СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РАСТЕНИЙ-РЕГЕНЕРАНТОВ ИРИСА МЕЧЕВИДНОГО (I. ENSATA THUNB.) IN VITRO Российский патент 2013 года по МПК A01H1/00 

Описание патента на изобретение RU2481766C1

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к культивированию органов и тканей растений, и может быть использовано в цветоводстве для повышения коэффициента размножения, оздоровления посадочного материала, а также в селекционной практике для создания новых улучшенных сортов I.ensata.

Известен способ получения растений-регенерантов I.ensata, согласно которому в качестве эксплантов используют молодые побеги. Их культивируют на среде Мурасиге-Скуга, дополненной гормонами и сахарозой. Наблюдают индукцию двух видов каллуса: зеленого и белого. Из зеленого каллуса были получены побеги. Введение активированного угля в питательную среду положительно влияло на образование корней у этих побегов (Yabuya Т, Ikeda Y., Adachi Т. (1991) In vitro propagation of Japanese garden iris iris ensata Thunb. // Euphytica 57, P.77-82).

Недостатком данного способа (аналога) является следующее. Получение каллусной ткани с последующей индукцией органогенеза или соматического эмбриогенеза не пригодно для использования при микроразмножении сортов растений, так как повышается вероятность сомаклональной изменчивости исходного материала.

Наиболее близким является способ получения растений-регенерантов I.ensata на основе индукции развития почек в эксплантах околоцветник - завязь прямым путем, минуя каллусообразование. Экспланты культивировали на питательных средах Мурасиге-Скуга, дополненных фитогормонами НУК(α-нафтилуксусная кислота) и БАП (6-бензиламинопурин) в количестве 0-5 мг/л. Отмечена высокая способность к побегообразованию у данного типа эксплантов. Укоренить побеги автору не удалось (Kawase К, Mizutani Н, Yoshioka М, Fukuda S (1995) Shoot formation on floral organs of Japanese iris in vitro // Journal of the Japanese Society for Horticultural Science 64, P.143-8).

Недостатками данного способа является отсутствие способности к укоренению у полученных побегов I.ensata.

Наиболее близким является способ прямой регенерации флоральных элементов в ткани трубки околоцветника I.ensata. Бутоны, смоченные в 96% этиловом спирте, обжигали в пламени спиртовки. Следующий этап обеззараживания проводили в 0,1% растворе сульфохлорантина в течение 20 минут. Части цветка делили на фрагменты 3×3 мм. В качестве эксплантов использовали фрагменты трубки околоцветника. Экспланты высаживали на питательные среды на основе MS (по прописи Мурасиге и Скуга), дополненные фитогормонами: 1-нафтилуксусной кислотой (НУК) 3-5 мкМ и 6-бензиламинопурином (БАП) 4-8 мкМ. Данным способом трубка околоцветника I.ensata способна регенерировать флоральные элементы (Тихомирова Л.И. Особенности индукции морфогенеза из различных фрагментов цветка ириса в культуре in vitro // Turczaninowia. 2010. - №13 (3). - C.147-151).

Недостатками данного способа (прототипа) является отсутствие способности к размножению и укоренению полученных флоральных элементов I.ensata, a также отсутствие подтверждения идентичности материнским экземплярам.

Задачей изобретения является создание способа получения растений-регенерантов, идентичных материнским растениям I.ensata, способных к дальнейшему размножению и укоренению.

Сущность изобретения

Способ получения растений-регенерантов I.ensata, заключающийся в том, что образование побегов осуществляется непосредственно из ткани экспланта, минуя стадию каллусообразования, зачатки побегов с флоральными элементами разделяют и пересаживают на питательные среды с БАП 20 мкМ и полноценные вегетативные побеги укореняют на среде с НУК 3 мкМ.

