мг/кг) Общее число мышей Число мышей, обучившихся УРПИ (%) Число мышей с амнезией УРПИ через 24 часа после амнезирующего воздействия(%) Изотонический раствор натрия хлорида + ложная гипоксия (контроль 1) 30 28 (93) 5 (18) Изотонический раствор натрия хлорида + гипоксия (контроль 2) 48 44 (92) 28 (64)°°° Семакс (0,025) + гипоксия 24 22 (92) 13 (59)° Холина альфосцерат (200) + гипоксия 32 30 (94) 17 (57)° Холина альфосцерат (400) + гипоксия 29 28 (96) 10 (36)* Композиция семакса (0,025) и холина альфосцерата (200) + гипоксия 30 28 (93) 9 (32)*^☐# Композиция семакса (0,025) и холина альфосцерата (400) + гипоксия 30 29 (97) 5 (17)***^☐ Примечание. Различия статистически значимы по сравнению с контролем 1 и контролем 2 соответственно: ° или * - р<0,05, °°° - р<0,001; ^☐ - р<0,05 - значимость различий по сравнению с семаксом; ^# - р<0,05 - значимость различий по сравнению с холина альфосцератом (точный метод Фишера).

Фармацевтическая композиция, обладающая противогипоксической, нейропротекторной и антиамнестической активностью и повышающая физическую работоспособность

Таблица 9 Влияние композиции семакса и холина альфосцерата на амнестический эффект, вызванный плаванием мышей в холодной воде с одновременным вращением колеса до изнеможения (ПМХВ) Условия опытов и вещество (доза, мг/кг) Общее число мышей Число мышей, обучившихся УРПИ (%) Число мышей с амнезией УРПИ через 24 часа после ПМХВ (%) Изотонический раствор натрия хлорида + ложное ПМХВ (контроль 1) 52 48 (92) 8 (17) Изотонический раствор натрия хлорида + ПМХВ (контроль 2) 55 52 (94) 32 (62)°°° Семакс (0,025) + ПМХВ 30 28 (93) 14 (50)° Холина альфосцерат (200) + ПМХВ 26 24 (92) 12 (50)° Холина альфосцерат (400) + ПМХВ 29 28 (96) 9 (32)* Композиция семакса (0,025) и холина альфосцерата (200) + ПМХВ 28 26 (93) 6 (23)*^☐# Композиция семакса (0,025) и холина альфосцерата (400) + ПМХВ 30 29 (97) 5 (17)***^☐ Примечание. Различия статистически значимы по сравнению с контролем 1 и контролем 2 соответственно: ° или * - р<0,05, °°° - р<0,001; ^☐ - р<0,05 - значимость различий по сравнению с семаксом; ^# - р<0,05 - значимость различий по сравнению с холина альфосцератом (точный метод Фишера).

Фармацевтическая композиция, обладающая противогипоксической, нейропротекторной и антиамнестической активностью и повышающая физическую работоспособность

Таблица 10а Влияние композиции семакса и холина альфосцерата на физическую работоспособность мышей по тесту бега в третбане (М±m) Вещество (доза, мг/кг) Число мышей Продолжительность бега, минуты Изотонический раствор натрия хлорида (контроль) 14 6,8±0,1 Семакс (0,01) 14 6,6±0,1 Холина альфосцерат (0,5) 14 7,0±0.1 Композиция семакса (0.01) и холина альфосцерата (0,5) 14 8,6±0,2^*☐# Примечание. * - р<0,05 - значимость различий по сравнению с контролем; ^☐ - р<0,05 - значимость различий по сравнению с семаксом; ^# - р<0,05 - значимость различий по сравнению с холина альфосцератом (критерий Стьюдента).

Фармацевтическая композиция, обладающая противогипоксической, нейропротекторной и антиамнестической активностью и повышающая физическую работоспособность

Таблица 10б Влияние композиции семакса и холина альфосцерата на физическую работоспособность мышей по тесту бега в третбане (М±m) Вещество Доза, мг/кг Число мышей Продолжительность бега, минуты Контроль (изотонический раствор натрия хлорида)   8 5,8±0,4 Семакс + 0,01 8 6,9±0,7 Холина альфосцерат 5     Контроль   8 6,0±0,4 Семакс 0,01 8 5,7±0,5 Контроль   8 6,3±0,3 Холина альфосцерат 10 8 7,0±0,5 Контроль   8 6,1±0,3 Холина альфосцерат 1 8 6,7±0,3 Контроль   8 5,8±0,3 Семакс + 0,01 8 6,0±0,7 Холина альфосцерат 10     Контроль   8 5,8±0,3 Семакс + 0,01 8 6,6±0,4 Холина альфосцерат 1     Контроль   16 9,6±0,6 Семакс 0,05 8 6,8±0,3*** Контроль   16 7,4±0,3 Семакс 0,3 8 6,2±0,8 Контроль   16 13,2±0,6 Холина альфосцерат 100 8 9,2±0,9** Контроль   16 7,5±0,3 Холина альфосцерат 200 8 6,6±1,2 Контроль   8 9,8±0,8 Холина альфосцерат 800 8 8,6±0,8 Контроль   10 8,1±0,4 Семакс + 0,05 10 8,8±0,9 Холина альфосцерат 100     Контроль   10 9,2±0,9 Семакс + 0,05 10 8,5±0,9 Холина альфосцерат 200     Контроль   10 9,0±0,6 Семакс + 0,05 10 7,1±0,9 Холина альфосцерат 800     Контроль   10 9,8±0,9 Семакс + 0,3 10 7,8±0,9 Холина альфосцерат 100     Контроль   10 8,4±0,6 Семакс + 0,3 10 7,9±0,8 Холина альфосцерат 200     Контроль   10 8,5±0,8 Семакс + 0,3 10 8,2±0,6 Холина альфосцерат 800     Примечание. Различия статистически значимы по сравнению с контролем (критерий Стьюдента): ** - р<0,01, *** - р<0,001.

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности и касается создания фармацевтической композиции с широким спектром фармакологической активности, а именно обладающей противогипоксической, нейропротекторной и антиамнестической активностью, а также способной повышать физическую работоспособность. Заявленная фармацевтическая композиция включает семакс и холина альфосцерат. Результаты экспериментов доказывают, что предлагаемая фармацевтическая композиция, содержащая семакс и холина альфосцерат, взаимно усиливает эффект действия каждого из них. Заявленная композиция может найти применение при создании новых лекарственных средств, обладающих нейропротекторной активностью в сочетании с противогипоксической и антиамнестической активностью и способностью повышать физическую работоспособность и используемых для лечения различной патологии центральной нервной системы. 12 табл., 3 ил.

Фармацевтическая композиция, обладающая нейропротекторной, противогипоксической, антиамнестической активностью и повышающая физическую работоспособность, характеризующаяся тем, что она включает семакс и холина альфосцерат при следующем содержании компонентов, мг/кг:
семакс 0,025-0,3 холина альфосцерат 800,0