Способ получения растений-регенерантов ириса мечевидного (I.ensata Thunb.) in vitro, заключающийся в том, что бутоны, смоченные в 96% этиловом спирте, обжигают в пламени спиртовки, обеззараживают в 0,1% растворе сульфохлорантина в течение 20 минут, затем части трубки околоцветника делят на фрагменты 3×3 мм и высаживают каждый фрагмент на питательную среду Мурасиге-Скуга, содержащую 3-5 мкМ НУК в сочетании с 4-8 мкМ БАП, затем культивируют и укореняют, а через 30 суток культивирования образовавшиеся зачатки побегов с флоральными элементами пересаживают на питательные среды с БАП 20 мкМ и через 30 суток культивирования побеги укореняют на среде Мурасиге-Скуга с НУК 3 мкМ.

Способ обеспечивает высокий процент выхода генетически стабильных регенерантов. Для подтверждения идентичности материнским экземплярам проводят анализ методом RAPD полногеномной ДНК.

Способ реализуют следующим образом.

Получение растений-регенерантов I.ensata осуществляют в два этапа, в качестве эксплантов используют фрагменты трубки околоцветника.

1 этап. Цветки берут в фазе бутонизации (VII этап органогенеза), когда они плотно закрыты листочками обертки. Стерилизацию материала проводят в условиях ламинар-бокса. Бутоны цветка, смоченные в 96% этиловом спирте, обжигают в пламени спиртовки, далее проводят обеззараживание в 0,1% растворе сульфохлорантина в течение 20 минут. Подобный способ обеспечивает на 100% стерильность и жизнеспособность материала. Части трубки околоцветника делят на фрагменты размером не более 3×3 мм и помещают на питательные среды.

Питательные среды готовят по прописи Мурасиге и Скуга, содержащие 30 г/л сахарозы. В них вводят фитогормоны в разных концентрациях: 3-5 мкМ НУК в сочетании с 4-8 мкМ БАП, всего девять вариантов сред (таблица 1) pH среды доводят до 5,8-5,9 и добавляют 0,6% агара. Среды разливают в пластиковые контейнеры по 30 мл или в культуральные флаконы по 10 мл. Автоклавируют приготовленные питательные среды в течение 20 мин при 120°С. Экспланты культивируют в условиях фотопериода 16/8 часов свет/темнота при 24-26°С.

В первые две недели культививования in vitro все экспланты увеличиваются в размерах и приобретают зеленую окраску. Далее еще через две недели в тканях экспланта развиваются зачатки вегетативных побегов, у которых вместо примордиев первых листьев формируются структуры, похожие на доли околоцветника - флоральные элементы. Со временем эти структуры приобретают характерную для цветков данного сорта окраску (Фиг.1).

2 этап. Для получения вегетативных побегов I.ensata из фрагментов трубки околоцветника готовят питательные среды. Зачатки побегов с флоральными элементами пересаживают на питательные среды (используются среды Мурасиге-Скуга или Гамборга B5), содержащие 20 мкМ БАП (таблица 2). Этап, во время которого из эксплантов формируются вегетативные побеги, характеризуется как промежуточный. Через 30 дней регенерируют полноценные побеги с зелеными листьями. В результате данным способом через 60 суток получают полноценные вегетативные побеги I.ensata в количестве 5-8 штук на один эксплант (Фиг.2), которые укореняют на среде Мурасиге-Скуга с НУК 3 мкМ. А после этапа укоренения получают растения-регенеранты, идентичные материнским экземплярам. Для подтверждения идентичности растений-регенерантов и материнских растений I.ensata проводят анализ с помощью ПЦР (Фиг.3).

Необходимым условием клонального микроразмножения является стабильное воспроизводство исходного генотипа. Однако соблюдение этого условия вызывает ряд трудностей, т.к. биологически активные компоненты питательных сред способны вызвать генетические изменения в клетках, что приводит к генетической вариабельности полученных регенерантов. Методом RAPD-анализа полногеномной ДНК отличий между материнскими экземплярами I.ensata и растениями-регенерантами, полученными методом прямой регенерации побегов из ткани экспланта трубки околоцветника, не обнаружено.

Способом получения растений-регенерантов ириса мечевидного (I.ensata Thunb.) in vitro получают побеги в количестве 5-8 штук на один эксплант, способные к дальнейшему размножению и укоренению. Высокий процент укоренения до 100% достигается на средах Мурасиге и Скуга, дополненных 3 мкМ НУК.

Таблица 1 Пути морфогенеза I.ensata в культуре in vitro в зависимости от состава питательной среды и типа экспланта Количество гормонов в мкМ и их соотношение Тип экспланта трубка околоцветника 1БАП 1 НУК (1:1) контроль - 4БАП 3 НУК (1,3:1) РФЭ, геммогенез 4БАП 4 НУК (1:1) РФЭ, геммогенез 4БАП 5 НУК (1:1,25) РФЭ, геммогенез 6БАП 3 НУК (2:1) РФЭ, геммогенез 6БАП 4 НУК (1,5:1) РФЭ, геммогенез 6БАП 5 НУК (1,2:1) РФЭ, геммогенез 8БАП 3 НУК (2,6:1) РФЭ, геммогенез 8БАП 4 НУК (2:1) РФЭ, геммогенез 8БАП 5 НУК (1,6:1) РФЭ, геммогенез Примечание. Прочерк означает отсутствие регенерации у эксплантов, РФЭ - рост флоральных элементов.

Таблица 2 Содержание БАП мкМ в питательных средах на этапе 1 Содержание БАП мкМ в питательных средах этапа 2 5 7,5 10 20 4 гибель экспланта гибель экспланта гибель экспланта активный гемогенез 6 гибель экспланта гибель экспланта гибель экспланта активный гемогенез 8 гибель экспланта гибель экспланта гибель экспланта активный гемогенез 1 гибель экспланта гибель экспланта гибель экспланта гибель экспланта Зависимость формирования вегетативных побегов из вторичных эксплантов от содержания БАП в питательной среде

Похожие патенты RU2481766C1

название год авторы номер документа
СПОСОБ МИКРОКЛОНАЛЬНОГО РАЗМНОЖЕНИЯ ИРИСА СИБИРСКОГО (I.SIBIRICA L.) 2011
  • Тихомирова Людмила Ивановна
  • Смирнов Сергей Владимирович
  • Куцев Максим Геннадьевич
RU2479992C1
Способ получения растительного сырья ириса сибирского (Iris sibirica L.) методами биотехнологии 2017
  • Тихомирова Людмила Ивановна
  • Базарнова Наталья Григорьевна
  • Ильичева Татьяна Ивановна
RU2677921C1
СПОСОБ ПОВЫШЕНИЯ КОЭФФИЦИЕНТА РАЗМНОЖЕНИЯ КАПУСТЫ БЕЛОКОЧАННОЙ В УСЛОВИЯХ IN VITRO 2013
  • Поляков Алексей Васильевич
  • Бекузарова Сарра Абрамовна
  • Котаева Мария Алановна
RU2538163C1
Способ клонального микроразмножения гибридов карельской березы 1990
  • Байбурина Римма Кашаповна
  • Старова Наталья Владимировна
  • Ермаков Владимир Иванович
SU1752284A1
СПОСОБ РАЗМНОЖЕНИЯ КОПЕЕЧНИКА ЧАЙНОГО (HEDYSARUM THEINUM KRASNOB.) 2013
  • Тихомирова Людмила Ивановна
RU2547593C2
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РАСТЕНИЙ-РЕГЕНЕРАНТОВ ЗЕМЛЯНИКИ (IN VITRO) 2012
  • Тихомирова Людмила Ивановна
RU2516341C2
Способ получения лекарственного растительного сырья с противовирусной активностью 2022
  • Тихомирова Людмила Ивановна
  • Щербакова Людмила Владимировна
  • Дыбалев Владислав
RU2817069C1
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЛЕКАРСТВЕННОГО РАСТИТЕЛЬНОГО СЫРЬЯ ЛАПЧАТКИ БЕЛОЙ (Potentilla alba L.) В УСЛОВИЯХ ГИДРОПОНИКИ 2014
  • Базарнова Наталья Григорьевна
  • Тихомирова Людмила Ивановна
RU2570623C1
Способ выращивания растительного сырья ириса сибирского (Iris sibirica L.) с заданным содержанием экстрактивных веществ 2021
  • Тихомирова Людмила Ивановна
  • Карпицкий Дмитрий Алексеевич
RU2773523C1
СПОСОБ КЛОНАЛЬНОГО МИКРОРАЗМНОЖЕНИЯ СЕЛЕКЦИОННОГО ПОСАДОЧНОГО МАТЕРИАЛА БЕРЕЗЫ КАРЕЛЬСКОЙ 1994
  • Ветчинникова Л.В.
  • Николаева Н.Н.
  • Бумагина З.Д.
RU2066953C1

Иллюстрации к изобретению RU 2 481 766 C1

Реферат патента 2013 года СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РАСТЕНИЙ-РЕГЕНЕРАНТОВ ИРИСА МЕЧЕВИДНОГО (I. ENSATA THUNB.) IN VITRO

Изобретение относится к способу получения растений-регенерантов ириса мечевидного (I.ensata Thunb.) in vitro. Способ включает стерилизацию бутонов при условии, что бутоны, смоченные в 96%-ном этиловом спирте, обжигают в пламени спиртовки, обеззараживают в 0,1%-ном растворе сульфохлорантина в течение 20 минут, затем части трубки околоцветника делят на фрагменты 3×3 мм и высаживают на питательную среду Мурасиге-Скуга, содержащую 3-5 мкМ НУК в сочетании с 4-8 мкМ БАП. Затем культивируют и укореняют. При этом через 30 суток культивирования образовавшиеся зачатки побегов с флоральными элементами пересаживают на питательные среды с БАП 20 мкМ и через 30 суток культивирования побеги укореняют на среде Мурасиге-Скуга с НУК 3 мкМ. Изобретение позволяет получать растения-регенеранты прямым методом, минуя каллусную культуру, с высоким процентом укоренения. 3 ил., 2 табл.

Формула изобретения RU 2 481 766 C1

Способ получения растений-регенерантов ириса мечевидного (I.ensata Thunb.) in vitro, включающий стерилизацию бутонов, заключающийся в том, что бутоны, смоченные в 96%-ном этиловом спирте, обжигают в пламени спиртовки, обеззараживают в 0,1%-ном растворе сульфохлорантина в течение 20 минут, затем части трубки околоцветника делят на фрагменты 3×3 мм и высаживают на питательную среду Мурасиге-Скуга, содержащую 3-5 мкМ НУК в сочетании с 4-8 мкМ БАП, затем культивируют и укореняют, отличающийся тем, что через 30 суток культивирования образовавшиеся зачатки побегов с флоральными элементами пересаживают на питательные среды с БАП 20 мкМ и через 30 суток культивирования побеги укореняют на среде Мурасиге-Скуга с НУК 3 мкМ.

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 2013 года RU2481766C1

ТИХОМИРОВА Л.И
Особенности индукции морфогенеза из различных фрагментов цветка ириса в культуре in vitro, Turczaninoia, 2010, 13(3), с.147-151
KAWASE К
et.al
Shoot formation on floral organs of Japanese iris in vitro J
Japan
Soc
Hort
Sci
Нефтяной конвертер 1922
  • Кондратов Н.В.
SU64A1
Топка с качающимися колосниковыми элементами 1921
  • Фюнер М.И.
SU1995A1
ТИХОМИРОВА Л.И
Получение растений-регенерантов ириса из изолированных зародышей

RU 2 481 766 C1

Авторы

Тихомирова Людмила Ивановна

Смирнов Сергей Владимирович

Куцев Максим Геннадьевич

Даты

2013-05-20Публикация

2011-10-25Подача